具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1重组STb表达载体的构建以及重组蛋白质的表达和纯化

1、基因的克隆及重组载体的构建

本发明利用GenBank数据库中STb蛋白质的编码序列(M35729.1)，获得了编码STb成熟肽的核苷酸片段。将STb以2倍串联的形式与组氨酸(His)标签进行融合表达，两段STb序列间加入Linker(连接肽段—GGGGS)以稳定STb蛋白质的结构，获得重组STb蛋白质的序列，所述重组STb蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。对重组蛋白质的密码子序列进行优化，所述优化后的重组STb蛋白质的编码序列如SEQIDNO.1所示，并将优化后的重组STb蛋白质的编码序列送上海捷瑞生物工程有限公司合成。

使用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ分别对合成的重组STb蛋白质的编码序列以及表达载体PET-32α进行双酶切，并用T4连接酶进行连接，连接体系如表1所示，16℃条件下连接16h。

表1 T4连接酶连接体系

将连接产物转入大肠杆菌DH5α克隆感受态细胞，挑取单克隆，并通过PCR鉴定其是否为阳性转化子，具体步骤为：

a.取10μL连接产物与50μL DH5α感受态细胞在冰上混匀，静置30min；

b.42℃水浴90s，冰上静置3min；

c.加入500mL的LB液体培养基，于37℃，200r/min条件下振荡培养1h；

d.3000r/min，离心2min，弃上清，余20μL左右吹打均匀后涂板(使用含氨苄抗性的LB固体平板)；

e.平板倒放于37℃培养箱内培养，挑取单克隆，通过PCR初步鉴定后，将具有大小与预期相符的单一条带的单克隆送公司测序，保种测序正确的质粒。

重组STb阳性克隆的鉴定结果如图1所示，其中图1A为阳性克隆的PCR检测结果，图1B为阳性克隆的测序比对结果。由图1A可知，出现了大小与预期相符的单一条带，将对应的阳性克隆送公司测序，测序比对结果(图1B)表明成功构建了重组STb表达载体。

2、重组蛋白质的诱导表达

培养及诱导条件的筛选

将保种的重组STb表达载体重新转化到BL21、C43 pLysS和Rosetta三种不同的工程菌的感受态细胞内(表达感受态细胞的筛选方法同步骤如a-d)，分别挑取三种工程菌的单菌落于携带氨苄抗性的LB液体培养基培养至浑浊并保种。

分别吸取1mL三种工程菌的菌液接种于500mL LB液体培养基中，分别以温度15、25、30和37℃(温度的筛选)及转速150、180和200r/min(转速的筛选)培养至OD值大约为0.6～0.8，加入IPTG至终浓度分别为0.5、0.8、1和2mmol/L(诱导剂IPTG浓度的筛选)，继续培养4或8个小时(诱导时间的筛选)。经IPTG诱导后，用His标签抗体纯化重组STb-BL21、C43pLysS和Rosetta菌中的重组STb蛋白质。

经过培养温度、培养转速、IPTG浓度及培养时间的筛选后，发现使用Rosetta菌，在25℃、150r/min培养条件下，以浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养8小时后的表达效果最佳。将在最佳条件下诱导表达的STb-Rosetta菌经过离心和破碎，用考马斯蓝检测Rosetta菌中重组STb蛋白质的诱表达效果，以及重组STb蛋白质在上清及沉淀中的表达效果，结果如图2所示。其中图2A为重组STb-Rosetta菌经IPTG诱导前后STb蛋白质表达效果的电泳图(“-”为诱导前，“+”为诱导后)，由图可知，诱导后的蛋白质表达量有所提高。图2B为重组STb-Rosetta菌经IPTG诱导后的上清和沉淀中STb蛋白质表达效果的电泳图，出现了大小与预期相符的蛋白质条带，但沉淀中的重组STb蛋白质的量更高。图2C为利用His标签抗体鉴定重组STb-Rosetta菌经IPTG诱导前后STb蛋白质的鉴定结果，诱导后蛋白质的表达量有所提高。图2D为利用His标签抗体鉴定重组STb-Rosetta菌经IPTG诱导后的上清和沉淀中的STb蛋白质的鉴定结果，沉淀中的STb蛋白质的量高于上清，故后续提取沉淀中的重组STb蛋白质用于构建模型。

用PBS缓冲液重悬STb-Rosetta菌，再经沉淀、离心、弃上清，留沉淀(重复两次)；提取沉淀中的蛋白质，用碧云天生物技术公司的His标签纯化试剂盒(货号：P2226，耐还原螯合型)对蛋白质进行纯化，纯化后的蛋白质经过透析后，通过SDS-PAGE电泳分析重组STb蛋白质的表达情况。

图3为诱导纯化后的重组STb蛋白质的检测结果，其中图3A为利用考马斯蓝的鉴定结果；图3B为利用His标签抗体的鉴定结果。结果表明，本发明成功构建了重组STb蛋白质的制备方法，且重组STb蛋白质的表达纯化效果好。

实施例2重组RFP-STb表达载体的构建以及重组蛋白质的表达和纯化

根据实施例1中设计的重组STb序列，使用点突变试剂盒(Mut ExpressⅡFastMutagenesisi Kit V2)将RFP标签基因(DsRed2)嵌入重组STb序列末端，TAA终止子的前方，编码重组RFP-STb蛋白质的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，重组RFP-STb的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。具体操作为：先分别扩增重组STb和RFP的目的片段，将扩增产物用DpnⅠ消化，再将两种消化产物进行重组连接。目的片段的扩增体系如表2所示，消化体系如表3所示，连接体系如表4所示；消化和连接参照所使用的试剂盒说明书进行。

PCR扩增目的片段所用引物如下所示：

重组STb F：tggttgctgctaaaggttgcATGGCCTCCTCCGAGAACG

重组STb R：cgacggagctcgaattcttaCTACAGGAACAGGTGGTGGCG

其中，小写部分与RFP序列匹配，大写部分与重组质粒序列匹配。

RFP F：TAAGAATTCGAGCTCCGTCGA

RFP R：GCAACCTTTAGCAGCAACCATG

表2RFP和STb目的片段的扩增体系

重组STb目的片段的扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共计30个循环；72℃再彻底延伸5min。

RFP目的片段的扩增反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸50s，共计30个循环；72℃再彻底延伸5min；RFP片段的扩增结果如图4A所示。

表3 扩增产物的消化

表4 RFP和STb目的片段的连接

将实施例1中保种的菌液扩繁，提取重组STb表达载体并经电泳检测，结果如图4B所示，大小与预期相符。采用与实施例1中相同的方法，将重组连接的RFP-STb目的片段插入表达载体，连接产物转入大肠杆菌DH5α克隆感受态细胞，挑取单克隆，并通过PCR鉴定其是否为阳性转化子，结果分别如图4C和D所示。其中图4C为单克隆中RFP-STb目的片段的电泳检测结果，以STb片段为基准(红色框区域)，高于STb且大小在1000bp左右的(白色框区域)都有可能是RFP-STb连接成功的阳性克隆，将与之对应的单菌落送公司进行测序验证。测序比对结果如图4D所示，表明成功构建了重组RFP-STb表达载体。

重组RFP-STb表达载体的转化及重组RFP-STb蛋白质的诱导表达及纯化同实施例1，重组RFP-STb的纯化除使用His标签抗体外，还可使用RFP抗体。重组RFP-STb蛋白质的纯化结果如图5所示，其中图5A为His标签抗体及RPF抗体纯化后蛋白质的WB检测结果，图5B为蛋白质marker鉴定RFP-STb蛋白质的目的位点，结果表明成功获得了重组RFP-STb蛋白质。

实施例3肠道损伤模型的构建

本实施例以重组STb蛋白质为例构建肠道损伤模型。

1、分组准备

选取体重相近的4周龄C57BL/6雄性健康小鼠共24只，随机分为3个组：分别为CON组、Rosetta组(Rosetta菌纯化出的蛋白质)和STb组(STb-Rosetta菌纯化出的重组STb蛋白质)，实验分组及处理方法如表5所示，每个组8个重复，每个重复1只小鼠。

表5 实验分组及处理方法

备注：CFU为菌的个数。

2、实验过程

攻毒前：共3天，每天早上8:00给小鼠灌胃0.2mL PBS(每只小鼠灌胃前均用PBS润洗灌胃针)；

攻毒期：共7天，CON组灌胃0.2mL PBS；Rosetta组灌喂0.2mL 2×10⁹CFU Rosetta菌纯化、浓缩的蛋白质；STb组灌喂0.2mL 2×10⁹CFU STb-Rosetta菌纯化、浓缩的重组STb蛋白质。

攻毒后：攻毒结束后(即正式期第11d)采样。

3、测定指标及方法

统计实验小鼠的采食量、饮水量及体重，计算小鼠的平均日增重和平均日采食量，称量小鼠单位长度空肠重量，利用Ussing Chamber检测小鼠肠道跨膜电阻值(Transepithelial electrical resistance，TEER)。

4、实验结果

重组STb蛋白质对小鼠生长性能的影响结果如图6所示。其中，图6A为小鼠攻毒试验流程图：CON组灌胃0.2mL PBS；Rosetta组灌喂0.2mL 2×10⁹CFU Rosetta菌纯化、浓缩的蛋白质；STb组灌喂0.2mL 2×10⁹CFU STb-Rosetta菌纯化、浓缩的重组STb蛋白质，共灌喂7天。图6B为STb-Rosetta菌及裂解液对小鼠平均日增重的影响结果图，由图可知，与CON组相比，Rosetta组不能降低小鼠平均日增重，而STb组能够显著降低小鼠平均日增重(P<0.05)，表明本发明制备所得重组STb蛋白质具有活性，能够造成小鼠体增重下降；图6C为STb蛋白质对小鼠单位长度肠重的影响结果，与CON组相比，Rosetta组不能降低小鼠空肠单位长度肠重，而STb组能够显著降低小鼠空肠单位长度肠重(P<0.05)，表明重组STb蛋白质具有毒性作用，能够造成小鼠小道损伤；图6D为STb蛋白质对小鼠空肠TEER(跨膜电阻值)的影响结果，与CON组相比，Rosetta组不能降低小鼠空肠TEER(跨膜电阻值)，而STb组能够显著降低小鼠空肠TEER(P<0.05)，表明重组STb蛋白质对于小鼠空肠屏障功能的破坏作用。

上述结果表明，采用本发明所述重组STb蛋白质，可成功构建STb蛋白质引起的哺乳动物的肠道损伤模型。

实施例4肠道类肠团损伤模型的构建

选取C57BL/6雄性健康小鼠空肠组织，提取隐窝进行培养，将培养好的肠道类肠团，通过显微注射技术将实施例2诱导表达所得重组RFP-STb注入类肠团中，显微镜下观察类肠团生长情况及形态结构。

结果如7所示，其中图7A为显微注射仪器，图7B为构建的肠道类肠团损伤模型在0h和12h的效果图。由图7B可知，重组RFP-STb蛋白质注入类肠团培养12h后，其抑制了肠道类肠团生长，与重组STb蛋白质的效果相同。本发明通过将重组RFP-STb蛋白质显微注射进入类肠团中，使得类肠团RFP-STb蛋白质的部位含有红色荧光，且重组RFP-STb蛋白质发出的光穿透性极强，具有示踪作用，便于微观地观察STb蛋白质与类肠团的互作，可通过荧光探针技术进行蛋白质定位和互作的研究，为解析STb与活细胞微观互作的创造了机会，更可以为生命科学基础研究提供了更为完善和系统的标记工具。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种重组STb蛋白质及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His His His His His Gly Thr Ser Thr Gln Ser Asn Lys Lys Asp Leu

1 5 10 15

Cys Glu His Tyr Arg Gln Ile Ala Lys Glu Ser Cys Lys Lys Gly Phe

20 25 30

Leu Gly Val Arg Asp Gly Thr Ala Gly Ala Cys Phe Gly Ala Gln Ile

35 40 45

Met Val Ala Ala Lys Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr Gln Ser

50 55 60

Asn Lys Lys Asp Leu Cys Glu His Tyr Arg Gln Ile Ala Lys Glu Ser

65 70 75 80

Cys Lys Lys Gly Phe Leu Gly Val Arg Asp Gly Thr Ala Gly Ala Cys

85 90 95

Phe Gly Ala Gln Ile Met Val Ala Ala Lys Gly Cys Glu Phe Glu Leu

100 105 110

Arg Arg Gln Ala Cys

115

<210> 2

<211> 342

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

His His His His His Gly Thr Ser Thr Gln Ser Asn Lys Lys Asp Leu

1 5 10 15

Cys Glu His Tyr Arg Gln Ile Ala Lys Glu Ser Cys Lys Lys Gly Phe

20 25 30

Leu Gly Val Arg Asp Gly Thr Ala Gly Ala Cys Phe Gly Ala Gln Ile

35 40 45

Met Val Ala Ala Lys Gly Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Thr Gln Ser

50 55 60

Asn Lys Lys Asp Leu Cys Glu His Tyr Arg Gln Ile Ala Lys Glu Ser

65 70 75 80

Cys Lys Lys Gly Phe Leu Gly Val Arg Asp Gly Thr Ala Gly Ala Cys

85 90 95

Phe Gly Ala Gln Ile Met Val Ala Ala Lys Gly Cys Met Ala Ser Ser

100 105 110

Glu Asn Val Ile Thr Glu Phe Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu Gly

115 120 125

Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg

130 135 140

Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly

145 150 155 160

Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Gln Tyr Gly

165 170 175

Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Lys Lys

180 185 190

Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu

195 200 205

Asp Gly Gly Val Ala Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly

210 215 220

Cys Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Ile Gly Val Asn Phe Pro Ser Asp

225 230 235 240

Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu

245 250 255

Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu Thr His Lys Ala

260 265 270

Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Leu Val Glu Phe Lys Ser Ile

275 280 285

Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp

290 295 300

Ala Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu

305 310 315 320

Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe Leu Glu Phe Glu

325 330 335

Leu Arg Arg Gln Ala Cys

340

<210> 3

<211> 355

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccaccacc accacggtac ctctacccag tctaacaaaa aagacctgtg cgaacactac 60

cgtcagatcg ctaaagaatc ttgcaaaaaa ggtttcctgg gtgttcgtga cggtactgct 120

ggtgcttgct tcggtgctca gatcatggtt gctgctaaag gttgcggtgg tggtggttct 180

tctacccagt ctaacaaaaa agacctgtgc gaacactacc gtcagatcgc taaagaatct 240

tgcaaaaaag gtttcctggg tgttcgtgac ggtactgctg gtgcttgctt cggtgctcag 300

atcatggttg ctgctaaagg ttgctaagaa ttcgagctcc gtcgacaagc ttgcg 355

<210> 4

<211> 1033

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccaccacc accacggtac ctctacccag tctaacaaaa aagacctgtg cgaacactac 60

cgtcagatcg ctaaagaatc ttgcaaaaaa ggtttcctgg gtgttcgtga cggtactgct 120

ggtgcttgct tcggtgctca gatcatggtt gctgctaaag gttgcggtgg tggtggttct 180

tctacccagt ctaacaaaaa agacctgtgc gaacactacc gtcagatcgc taaagaatct 240

tgcaaaaaag gtttcctggg tgttcgtgac ggtactgctg gtgcttgctt cggtgctcag 300

atcatggttg ctgctaaagg ttgcatggcc tcctccgaga acgtcatcac cgagttcatg 360

cgcttcaagg tgcgcatgga gggcaccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag 420

ggcgagggcc gcccctacga gggccacaac accgtgaagc tgaaggtgac caagggcggc 480

cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc ccccagttcc agtacggctc caaggtgtac 540

gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac aagaagctgt ccttccccga gggcttcaag 600

tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggcga ccgtgaccca ggactcctcc 660

ctgcaggacg gctgcttcat ctacaaggtg aagttcatcg gcgtgaactt cccctccgac 720

ggccccgtga tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct ccaccgagcg cctgtacccc 780

cgcgacggcg tgctgaaggg cgagacccac aaggccctga agctgaagga cggcggccac 840

tacctggtgg agttcaagtc catctacatg gccaagaagc ccgtgcagct gcccggctac 900

tactacgtgg acgccaagct ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggag 960

cagtacgagc gcaccgaggg ccgccaccac ctgttcctgt agtaagaatt cgagctccgt 1020

cgacaagctt gcg 1033