一种动态交联的纳米精油抗菌乳液及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种动态交联的纳米精油抗菌乳液及其制备方法和应用 (Dynamically crosslinked nano essential oil antibacterial emulsion and preparation method and application thereof ) 是由 朱东雨 肖玮 李秋怡 王洁烽 蓝明辉 王铮泽 陈海松 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种动态交联的纳米精油抗菌乳液及其制备方法和应用。本发明提供的动态交联纳米精油抗菌乳液中,以具有抗菌特性的β-环糊精改性的环氧丙基季铵盐作为表面活性剂,以金刚烷为封端的分子作为交联剂；β-环糊精与金刚烷能形成稳定的络合物,因此交联剂与表面活性剂形成三维网络状分子结构,并且还能和环氧丙基季铵盐的长链形成客体竞争的特点,实现降低长链被包裹的概率,增强分子稳定性；同时表面活性剂一端的β-环糊精可与抑菌精油络合,从而实现动态释放精油的目的。本发明制备得到的纳米精油抗菌乳液不仅具有良好的稳定性,同时抑菌效果突出,还在一定程度上能实现抑菌精油的有效缓释,能够广泛应用于食品或日化品等领域。(The invention provides a dynamic cross-linked nano essential oil antibacterial emulsion and a preparation method and application thereof. In the dynamic crosslinking nano essential oil antibacterial emulsion provided by the invention, beta-cyclodextrin modified epoxy propyl quaternary ammonium salt with antibacterial property is used as a surfactant, and adamantane is used as a terminated molecule as a crosslinking agent; the beta-cyclodextrin and the adamantane can form a stable complex, so that the cross-linking agent and the surfactant form a three-dimensional network molecular structure, and can also form guest competition with the long chain of the glycidyl quaternary ammonium salt, thereby realizing the purposes of reducing the probability of wrapping the long chain and enhancing the molecular stability; meanwhile, the beta-cyclodextrin at one end of the surfactant can be complexed with the bacteriostatic essential oil, so that the aim of dynamically releasing the essential oil is fulfilled. The nano essential oil antibacterial emulsion prepared by the invention has good stability and outstanding antibacterial effect, can realize effective slow release of antibacterial essential oil to a certain extent, and can be widely applied to the fields of food or daily chemicals and the like.)
技术领域
本发明属于抗菌剂制备技术领域，具体涉及一种动态交联的纳米精油抗菌乳液及其制备方法和应用。
背景技术
植物精油在单独使用过程中存在难溶于水、挥发度高、稳定性差等缺点，利用纳米乳技术可以提高精油的水溶性，稳定性，达到延长精油乳液的作用时效，扩大其使用范围。目前，纳米乳技术由于具有低成本以及易制备的优点，广泛用于改善精油的作用效果。通过构建植物精油纳米乳液可以增加活性物质的物理稳定性，包埋后有缓释作用，较少精油的挥发损失，最大化保留精油的有效成分；同时减少精油的用量，不仅降低成本，而且能够最小化精油对感官特性的不利影响。
现有技术中，在制备纳米乳液时通常需要添加一些乳化剂以维持乳液的稳定，在食品和药物乳液的制造中，经常使用的合成乳化剂有小分子表面活性剂如Tween 80等，经常使用的天然乳化剂有磷脂、蛋白质和多糖等。这些乳化剂通常不具有抑菌性能，无法与抑菌精油形成协同作用。很多学者尝试将乳化剂复配制备成精油纳米乳液，多元乳化剂体系赋予乳液更多的功能，如稳定性、释放性、抗菌性能等的变化。侯克洪(羟丙基-β-环糊精/植物精油基的抗菌乳液和抗菌膜的制备及表征，南京财经大学硕士学位论文，侯克洪，2020)研究了不同浓度和比例的Tween 80和羟丙基-β-环糊精对肉桂精油纳米乳液粒径、抗菌活性、稳定性及精油释放性能的影响，虽然能在一定程度上提高乳液的稳定性；但需要羟丙基-β-环糊精与常规表面活性剂共同使用才能维持乳液稳定，且不能实现精油缓释。
发明内容
针对现有的植物精油纳米抗菌乳液的稳定性较差、抑菌性能不能有效提高、不能实现有效缓释，本发明的目的在于提供一种动态交联的纳米精油抗菌乳液。该纳米精油抗菌乳液包括特定的表面活性剂和交联剂，不仅可以有效增加抗菌精油乳液的抑菌性能，还能够实现纳米精油的动态释放。
本发明的另一目的在于提供一种上述纳米精油抗菌乳液的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述纳米精油抗菌乳液在食品和日化用品中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种动态交联的纳米精油抗菌乳液，其特征在于，该纳米精油抗菌乳液包括水、抑菌精油、表面活性剂和交联剂；
其中，所述纳米精油抗菌乳液中水、抑菌精油和表面活性剂的质量比为100:0.5～3:0.2～2；交联剂和表面活性剂的摩尔比为1:3～6；
其中，表面活性剂为β-环糊精改性的环氧丙基季铵盐；交联剂为以金刚烷为封端的分子，其结构式如下：
式中，n＝400-1000，n为正整数。
现有技术表明环氧丙基季铵盐具有优良的抗菌特性以及表面活性，并且β-环糊精修饰后的环氧丙基季铵盐也具有表面活性。但改性后的环氧丙基季铵盐的疏水链较长，易发生包结作用，难以发挥其表面活性。故本发明利用β-环糊精与金刚烷能形成稳定的络合物的特点，以金刚烷为封端的客体分子作为交联剂，与β-环糊精衍生物形成三维网络状分子结构，并且还能和环氧丙基季铵盐长链形成客体竞争的特点，实现降低长链被包裹的概率，增强分子稳定性；与此同时表面活性剂一端的β-环糊精可与抑菌精油络合，从而实现动态释放精油的目的，延长精油作用时效。
另外，利用环氧丙基季铵盐型表面活性剂具有抑菌功能特性，使之与抑菌精油复配使用时可以增强精油的抑菌效果，以此实现扩大精油应用领域的目标。
本发明通过制备得到具有抗菌特性的表面活性剂，能与抗菌精油形成协同作用，提高精油的抑菌效果；与此同时，还利用β-环糊精空腔与交联剂进行络合，使制备得到的纳米精油抗菌乳液具有良好的稳定性的同时抑菌效果突出，还在一定程度上能实现有效抑菌精油的缓释，能够广泛应用于食品或日化品等领域。
优选地，所述抑菌精油为肉桂精油或牛至精油中的至少一种。
优选地，所述环氧丙基季铵盐为N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵。
优选地，所述纳米精油抗菌乳液的粒径为100-800nm。
优选地，所述纳米精油抗菌乳液中水、抑菌精油和表面活性剂的质量比为100:1～2:0.5～1。
进一步优选地，所述纳米精油抗菌乳液中水、抑菌精油和表面活性剂的质量比为100:1:0.5。
优选地，所述纳米精油抗菌乳液中交联剂和表面活性剂的摩尔比为1:4～5。
进一步优选地，所述纳米精油抗菌乳液中交联剂和表面活性剂的摩尔比为1:5。
优选地，所述表面活性剂的制备方法包括以下步骤：
在碱液中，加入β-环糊精和环氧丙基季铵盐，55～70℃下反应18～24h，旋蒸、萃取、柱层析、干燥，即得所述表面活性剂；
其中，所述环氧丙基季铵盐与β-环糊精的摩尔比为1～2:1。
进一步优选地，所述环氧丙基季铵盐与β-环糊精的摩尔比为1.2:1。
进一步优选地，所述碱液为NaOH溶液。
优选地，所述环氧丙基季铵盐的制备方法包括以下步骤：
将长链烷基叔胺与环氧氯丙烷混合，于60～70℃条件下反应2～3h，反应结束后，重结晶3～4次，随后40～60℃干燥，得到环氧丙基季铵盐。
进一步优选地，所述长链烷基叔胺为十二烷基叔胺、十四烷基叔胺或十六烷基叔胺。
进一步优选地，所述长链烷基叔胺为十二烷基叔胺。
进一步优选地，所述长链烷基叔胺与环氧氯丙烷的体积比为1～1.5:1。
优选地，所述交联剂的制备方法包括以下步骤：
S1：将金刚烷甲酸和氯化亚砜在60～90℃下反应并进行冷凝回流2～4h，反应结束后加入二氯甲烷进行旋蒸，真空干燥，制备得到金刚烷酰氯；
S2：将PEG、三乙胺和金刚烷酰氯溶解在二氯甲烷后反应、提纯、干燥，即得所述交联剂。
进一步优选地，S1中所述金刚烷甲酸、氯化亚砜的摩尔比为1:2～1:5；S2中所述金刚烷酰氯、PEG和三乙胺的摩尔比为5～10:1～2:5～15。
本发明还提供上述纳米精油抗菌乳液的制备方法，包括以下步骤：将水、抑菌精油、表面活性剂和交联剂混合后，机械搅拌，即得所述纳米精油抗菌乳液。
上述纳米精油抗菌乳液在食品或日化用品中的应用也在本发明的保护范围内。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种动态交联的纳米精油抗菌乳液，以β-环糊精修饰的环氧丙基季铵盐作为表面活性剂，以金刚烷为封端的分子作为交联剂；β-环糊精与金刚烷能形成稳定的络合物，因此交联剂与表面活性剂形成动态交联的三维网络状分子结构，并且还能和环氧丙基季铵盐的长链形成客体竞争的特点，实现降低长链被包裹的概率，增强分子稳定性；同时表面活性剂一端的β-环糊精基团可与精油络合，从而实现动态释放精油的目的。制备得到的纳米精油抗菌乳液不仅具有良好的稳定性，同时抑菌效果突出，还在一定程度上能实现有效缓释，能够广泛应用于食品和日化品等领域。
附图说明
图1为实施例1中制备的N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵的红外图；
图2为实施例1制备的表面活性剂的红外图；
图3为实施例1制备的交联剂Ad-PEG-Ad的核磁谱图；
图4为实施例1和实施例3～4制备的纳米精油抗菌乳液室温储存1～5天后的稳定性情况图；
图5为实施例1、实施例5～6及对比例1中制备的纳米精油抗菌乳液室温储存1～5天后的稳定性情况图；
图6为实施例1、实施例7～8及对比例2中制备的纳米精油抗菌乳液室温储存1～5天后的稳定性情况图；
图7为实施例1和对比例2中制备的抗菌乳液室温储存5天后的粒径分布图；
图8为实施例2和对比例3中制备的抗菌乳液室温储存5天后的粒径分布图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。
本发明中实施例和对比例中提供一系列的动态交联的纳米精油抗菌乳液，具体包括以下步骤：
(1)交联剂金刚烷-聚乙二醇-金刚烷(Ad-PEG-Ad)的制备
S1：称取适量的金刚烷甲酸(18g，180.24g/moL)，氯化亚砜(50mL，118.97g/moL)于150mL圆底烧瓶中，75℃下冷凝回流3h。随后，于45℃下旋蒸，除去大部分溶剂，再加入二氯甲烷继续旋蒸，重复3-4次，真空干燥后，得到白色固体，即金刚烷酰氯，其制备反应式如下：
S2:称量适量的PEG(600)于干燥的烧瓶里，再加入适量的三乙胺溶液，并加入适量的二氯甲烷溶解；在冰浴条件下，逐滴加入溶解在二氯甲烷的金刚烷酰氯；滴加结束后，室温下反应24h；
提纯过程为先对溶液进行抽滤，除去三乙胺盐酸盐沉淀，再加入稀盐酸、碳酸氢钠水溶液萃取3-4次，水洗除去残留的碳酸氢钠，之后加入适量的无水硫酸镁，静置过滤，收集浓缩滤液。随后，进行柱层析纯化，展开剂为二氯甲烷；其制备反应式如下：
(2)β-环糊精改性的环氧丙基季铵盐的制备
S1：N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵的制备及纯化
称量15mL十二烷基叔胺(213.4g/moL，0.0137moL)于圆底烧瓶中，称量12mL环氧氯丙烷(92.52g/moL，0.0357moL)于恒压漏斗中。于60℃条件下，缓慢滴加环氧氯丙烷，随后保持60℃，冷凝回流2h，反应方程式如下：
反应结束后，先用丙酮进行重结晶4次(45℃溶解，室温冷却结晶，抽滤)，每次用量为20mL；随后40℃烘箱干燥，得到产物为胶状体，颜色为纯白色。
S2:β-环糊精改性的N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵的制备及纯化
在50mL 3wt％NaOH溶液中，加入适量的β环糊精，并于室温条件下搅拌1h。随后于65℃时，将N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵(溶于20mL异丙醇溶液)缓慢滴加入上述体系中，冷凝回流24h；其中，N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵与β环糊精的摩尔比为1.2:1，其反应方程式如下：
提纯过程为42℃下，旋蒸浓缩反应液，随后采用氯仿进行多次萃取，最后进行柱层析，展开剂体系为异丙醇：水：氨水＝5:1:3，40℃烘箱干燥。
(3)纳米精油抗菌乳液的制备
以肉桂精油和牛至精油为油相，上述制备得到的β-环糊精改性的N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵作为表面活性剂，Ad-PEG(600)-Ad为交联剂，去离子水为水相，混合后将混合液于高速匀浆机中振荡6min，转速设置为8000r/min。振荡结束后，于室温下储存，观察结果。其中，各组分参数用量如表1。
表1实施例和对比例中各组分用量参数
需要说明的是，上述实施例和对比例中，除实施例2和对比例3中所用抑菌精油为牛至精油外，其余均为肉桂精油。
性能测试
针对实施例1和对比例2中制备的抗菌乳液进行抑菌性能及粒径分布测定。
(1)抗菌乳液的MIC值的测定
采用微量肉汤稀释法研究乳液的MIC值，以此来判定乳液的抗菌性能，其中菌种以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌为例进行研究。
S1菌液的制备：首先，使用四区划线方法复苏细菌，并将其接种到营养琼脂平板上；在37℃下培养24小时后，选择可以分离出单个菌落的细菌，并将其接种到LB肉汤中，随后于37℃下，摇床培养24h。
其次，进行定量调配细菌液。先将LB肉汤培养好的菌液进行离心分离，后换液换为MH肉汤，用酶标法测菌液的稀释倍数，再用MH肉汤稀释至1.5×108CFU/mL后待用。
S2抗菌乳液的制备：采用实施例1～2和对比例2～3中制备的抗菌乳液，其中水相采用无菌水，最终制备成的乳液采用0.22μm的滤头进行过滤除菌。
S3 MIC的测定：采用微量稀释法，于96孔板的每个孔中加入培养基100μL，在前3列的第1个孔加入实施例1中所制备的抗菌乳液400μL，然后对乳液进行2倍稀释。第1个孔加入乳液后用移液枪充分吹打(至少3次以上)使乳液与培养基充分混合，然后100μL加入第2个孔，再充分吹打，照此重复至最后1个孔，第7行吸出100μL弃去，随后，往前3列的每个孔中加入已稀释好的菌液100μL。
在同一96孔板的第4-6列加入对比例2中所制备的抗菌乳液，实验操作同上。
其中，第1～7个孔中抗菌乳液的质量含量分别为80wt.％、40wt.％、20wt.％、10wt.％、5wt.％、2.5wt.％、1.25wt.％。
与此同时，在同一块板上的第7列上做1列阳性对照(100μL培养基+100μL菌液)，在同一块板的第8列上做1列阴性对照组(仅有100μL培养基)。
最后将96孔板密封后，放入37℃恒温培养箱中，培养16-20h后，放入酶标仪中进行OD 620nm值的测定。
实施例2和对比例3的MIC值测定方法同上。
S4稀释平板计数：为进一步探究上述确定的MIC值的实际抑菌效果，验证MIC值的可靠性，对96孔板上对应2MIC、MIC以及0.5MIC的混合液进行细菌计数。
取96孔板上对应2MIC、MIC以及0.5MIC的混合液各100μL，用灭菌PBS进行105倍稀释，取100μL稀释液至无菌培养皿中，再倾注温度适宜(约46-50℃)的培养基，待其冷却后倒置在培养箱中，培养24h，观察细菌生长情况，并进行细菌计数。
(2)纳米精油抗菌乳液粒径测定
实施例1和对比例2中的样品乳液为已放置5天，外观仍为均一的乳液。
实验设备为布鲁克海文粒度分析仪，测量时间为5min，测试次数为5次，测试温度为25℃，测试角度为90°，测试波长为660.0nm。
结果分析
(1)合成物质分析
从图1中N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵的红外谱图可知，998.32cm-1、949.19cm-1、903.61cm-1处分别为环氧基团的3个特征峰，720.75cm-1为亚甲基长链，即该物质含有4个以上的亚甲基相连，并且该峰的透过率为75％。由于该物质亲水性较强，即含有较多的结合水，故3358.91cm-1为水的羟基峰。2922.04cm-1、2852.72cm-1以及1466.94cm-1为-CH2-的弯曲振动峰；1377.37cm-1为甲基的特征峰；而1639.12cm-1处的峰为-C-N-的骨架。因此，说明制备得到的物质为N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵。
从图2中表面活性剂的红外谱图可知，在1032.65cm-1处的峰为β-环糊精上糖苷键的红外吸收峰，在1652.81cm-1处为季铵盐的氮与碳的骨架特征峰。此外，甲基以及亚甲基的特征峰也在图中有所显示。因此，说明制备得到的物质为β-环糊精改性的N,N-3-二甲基-1-环氧丙基-十二烷基铵。
从图3中交联剂Ad-PEG-Ad的核磁谱图可知，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.17–4.10(m,4H),3.58(s,48H),1.96(d,J＝17.0Hz,14H),1.85(dd,J＝18.3,2.7Hz,28H),1.66(d,J＝9.3Hz,28H)。图3在4.50ppm处无特征峰，而在4.13ppm左右，有特征峰出现，对应为-CH2CO-的特征峰，说明PEG的羟基端完全参与反应。此外，金刚烷的3个特征峰以及PEG长链上的特征峰都仍然存在于核磁图中，并且各自的氢个数比例与其结构符合，说明合成的物质中存在目标产物Ad-PEG-Ad。
(2)纳米精油抗菌乳液的稳定性
从图4中可以看出，在室温条件下，实施例1中，当肉桂精油与水相的质量比为5:495时，乳液可以稳定放置5天，而当肉桂精油与水相的质量比为10:490以及15:485时，乳液放置1天后便已经出现肉桂精油析出的情况。因此，相比较而言，肉桂精油与水相的质量比为5:495时，乳液稳定性较好。
从图5中可知，当肉桂精油与水相的质量比为5:495时，表面活性剂在体系中的固含量为0.5wt.％时，乳液可以稳定放置5天，而为1wt.％以及0.25wt.％时，放置1天后便有精油析出，稳定性差。此外，对比例1中的抗菌乳液放置3天后，便有大量精油析出，漂浮在水面上。
从图6中可以看到，在室温条件下，以肉桂精油与去离子水的质量比为5:495，表面活性剂固含量为0.5wt.％，交联剂与表面活性剂的摩尔比为1:5所制备的乳液可以稳定保存5天。当交联剂与表面活性剂的摩尔比为1:3以及1:4时，乳液的稳定性远不如交联剂与表面活性剂的摩尔比为1:5的肉桂精油乳液。
(3)纳米精油抗菌乳液的抑菌性能
表2～5分别为实施例1～2及对比例2～3中所制备的抗菌乳液在不同稀释浓度的吸光度平均值以及抑菌率。
表2实施例1中抗菌乳液不同稀释浓度的吸光度平均值以及抑菌率
表3对比例2中抗菌乳液不同稀释浓度的吸光度平均值以及抑菌率
表4实施例2中抗菌乳液不同稀释浓度的吸光度平均值以及抑菌率
表5对比例3中抗菌乳液不同稀释浓度的吸光度平均值以及抑菌率
通过表2和表3中数据对比可以发现，在纳米肉桂精油抗菌乳液体系中，当乳液占有率仅为1.25wt.％时，抑菌率可达70％；而对应对比例2中同等稀释浓度下，不含交联剂的乳液体系抑菌率仅为25.9478％。结合表4～5中牛至精油的数据，说明含有交联剂时，精油乳液的抑菌性能优于不含交联剂的精油乳液。
(4)纳米精油抗菌乳液粒径
从表6及图7～8中可知，4种乳液的粒径大小都符合正态分布，且都为纳米乳。牛至精油乳液体系的平均粒径大于肉桂精油乳液体系。此外，含有交联剂的肉桂精油乳液的平均粒径(实施例1)小于不含交联剂的肉桂精油乳液的平均粒径(对比例2)；含有交联剂的牛至精油乳液的平均粒径(实施例2)小于不含交联剂的牛至精油乳液的平均粒径(对比例3)。
表6实施例1及对比例2中抗菌乳液的粒径大小
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
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