一种发酵生产异柠檬酸的方法
阅读说明：本技术 一种发酵生产异柠檬酸的方法 (Method for producing isocitric acid by fermentation ) 是由 任轶锴 吴松海 马骏 于 2021-03-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种发酵生产异柠檬酸的方法,包括以下步骤：1)采用特殊的异柠檬酸发酵培养基原料制得培养基液体；2)将培养基液体进行灭菌处理；3)将无菌的培养基在发酵罐中冷却到30℃以下,接入异柠檬酸菌种,调节培养温度26℃-30℃,所述发酵罐通入净化空气进行有氧培养,发酵培养120h-160h得到发酵液,发酵过程使用氨水调节发酵液的pH至4.0-6.0,4)发酵液经过滤去除菌体,然后进行沉淀、酸溶、结晶、干燥,得到异柠檬酸产品。本发明通过优化有机复合氮源和发酵条件,控制发酵过程中pH,提高发酵单位,发酵结束后,异柠檬酸的含量达到125 g/L。与优化前相比,异柠檬酸产量提高了38.1%,异柠檬酸和柠檬酸的比例达到了8.2:1,易于后期提取及纯化。(The invention provides a method for producing isocitric acid by fermentation, which comprises the following steps: 1) preparing a culture medium liquid by adopting a special isocitric acid fermentation culture medium raw material; 2) sterilizing the culture medium liquid; 3) cooling a sterile culture medium to below 30 ℃ in a fermentation tank, inoculating an isocitric acid strain, adjusting the culture temperature to 26-30 ℃, introducing purified air into the fermentation tank for aerobic culture, performing fermentation culture for 120-160 h to obtain fermentation liquor, adjusting the pH of the fermentation liquor to 4.0-6.0 by using ammonia water in the fermentation process, 4) filtering the fermentation liquor to remove thalli, and then performing precipitation, acid dissolution, crystallization and drying to obtain an isocitric acid product. According to the invention, by optimizing the organic compound nitrogen source and the fermentation conditions, the pH value in the fermentation process is controlled, the fermentation unit is increased, and after the fermentation is finished, the content of the isocitric acid reaches 125 g/L. Compared with the prior art, the yield of the isocitric acid is improved by 38.1 percent, the ratio of the isocitric acid to the citric acid reaches 8.2:1, and the post-extraction and purification are easy.)
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产异柠檬酸的方法。
背景技术
柠檬酸作为有机酸中的第一大酸，90%通过微生物发酵获得，同时异柠檬酸是柠檬酸发酵过程中较难去除的副产物。二者的生物合成途径大致是糖类物质经过糖酵解和磷酸戊糖途径生成丙酮酸，后者经氧化脱羧生成乙酰CoA进入三羧酸循环从而生成柠檬酸，柠檬酸经顺乌头酸酶异构化生成异柠檬酸。近二十年的研究表明，异柠檬酸越来越多的用于药手性建模、生物体液抗凝、橙汁品质检测的标记物，异柠檬酸一钾盐用于几种生化分析（乌头酸水合酶、NAD-异柠檬酸脱氢酶、NADP-异柠檬酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶的检测）。随着应用场景的增多，以前作为副产物出现的异柠檬酸的规模化生产越显重要。
但是，目前对于异柠檬酸发酵培养基在工业化生产过程中存在很多问题，如油脂难以代谢完全、发酵液中柠檬酸含量偏高提取难度大、发酵底物转化率低等，制约着产品的质量和生产成本。本发明通过优化有机复合氮源和发酵条件，有效提高了异柠檬酸的产量，使其更易于后期提取及纯化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种发酵生产异柠檬酸的方法，该方法应用酶解植物蛋白粉和酵母提取物复合有机氮源作为氮源，提高了氮源利用率。该方法利用的甘油作为底物，替代传统的植物油或液体石蜡等重油，促进了底物的转化速度，提高了底物的转化率。
该方法在发酵周期60 h -120 h，每升发酵液补入32 g-48 g甘油，提高了单罐批的产量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种发酵生产异柠檬酸的方法，具体包括如下步骤：
（1）培养基配制：采用经优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基原料制得培养基液体；
（2）灭菌：将所述培养基液体在灭菌设备中进行杀菌处理；在不损失营养的情况下，杀灭培养基液体中的微生物；
（3）接种培养：无菌的培养基液体在发酵罐中冷却至30℃以下，接入异柠檬酸菌种，调节培养温度26℃-30℃，所述发酵罐通入净化空气进行有氧培养，发酵至60-120 h，匀速补加已灭菌的40%甘油溶液，补入量是发酵液体积的32-48 g/L，发酵培养120 h-160 h得到发酵液，发酵过程使用氨水调节发酵液的pH为4.0-6.0；
（4）发酵液经过滤去除菌体，经沉淀、酸溶、结晶、干燥得到异柠檬酸产品。
优选的，步骤（1）中，所述优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基：酵母提取物0.1-0.5 g/L、酶解植物蛋白粉0.1-0.3 g/L、磷酸二氢钾0.05-0.3 g/L、七水硫酸镁0.05-0.3 g/L、甘油40-60 g/L、衣康酸0.02-0.06 g/L，灭菌前调节pH至6.0-7.0。
优选的，步骤（3）中，补入甘油的量为每升发酵液32 g -48 g。
优选的，步骤（3）中，补入甘油的时间在60 h -120 h。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
（1）本发明的方法是异柠檬酸发酵生产过程中底物为传统的植物油或液体石蜡等重油，存在底物利用或转化不完全、设备不易清洗、提取难度大等问题；
（2）本发明的方法是用甘油为底物，替代，促进了底物的转化速度，提高了底物的转化率。
具体实施方式
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下面通过实施例对本发明技术方案进行详细的描述。以下实施例旨在进一步说明本发明的内容，但不限制本发明的保护范围。
以下原来和设备均为市售，酶解植物蛋白粉由河北保定味群食品科技股份有限公司生产。
实施例1 发酵摇瓶制备异柠檬酸
（1）培养基配制：采用经优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基原料制得培养基液体；所述优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基：酵母提取物0.3g/L、酶解植物蛋白粉0.2 g/L、磷酸二氢钾0.1 g/L、七水硫酸镁0.1 g/L、甘油60g/L、衣康酸0.02 g/L，灭菌前调节pH至6.5；混合定容后分装，250mL发酵瓶装量40 mL；
（2）灭菌：将所述培养基液体在灭菌设备中进行杀菌处理；在不损失营养的情况下，杀灭培养基液体中的微生物；
（3）接种培养：将杀灭处理后的培养基液体在发酵罐中冷却至28℃以下，无菌操作下接入异柠檬酸种子液，接种量5%，放置培养温度在26℃-28℃恒温室、220 rpm/min摇瓶机发酵培养，发酵至60 h，补加已灭菌的40%甘油溶液，补入量是发酵液体积的0.032 g/mL，发酵培养140 h得到发酵液。
本发明方法制备的异柠檬酸的产量提高了25%，异柠檬酸和柠檬酸的比例提高了56%。
本发明所述异柠檬酸产生菌为CICC 32287。
实施例2 发酵摇瓶制备异柠檬酸
（1）培养基配制：采用经优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基原料制得培养基液体；所述优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基：酵母提取物0.4 g/L、酶解植物蛋白粉0.2 g/L、磷酸二氢钾0.2 g/L、七水硫酸镁0.1 g/L、甘油40 g/L、衣康酸0.04 g/L，灭菌前调节pH至6.5；混合定容后分装，250ml发酵瓶装量40mL；
（2）杀菌：将所述培养基液体在杀菌设备中进行杀菌处理；在不损失营养的情况下，杀灭培养基液体中的细菌；
（3）接种培养：将杀灭处理后的培养基液体在发酵罐中冷却至28℃以下，无菌操作下接入异柠檬酸种子液，接种量5%，放置培养温度在26℃-28℃恒温室、220rpm摇瓶机发酵培养，发酵至70h，补加已灭菌的40%甘油溶液，补入量是发酵液体积的0.048g/ml，发酵培养140h得到发酵液。
本发明方法制备的异柠檬酸的产量提高了28%，异柠檬酸和柠檬酸的比例提高了87%。
本发明所述异柠檬酸产生菌为CICC 32287。
实施例3 10L发酵罐制备异柠檬酸
（1）培养基配置：采用经优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基原料制得培养基液体；所述优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基：酵母提取物0.4g/L、酶解植物蛋白粉0.2 g/L、磷酸二氢钾0.2 g/L、七水硫酸镁0.1 g/L、甘油40g/L、衣康酸0.04 g/L，灭菌前调节pH至6.5；
（2）杀菌：将所述培养基液体在杀菌设备中进行杀菌处理；在不损失营养的情况下，杀灭培养基液体中的细菌；
（3）接种培养：将杀灭处理后的培养基液体在发酵罐中冷却至28℃以下，接入异柠檬酸菌种，调节培养温度26℃-28℃，所述发酵罐通入净化空气进行有氧培养，发酵至60-120h，匀速补加已灭菌的40%甘油溶液，补入量是发酵液体积的40g/L，发酵培养140h得到发酵液，发酵过程使用氨水调节发酵液的pH为4.5-5.5；
（4）发酵液经过滤去除菌体，经沉淀、酸溶、结晶、干燥得到异柠檬酸产品。
本发明方法制备的异柠檬酸的产量比同等工艺条件下提高了32%，异柠檬酸和柠檬酸的比例提高了96%。
本发明所述异柠檬酸产生菌为CICC 32287。
实施例4 10 L发酵罐制备异柠檬酸
（1）培养基配制：采用经优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基原料制得培养基液体；所述优化后含酶解植物蛋白粉的异柠檬酸发酵培养基：酵母提取物0.5 g/L、酶解植物蛋白粉0.3 g/L、磷酸二氢钾0.1 g/L、七水硫酸镁0.1 g/L、甘油60 g/L、衣康酸0.06 g/L，灭菌前调节pH至6.5；
（2）灭菌：将所述培养基液体在发酵罐中灭菌；在不损失营养的情况下，杀灭培养基液体中的微生物；
（3）接种培养：将杀灭处理后的培养基液体在发酵罐中冷却至28℃以下，接入异柠檬酸菌种，调节培养温度26℃-28℃，所述发酵罐通入净化空气进行有氧培养，发酵至60-120 h，匀速补加已灭菌的40%甘油溶液，补入量是发酵液体积的48 g/L，发酵培养160 h得到发酵液，发酵过程使用氨水调节发酵液的pH为5.0-6.0；
（4）发酵液经过滤去除菌体，经沉淀、酸溶、结晶、干燥得到异柠檬酸产品。
同等工艺条件下，利用本发明方法制备异柠檬酸与传统方法相比，本发明方法制备的异柠檬酸的产量提高了38%，异柠檬酸和柠檬酸的比例提高了105%。
本发明所述异柠檬酸产生菌为CICC 32287。
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