一种大肠杆菌lipid A结合基元PCK及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种大肠杆菌lipid A结合基元PCK及其制备方法与应用 (Escherichia coli lipid A binding motif PCK and preparation method and application thereof ) 是由 王秀敏 戴小枫 李秀梅 刘魏魏 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了与大肠杆菌脂质A特异性结合的多肽及其在抑制革兰氏阴性菌中的应用。该多肽的氨基酸序列为序列表中的SEQIDNo.1。本发明的多肽能够通过与脂质A结合从而特异性抑制革兰氏阴性菌,达到抗革兰氏阴性菌感染的效应,该多肽具有低或无溶血性,在128μg/mL浓度时,其溶血率为0.4％。针对大肠杆菌,本发明的多肽与小檗碱联合用药的FIC指数值为0.34,具有协同抑菌效应,且联合用药时无溶血性和低细胞毒性。本发明的多肽或其药用盐及其衍生物可以作为新的抑菌制剂,尤其可与小檗碱联合用药,可应用于开发抑菌药物。(The invention discloses a polypeptide specifically combined with escherichia coli lipid A and application thereof in inhibiting gram-negative bacteria. The amino acid sequence of the polypeptide is SEQ ID No.1 in a sequence table. The polypeptide of the invention can specifically inhibit gram-negative bacteria by combining with lipid A, thereby achieving the effect of resisting gram-negative bacteria infection, has low or no hemolysis, and has the hemolysis rate of 0.4 percent at the concentration of 128 mu g/mL. Aiming at escherichia coli, the FIC index value of the combined drug of the polypeptide and the berberine is 0.34, the synergistic antibacterial effect is achieved, and hemolysis and low cytotoxicity are avoided when the combined drug is used. The polypeptide or the medicinal salt and the derivative thereof can be used as a novel antibacterial preparation, particularly can be used together with berberine, and can be applied to development of antibacterial drugs.)
技术领域
本发明涉及一种大肠杆菌lipid A结合基元PCK及其制备方法与应用。
背景技术
由革兰氏阴性致病菌引起的畜禽腹泻疾病严重影响了机体的健康，给畜禽养殖业带来了极大的危害。其中，致病性大肠杆菌是人、动物肠道内的主要病原菌之一，能够引起腹泻性疾病。长期不合理使用抗生素导致了细菌出现高耐、多耐、泛耐药性及诱发形成二重感染的问题，至今尚无满意有效的治疗药物，亟待开发新型绿色替抗产品。
大肠杆菌细胞膜是由内膜(即细胞质膜)和外膜组成，磷脂双分子层形成细胞内膜，而外膜是不对称的，单层磷脂形成内表面，脂多糖(LPS)衬在外表面上。LPS可以保护大肠杆菌免受哺乳动物宿主肠道中的抗生素伤害。磷脂与LPS的比例对于膜功能至关重要，LPS过多对细胞内膜有害，过少又会损害外膜。研究发现，大肠杆菌内膜蛋白PbgA是大肠杆菌中为数不多的没有明确功能的必须蛋白质之一，也是LPS的信号转导子，能够结合LPS，并抑制细菌的生长。PbgA衍生片段LAB具有抑制大肠杆菌的活性。搜索资料发现，对于源自大肠杆菌PbgA蛋白lipid A结合基元的合成及细胞毒性的研究未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何开发替代抗生素的药物，以抗感染。
为了解决以上技术问题，本发明提供了多肽或其药用盐。
本发明所提供的多肽或其药用盐中，所述多肽的名称为PCK，其氨基酸序列为序列表中的SEQ ID No.1。
上述多肽的衍生物也属于本发明的保护范围。
上述多肽的衍生物可为d1、d2、d3、d4或d5；
所述d1为在所述多肽的氨基末端连接氨基端保护基和/或在所述多肽的羧基末端连接羧基端保护基得到的连接物；
所述d2为在所述多肽的氨基末端和/或羧基末端添加氨基酸残基得到的化合物；
所述d3为在所述多肽的氨基末端和/或羧基末端连接寡肽得到的化合物；
所述d4为所述多肽被蛋白质、聚乙二醇或马来酰亚胺修饰得到的化合物；
所述d5为在所述多肽的氨基末端和/或羧基末端连接亲脂性化合物得到的化合物。
下述PM1或PM2的多聚体也属于本发明的保护范围：
PM1、由所述多肽或其药用盐形成的多聚体；
PM2、由所述衍生物形成的多聚体。
上述多肽、其药用盐、或其衍生物中，所述多肽的序列中的每三个字母均为氨基酸的缩写，氨基酸的缩写具有本领域公知的含义，例如：Ser为丝氨酸，Tyr为酪氨酸，Pro为脯氨酸，Met为蛋氨酸，Ala为丙氨酸，Arg为精氨酸，Phe为苯丙氨酸，Leu为亮氨酸，Lys为赖氨酸，Trp为色氨酸，Gly为甘氨酸等。所述多肽序列中的所有氨基酸可为L型氨基酸，其中的一个或多个氨基酸(除Gly外)也可以用构象为D型的氨基酸、人工修饰的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等进行替换，以提高多肽的生物利用度、稳定性和/或生物学活性。其中D型氨基酸是指与组成蛋白质的L型氨基酸相对应的氨基酸；人工修饰的氨基酸指经过甲基化、磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见L型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，例如5-羟基赖氨酸、甲基组氨酸、γ氨基丁酸、高丝氨酸等。
上述多肽、其药用盐、或其衍生物中，亲脂性化合物可以连接在末端氨基酸的侧链上，也可直接连接在肽链上。
上述多肽、其药用盐、或其衍生物中，本发明的多肽的氨基末端可含有氨基端保护基，所述氨基端保护基可为乙酰基、氨基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基或苄氧或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团；本发明的多肽的羧基末端可含有羧基端保护基，所述羧基端保护基可为氨基、酰胺基、羧基、或叔丁氧羰基或其他疏水基团或大分子载体基团中的任一基团。
组合物Z也属于本发明的保护范围，所述组合物Z为Z1)、Z2)或Z3)：
Z1)包含C1)和C2)的组合物；
Z2)包含C1)和C3)的组合物；
Z3)包含C1)、C2)和C3)的组合物；
C1)为C11)、C12)或/和C13)；所述C11)为上述多肽或其药用盐；所述C12)为上述衍生物；所述C13)为上述多聚体；
C2)为小檗碱；
C3)为药学上可接受的载体或辅料；
所述组合物Z具有下述F1)-F3)中的至少一种功能：
F1)抑制革兰氏阴性菌；
F2)治疗和/或预防和/或辅助治疗革兰氏阴性菌感染所致疾病；
F3)抑制革兰氏阴性菌侵入细胞。
上述组合物Z中，所述F1)-F3)中，所述革兰氏阴性菌可为大肠杆菌和沙门氏菌中的任一种或多种。
上述C11)、上述C12)、上述C13)或/和组合物Z在制备E1)-E3)中至少一种产品中的应用也属于本发明的保护范围：
所述E1)为抑制革兰氏阴性菌的产品，如药物；
所述E2)为治疗和/或预防和/或辅助治疗革兰氏阴性菌感染所致疾病的产品，如药物；
所述E3)为抑制革兰氏阴性菌侵入细胞的产品，如药物；
上述应用中，所述E1)-E3)中，所述革兰氏阴性菌可为大肠杆菌和沙门氏菌中的任一种或多种。
本发明还提供所述的多肽或其药用盐、所述的衍生物或所述的多聚体在制备增强抗菌药物的杀菌活性和/或抑菌活性的产品中的应用。
上述应用中，所述抗菌药物为具有下述任一种功能的药物：
F1)抑制革兰氏阴性菌；
F2)治疗和/或预防和/或辅助治疗革兰氏阴性菌感染所致疾病；
F3)抑制革兰氏阴性菌侵入细胞。
上述应用中，所述抗菌药物为含有小檗碱的药物。
本发明提供了药用化合物。
本发明所提供的药用化合物为上述C11)、C12)或C13)。
上述药用化合物中，所述药用化合物具有下述U1)-U3)中的至少一种用途：
U1)用于抑制革兰氏阴性菌；
U2)用于治疗和/或预防和/或辅助治疗革兰氏阴性菌感染所致疾病；
U3)用于抑制革兰氏阴性菌侵入细胞。
上述药用化合物的U1)-U3)中，所述革兰氏阴性菌可为大肠杆菌和沙门氏菌中的任一种或多种。
上文中，所述抑制革兰氏阴性菌侵入细胞可为结合脂质A(lipid A)或其它抑制方式介导的革兰氏阴性菌进入细胞。
本发明的多肽药用盐，包括醋酸盐(acetate)、乳糖醛酸盐(lactobionate)、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、月桂酸酯(laurate)、安息香酸盐(benzoate)、苹果酸盐(malate)、重碳酸盐(bicarbonate)、马来酸盐(maleate)、硫酸氢盐(bisulfate)、扁桃酸盐(mandelate)、酒石酸氢盐(bitartrate),甲磺酸盐(mesylate),硼酸盐(borate),溴甲烷(methylbromide),溴化物(bromide),硝酸甲酯(methylnitrate),依地酸钙(calciumedetate),甲基硫酸盐(methylsulfate),右旋樟脑磺酸(camsylate),粘酸盐(mucate),碳酸盐(carbonate),萘磺酸盐(napsylate),氯化物(chloride),硝酸盐(nitrate),棒酸盐(clavulanate),N-甲葡糖胺(N-methylglucamine),柠檬酸盐(citrate),铵盐(ammoniumsalt),二氢氯化物(dihydrochloride),油酸盐(oleate),乙二胺四乙酸盐(edetate),草酸盐(oxalate),乙二磺酸盐(edisylate),扑酸盐(pamoate)，双羟萘酸盐(embonate),丙酸酯月桂硫酸酯(estolate),棕榈酸盐(palmitate),乙磺酸酯(esylate),泛酸盐(pantothenate),延胡索酸盐(fumarate),磷酸盐/二磷酸(phosphate/diphosphate),葡庚糖酸盐(gluceptate),聚半乳糖醛酸盐(polygalacturonate),葡(萄)糖酸盐(gluconate),水杨酸盐(salicylate),谷氨酸盐(glutamate),硬脂酸盐(stearate),对羟乙酰氨基苯胂酸(glycollylarsanilate),硫酸盐(sulfate),羟基苯甲酸盐(hexylresorcinate),碱式乙酸盐(subacetate),海巴(hydrabamine),琥珀酸盐(succinate),氢溴酸盐(hydrobromide),丹宁酸盐(tannate),氢氯化物(hydrochloride),酒石酸盐(tartrate),羟萘酸盐(hydroxynaphthoate),8-氯茶碱盐(teoclate),碘化物(iodide),甲苯磺酸盐(tosylate),三乙基碘(triethiodide),乳酸(lactate),戊酸盐(valerate)等。取决于用途，药用盐可以由阳离子如钠(sodium)、钾(potassium)、铝(aluminum)、钙(calcium)、锂(lithium)、锰(magnesium)和锌(zinc)、铋(bismuth)等所形成，也可由碱如氨、乙二胺(ethylenediamine)、N-甲基-谷氨酰胺(N-methyl-glutamine)、赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)、鸟氨酸(ornithine)、胆碱(choline)、N,N'-二苄基乙二胺(N,N'-dibenzylethylene-diamine),氯普鲁卡因(chloroprocaine),二乙醇氨(diethanolamine),普鲁卡因(procaine),二乙胺(diethylamine),哌嗪(piperazine),三羟甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane)和羟化四甲铵(tetramethylammonium hydroxide)等所形成。这些盐可以采用标准方法制备，例如通过游离酸与有机或无机碱的反应。在一个碱性基团如氨基存在的情况下，酸性盐如氢氯化物(hydrochloride)、氢溴化物(hydrobromide)、醋酸盐(acetate)、扑酸盐(pamoate)等等可用作剂型；在一个酸性基团(如-COOH)或醇基存在的情况下，可药用的酯如醋酸酯(acetate)、马来酸酯(maleate)、三甲基乙酸氯甲酯(pivaloyloxymethyl)等、以及文献中公知的用于改善可溶性和水解性的酯可以用作持续释放和前体药制剂。
本发明所提供的多肽、其衍生物、或其药用盐，所述多聚体，所述组合物或所述药用化合物，可以用于革兰氏阴性菌感染的治疗。本发明所提供的脂肽或多肽、其衍生物、或其药用盐，所述多聚体，所述组合物或所述药用化合物，也可以用于革兰氏阴性菌感染的预防。
在实际应用中，可以将本发明的多肽、其衍生物、或其可药用盐，所述多聚体，所述组合物或所述药用化合物作为药物直接给予病人或患病动物、或者与适宜的载体或赋形剂混合后给予病人或患病动物，以达到治疗和/或预防革兰氏阴性菌感染的目的。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。其中，栓剂可为阴道栓剂，也可以是阴道环，也可以是适于阴道应用的药膏、乳霜或凝胶。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、甘油酯、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腹腔注射、脑池内注射或灌输等；腔道给药，如经直肠、阴道和舌下；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。上述给药途径优选的是注射给药，优选的注射途径是皮下注射。
本发明的多肽、其衍生物、可药用盐，所述多聚体，所述组合物或所述药用化合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体活性成分，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。
对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体活性成分的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体活性成分的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体活性成分组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，活性成分的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。
本发明的多肽、其衍生物、或其可药用盐，所述多聚体，所述组合物或所述药用化合物可以直接单独用于革兰氏阴性菌感染者的治疗和预防，也可以与一种或多种抗革兰氏阴性菌感染药物联合使用，可以同时使用，也可以间隔使用，以达到提高整体治疗效果的目的。
本发明中，所述抑制革兰氏阴性菌，具体可为抑制大肠杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌。
实验证明，本发明的多肽可特异性抑制革兰氏阴性菌。本发明的多肽能够特异性抑制革兰氏阴性菌，达到抗革兰氏阴性菌感染的效应，该多肽具有低或无溶血性，在128μg/mL浓度时，其溶血率为0.4％。针对大肠杆菌，本发明的多肽与小檗碱联合用药的FIC指数值为0.34，具有协同抑菌效应，且联合用药时无溶血性和低细胞毒性。本发明的多肽或其药用盐及其衍生物可以作为新的抑菌制剂，尤其可与小檗碱联合用药，可应用于开发抑菌药物。
附图说明
图1为大肠杆菌lipidA结合基元PCK的高效液相色谱图。
图2为大肠杆菌lipidA结合基元PCK的质谱图。
图3为大肠杆菌lipidA结合基元PCK对大肠杆菌CVCC1515和沙门氏菌ATCC14028的MIC测定结果原始数据图。图中，1-11列PCK浓度依次从低到高(2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL、512μg/mL、1024μg/mL、2048μg/mL)；12列为空白对照(PCK浓度为0μg/mL)；A-C行为大肠杆菌CVCC1515；D-F行为沙门氏菌ATCC14028；G行为大肠杆菌阴性CK；H行为沙门氏菌阴性CK。●代表浑浊，有菌；×代表澄清，无菌。
图4为大肠杆菌lipidA结合基元PCK对金黄色葡萄球菌ATCC43300的MIC测定结果原始数据图。图中，1-11列PCK浓度依次从低到高(2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL、512μg/mL、1024μg/mL、2048μg/mL)；12列为空白对照(PCK浓度为0μg/mL)；A-F为金黄色葡萄球菌ATCC43300；G行、H行为阴性CK。●代表浑浊，有菌；×代表澄清，无菌。
图5为大肠杆菌lipidA结合基元PCK与小檗碱联合抗大肠杆菌CVCC1515的96孔板结果原始数据图。图中，第1-7列小檗碱浓度依次从低到高(0μg/mL、2.4μg/mL、4.9μg/mL、9.8μg/mL、19.5μg/mL、39μg/mL和78μg/mL)，第8-12列为空白，无样品；A-G行PCK浓度从从低到高(0μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL、512μg/mL、1024μg/mL)，H行为空白，无样品。●代表浑浊，有菌；×代表澄清，无菌。
图6为大肠杆菌lipidA结合基元PCK的溶血率测定图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。虽然下文以革兰氏阴性菌大肠杆菌CVCC1515、沙门氏菌ATCC14028为例具体说明本发明技术方案的抑菌效果，但本发明对多肽用途的保护范围并不限于大肠杆菌CVCC1515、沙门氏菌ATCC14028。任何适用上述抗大肠杆菌、沙门氏菌等均在本发明所述革兰氏阴性菌的范围之内，例如可以是大肠杆菌、沙门氏菌的其它株系及其他革兰氏阴性菌等。
另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的常规方法或按照厂商所建议的条件。
实施例1
1、大肠杆菌lipid A结合基元PCK的制备
通过Fmoc固相合成法合成lipid A结合基元PCK树脂，经过三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)切割、冷冻干燥、HPLC纯化和质谱鉴定，完成lipid A结合基元PCK的制备。
PCK的氨基酸序列为：
Ser Tyr Pro Met Tyr Ala Arg Arg Phe Leu Phe Lys Trp Gly Leu Leu Arg-NH2(如序列表序列1所示)。
Fmoc固相合成法合成大肠杆菌lipidA结合基元PCK的具体步骤为：lipidA结合基元PCK的制备从C端→N端方向进行，首先将C端第一个氨基酸即Fmoc-Arg-OH激活、偶联到CTC树脂，然后将保护基团Fmoc去保护得到X-Arg+CTC树脂；再将C端第二个氨基酸即Fmoc-Leu-OH激活、偶联；按照这个程序依次从C端接入氨基酸，直至最后一个氨基酸，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次，再用甲醇洗涤，置于氮气干燥器内过夜干燥。将干燥后的树脂加入含有三异丙基矽烷(triisopropylsilane，TIPS)、TFA切割水溶液进行切割。过滤后于滤液中加入冰乙醚对PCK进行沉淀，并置于旋转蒸发仪旋蒸后获得PCK。加水溶解PCK后，通过高效液相的C18柱(流动相A：0.1％TFA+水；流动相B：0.075％TFA+乙腈)分离、纯化，冷冻干燥后，MS鉴定分析。高效液相色谱图见图1，质谱图见图2，PCK的分子量为2124.51Da，纯度为98.36％。
2、PCK抑菌活性的测定
PCK对细菌最小抑菌浓度(MIC)值的测定参考临床和实验室标准协会(CLSI，Clinical and Laboratory Standards Institute)，采用微量肉汤稀释法(CLSI,2007)。
所用细菌为如下3种：
大肠杆菌CVCC1515：革兰氏阴性菌，中国兽医微生物菌种保藏管理中心产品，货号1511C0006000001651。
沙门氏菌ATCC14028：革兰氏阴性菌，美国模式培养物集存库产品，货号CDC6516-60。
金黄色葡萄球菌ATCC43300：革兰氏阳性菌，美国模式培养物集存库产品，货号F-182。
针对上述每种细菌的抑菌实验如下：
将过夜培养的细菌转接至新鲜的MHB培养基(Mueller-Hinton Broth)(pH 7.0)中，37℃摇床培养至半对数期，用新鲜的MHB培养基将菌液稀释到OD600nm为0.01，随后继续将菌液稀释到5×105CFU/mL，得到菌液。采用二倍稀释法用超纯水将PCK(溶质)溶解，得到PCK溶液，使96孔微孔板的每列按照加入10μL PCK溶液后在100μL体系中的PCK的浓度分别为2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL、512μg/mL、1024μg/mL、2048μg/mL，随后在96孔板的每孔中加入90μL菌液(5×105CFU/mL)，每一浓度设置三孔重复，同时设置阴性对照组(每孔只加入10μL超纯水和90μL菌液(5×105CFU/mL)，37℃培养箱中培养16-18h，至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊。MIC的值被定义为能完全抑制细菌生长的最低化合物浓度。
在MIC值测定结束后，在没有细菌生长的平板孔中各取10μL内容物涂布于MHA平板(Mueller-Hinton Agar)上，每孔做三个重复，待完全吸收后，37℃下培养18-24h，根据是否有菌落生长来确定抗菌物质的最小杀菌浓度(MBC)。MBC的值就是能阻止残余菌形成菌落的抗菌物质最低浓度。
抑菌效果的检测结果见图3、图4和表1：
表1 PCK抗菌活性的测定结果
通过表1、图3、图4可知，PCK对于革兰氏阴性菌具有一定的抑菌活性。PCK对大肠杆菌CVCC1515、沙门氏菌ATCC14028的MIC和MBC值均为512μg/mL。然而，PCK对金黄色葡萄球菌ATCC43300没有活性，其MIC和MBC值均大于2048μg/mL。
3、PCK与小檗碱的联合用药
联合用药效果使用分级抑菌浓度FIC(fractional inhibitory concentration)指数评价，药物A(即PCK)和药物B(即小檗碱)单独用药时的MIC值分别用MICA和MICB表示，药物A和药物B联合用药时的最佳集合点的各自浓度分别用A和B代表，FIC指数公式：FIC指数＝FICA+FICB＝A/MICA+B/MICB。协同效应：FIC指数≤0.5；相加：0.5≤FIC指数≤1；无关作用：1≤FIC指数≤2；拮抗作用：FIC指数≥2。
针对大肠杆菌CVCC1515进行实验，药物A(PCK)对于大肠杆菌CVCC1515的MICA为512μg/mL，药物B(即小檗碱)对于大肠杆菌CVCC1515的MICB为39μg/mL。
用超纯水作为溶剂，分别配制不同浓度的PCK溶液与小檗碱溶液：
PCK溶液设置6个浓度：
0μg/mL、1/16×MICA＝32μg/mL、1/8×MICA＝64μg/mL、1/4×MICA＝128μg/mL、1/2×MICA＝256μg/mL、1×MICA＝512μg/mL、2×MICA＝1024μg/mL。
小檗碱溶液设置6个浓度：0μg/mL、1/16×MICB＝2.4μg/mL、1/8×MICB＝4.9μg/mL、1/4×MICB＝9.8μg/mL、1/2×MICB＝19.5μg/mL、1×MICB＝39μg/mL、2×MICB＝78μg/mL。
在96孔板1-7列小檗碱浓度从低浓度到高浓度(0μg/mL、2.4μg/mL、4.9μg/mL、9.8μg/mL、19.5μg/mL、39μg/mL和78μg/mL)分别按列加入小檗碱溶液5μL，同列小檗碱的浓度相等，每列加7孔。在A-G行PCK从低浓度到高浓度(0μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL、512μg/mL、1024μg/mL)分别按行加入PCK溶液5μL，每行加7孔，同行PCK浓度相同。各孔中分别加入步骤2的菌液(105CFU/mL)90μL，每个孔的反应体系为100μL。将96孔板在37℃培养箱孵育18-24h，3次重复。计算FIC指数，结果见表2。
表2 PCK与小檗碱联合抗大肠杆菌CVCC1515
通过表2、图5可知，PCK与小檗碱联合用药的FIC指数值为0.34，小于0.5，说明PCK与小檗碱对大肠杆菌CVCC1515具有协同抑菌效应。
4、大肠杆菌lipid A结合基元PCK的细胞毒性测定
收集新鲜正常北京鸭全血，肝素抗凝；4℃3000r/m离心10min取沉淀，用0.9％生理盐水洗3次后，用生理盐水按8％(v/v)重悬，得到红细胞悬液，用以细胞毒性的测定。
4.1 PCK单独使用的细胞毒性测定
50μL的红细胞悬液与50μL不同浓度的PCK溶液(对照组1以浓度0.1％的100μLTritionX-100替代，对照组2以生理盐水替代)混匀，处理组和对照组所用50μL溶液具体如下：
处理组1：PCK浓度为0.5μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
处理组2：PCK浓度为1μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
处理组3：PCK浓度为2μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
处理组4：PCK浓度为4μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
处理组5：PCK浓度为8μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
处理组6：PCK浓度为16μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
处理组7：PCK浓度为32μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
处理组8：PCK浓度为64μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
处理组9：PCK浓度为128μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
处理组10：PCK浓度为256μg/mL的溶液，溶质为PCK，溶剂为生理盐水(溶质为氯化钠，氯化钠的浓度是0.9％，溶剂为蒸馏水)。
对照组1：浓度0.1％的100μL TritionX-100(溶血率＝100％)。
对照组2：生理盐水(溶血率＝0％)。
混匀后红细胞终浓度4％(v/v)；混合体系放置37℃恒温箱，孵育1h；取出细胞，并将细胞离心10min(4℃，1500r/m)；取上清，用酶标仪测定在540nm波长处的吸光值。
溶血百分比值通过以下公式计算：溶血率＝(OD药物组-OD对照组2)/(OD对照1-OD对照组2)×100％。
结果显示，在256μg/mL、128μg/mL浓度下，PCK的溶血率分别为17％和0.4％(图6)，说明在0.5-128μg/mL浓度时，对北京鸭红细胞没有毒性。但是，在高浓度时PCK对北京鸭红细胞具有低溶血性。
4.2 PCK与小檗碱联合使用的细胞毒性测定
96孔板加入红细胞悬液100μL/孔(104个细胞/mL)，置培养箱(37℃，5％CO2)培养24h，加入待测物质(PCK溶液+小檗碱溶液)。具体待测物质设置如下：
PCK溶液设置6个浓度，分别用DMEM细胞培养液稀释：
0μg/mL、1/16×MICA＝32μg/mL、1/8×MICA＝64μg/mL、1/4×MICA＝128μg/mL、1/2×MICA＝256μg/mL、1×MICA＝512μg/mL、2×MICA＝1024μg/mL。
小檗碱溶液设置6个浓度，分别用DMEM细胞培养液稀释：0μg/mL、1/16×MICB＝2.4μg/mL、1/8×MICB＝4.9μg/mL、1/4×MICB＝9.8μg/mL、1/2×MICB＝19.5μg/mL、1×MICB＝39μg/mL、2×MICB＝78μg/mL。
在96孔板从低浓度到高浓度(0μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL、512μg/mL和1024μg/mL)分别按行加入PCK溶液5μL，同行PCK的浓度相等，每行加7孔，第1行作为不加PCK的小檗碱对照组。从低浓度到高浓度(0μg/mL、2.4μg/mL、4.9μg/mL、9.8μg/mL、19.5μg/mL、39μg/mL和78μg/mL)分别按列加入小檗碱溶液5μL，每列加7孔，同列小檗碱浓度相同，第1列作为不加小檗碱的PCK对照组。
加入待测物质后继续培养24h；向每孔中加入10μL CCK-8溶液，37℃下孵育1-4h，用酶标仪测定在450nm波长处的吸光度。
细胞存活率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％。
1/16×MICA浓度的PCK(32μg/mL)与1/8×MICB浓度的小檗碱(4.9μg/mL)联合用药时的溶血率和细胞存活率分别为0.07％和91.7％，低于小檗碱(溶血率为1％、细胞存活率为53.99％)，说明PCK与小檗碱联合用药时无溶血性和低细胞毒性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 一种大肠杆菌lipid A结合基元PCK及其制备方法与应用
<130> GNCSY212318
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Tyr Pro Met Tyr Ala Arg Arg Phe Leu Phe Lys Trp Gly Leu Leu
1 5 10 15
Arg