具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的一种固相识别雌激素受体的雌二醇衍生物筛选方法，所述方法是以雌二醇-雌激素受体LBD复合物晶体构象为基础，运用分子对接对不同雌二醇衍生物与雌激素受体LBD的结合能力进行计算机模拟分析；然后进一步采用分子动力学模拟进行结构稳定性和能量变化的分析，筛选出与雌激素受体LBD具有高特异性、高亲和力的连接臂结构的衍生物。本发明运用计算生物学开展雌二醇衍生物连接臂设计思路和筛选原则形成了本发明所述筛选方法。

在一可选实施例中，所述的采用分子动力学模拟分析中，对于分子对接模拟筛选出的结构合理的复合物结构，通过真空能量最小化、添加溶剂盒子、电荷平衡、恒定原子数，体积和温度模拟、恒定原子数，压力和温度模拟和最终10ns的分子动力学模拟；然后可以根据分子动力学模拟轨迹和构象变化，提取关键指标，综合筛选出最优的衍生物。

可以包括：根据分子对接模拟分析后筛选出的雌二醇衍生物，以及雌二醇-雌激素受体LBD晶体结构，建立分子动力学模拟的复合物初始结构；然后将所述复合物初始结构采用Gromacs程序进行检查，排除掉发生原子位置冲突的雌二醇衍生物-雌激素受体LBD复合物，得到结构合理的复合物。进一步地，还可以包括：根据复合物初始结构中雌二醇衍生物的连接臂尾端在雌激素受体LBD结合口袋外的暴露程度进行筛选。

本发明中，所述的采用分子动力学模拟分析中，可以根据分子动力学模拟分析得到的模拟轨迹和构象变化，筛选出与雌激素受体LBD具有高特异性、高亲和力的连接臂结构的衍生物。

具体地，可以包括：根据分子动力学模拟分析结果提取关键指标，根据所述关键指标进行筛选；其中，所述关键指标包括均方根偏差、均方根涨落、结合能和氢键数目。进一步地，所述的根据关键指标进行筛选可以包括：根据所述均方根偏差和均方根涨落筛选出分子动力学模拟中达到稳定结构的衍生物；根据所述结合能和氢键数目，从达到稳定结构的衍生物中筛选出结合能最强且氢键数量最多的衍生物。

进一步地，还可以包括：根据衍生物对雌激素受体LBD的构象的影响情况，筛选出对雌激素受体LBD构象影响小的衍生物。例如，可以将分子动力学模拟得到的复合物最终构象的H11和H12部分进行对准，比较其发生的H12偏转情况。

在一可选实施例中，所述的分子对接计算机模拟分析中，采用分子对接对不同结构雌二醇衍生物与雌激素受体LBD的结合能力进行初步评价，得到对接打分和对接构象；根据对接构象合理性和对接打分，初步筛选柔性雌二醇衍生物为进一步研究对象。

具体地，可以包括：对不同结构雌二醇衍生物采用Autodock程序进行三维结构建立和能量最小化；以雌二醇与雌激素受体LBD结合位点为基础，建立雌二醇衍生物与雌激素受体LBD复合物的初始结构；对雌二醇衍生物和雌激素受体LBD进行分子对接，得到对接构象情况和对接打分，根据所述对接构象情况和对接打分进行筛选。其中，可以采用柔性分析对接方式进行。

下面结合一具体实施例对本发明的技术方案进行示例性说明：

选择具有不同连接臂的五种柔性结构雌二醇衍生物(4，8，11，16，20)和六种刚性结构雌二醇衍生物(r3，r5，r8，r11，r16，r20)作为考察对象，其分子结构见下表1所示。

表1不同连接臂的雌二醇衍生物分子结构

以雌二醇与人源雌激素受体LBD晶体结构(PDB ID:1GWR)为例，采用Autodock程序对上述几种结构的雌二醇衍生物进行三维结构建立和能量最小化后进行分子对接模拟，初步筛选出更适用于配体结合口袋LBP的结构。

由模拟结果可知：柔性雌二醇衍生物结构(对接打分Dscore-6.5)更适应于配体结合口袋LBP的结构，对接得分和可生成构象方面均优于刚性雌二醇衍生物结构(对接打分Dscore-5.0)。具体地说，分子对接程序会根据算法输出合理性最高的多个对接构象和相应的对接打分，该实施例中，柔性结构在能生成更多的对接构象，且对接打分均优于刚性结构，说明柔性结构在与人源雌激素受体LBD的分子对接中更优。

图1示意性示出了雌二醇衍生物配体与人源雌激素受体LBD的相互作用，如图1所示，通过对雌二醇衍生物配体和雌激素受体的相互作用分析显示在图1a柔性衍生物、图1b刚性衍生物和人源雌激素受体LBD的对接构象中，雌二醇环状结构均部分暴露在结合口袋之外，与雌激素受体识别雌二醇的正常结构差别较大。同时考虑到合理的衍生物结构应使连接臂尾端暴露在外，因此对于不同碳链长度的柔性、刚性衍生物进行进一步的分子动力学模拟分析。

在分子动力学模拟分析过程中，发现六种刚性衍生物(r3，r5，r8，r11，r16，r20)与人源雌激素受体LBD结合的结构在分子动力学模拟中出现报错。分析发现，其刚性结构和人源雌激素受体LBD的氨基酸残基存在位置冲突，故要将这些发生位置冲突的复合物排除掉，筛选出结构更合理的复合物。其中，位置冲突即存在原子之间的距离小于正常原子间距(说明有原子的位置近乎重叠)，判断依据就是原子间距，直观判断是在构象图里刚性结构和人源雌激素受体LBD部分氨基酸出现了位置的冲突。

图2示意性示出了刚性雌二醇衍生物与人源雌激素受体LBD的分子动力学模拟构象示意图，由右侧局部放大图可以明显看出该衍生物的尾端结构穿过了受体LBD的蛋白质螺旋，出现了位置冲突。因此，这些结构无法取得分子动力学模拟结果，这种位置冲突也提示了其在实验中可能会干扰人源雌激素受体LBD的正常结构以及H12的变构。因此，使用柔性连接臂或仅选择与模拟中表现较好的柔性衍生物碳链长度相近的刚性衍生物进行实验验证。

图3示意性示出了雌二醇衍生物4(表1中编号为4的衍生物)与人源雌激素受体LBD分子对接构象示意图。如图3所示，可以发现其连接臂的碳链长度过短，无法满足后续连接蛋白形成可特异高亲和力结合雌激素受体蛋白的衍生物设计需求，故不进行进一步模拟。

也就是说，连接臂的长度过短会影响固相识别中雌二醇与雌激素受体的结合性能，因此，要根据具体是否满足设计需求进行筛选，即根据分子对接构象中连接臂碳链的长度来确定是否满足设计需求。另外，如图3所示，结构完全包围在受体LBD的结合口袋内，连接臂尾端无法暴露在外，考虑到合理的衍生物结构应使连接臂尾端暴露在外的因素，所以雌二醇衍生物4不再进行模拟，至此，筛选出的剩余衍生物为柔性雌二醇衍生物(8，11，16，20)。

将筛选出的四种柔性雌二醇衍生物(8，11，16，20)，将其分别与人源雌激素受体LBD进行10ns的分子动力学模拟。分子动力学模拟在Gromacs2016.4中在GROMOS96 43a1力场下进行。在模拟中，复合物首先在十二面体盒中使用带单点电荷的水分子进行溶剂化，复合物与溶剂盒之间的最小距离为1.5nm。然后将Na+和Cl-离子添加到溶剂盒中以进行电荷平衡。在10ns最终模拟之前，进行能量最小化、温度耦合(300k)、压力耦合(1bar)。

图4a至图4d示意性示出了上述四种柔性雌二醇衍生物与人源雌激素受体LBD复合物分子动力学模拟结果。其中，图4a示意性示出了四种衍生物的均方根偏差RMSD；图4b示意性示出了四种衍生物的均方根涨落RMSF；图4c示意性示出了四种衍生物的使用MM/PBSA方法计算的结合能；图4d示意性示出了四种衍生物的氢键个数。

其中，配体-受体蛋白骨架原子的均方根偏差RMSD变化和配体-受体蛋白各氨基酸的均方根涨落RMSF反映了模拟过程雌激素受体的结构变化；配体-受体蛋白结合能的变化反映了非键作用能的变化；配体-受体蛋白氢键数量变化(Num_Hbond)反映模拟过程氢键的数量变化情况。

图4a中，RMSD结构可以看出，在模拟结束前的至少0.5ns，各复合物结构均基本稳定，说明模拟时间选择较为合理。

图4b中，RMSF结果反映人源雌激素受体LBD主要发生结构变化的部分为520号以后的氨基酸序列，即H12部分。

图4c中，结合能结果表明，柔性雌二醇衍生物8与人源雌激素受体LBD形成的复合物能量变化较为剧烈，说明其发生的结构变化较为明显的改变了配体、受体间的作用力。

图4d中，Hbond结果表明，模拟全过程中，配体为雌二醇衍生物11、16、20的复合物其配体-受体形成氢键的能力较弱，反映了其结合能力较弱，而雌二醇衍生物8则始终具有较强的氢键形成能力，图4d的上部中括号内多数均为雌二醇衍生物8。

综上，通过RMSD和RMSF表征判断结构是否在模拟中达到稳定，进一步地，对达到稳定的结构的结合能、氢键数量进行分析，筛选出结合能最强、形成氢键数量最多的连接臂结构的衍生物。

本发明中，衍生物的最终判断除了基于结合能和氢键数目，还需要基于构象合理性进行判断。也就是说，在分子动力学模拟结束时，还需对人源雌激素受体LBD构象进行分析。

图5a至图5d示意性示出了上述四种柔性雌二醇衍生物与人源雌激素受体LBD分子动力学模拟相互作用，其中，图5a为衍生物8；图5b为衍生物11；图5c为衍生物16；图5d为衍生物20。

由图5a可以看出，衍生物8被配体结合口袋较好的包裹，处于关键氨基酸残基(如Glu353，Arg394，His524等)之间。而另三种衍生物改变了LBD的位置如图5b至图5d所示，其与人源雌激素受体LBD的结合可能存在不稳定、结合能力弱的问题。需要说明的是，本发明中图1a至图1b和图5a至图5d中实心圆均为氨基酸。

进一步地，将模拟得到各复合物最终构象的H11和H12部分进行对准，比较其发生的H12偏转。

图6示意性示出了MDS模拟结束时人源雌激素受体LBD-H12的位置，图图6所示，其中，配体分别为衍生物8、衍生物11、衍生物16、衍生物20，参考结构ER-agonist、ER-apo。从图6可以看出，与衍生物8的结合使H12发生了较为接近E2引起的H12从中性(apo)到激动态(agonist)的位置变化。

最后，综合对模拟过程和模拟结果的分析，认为衍生物8具有较好的人源雌激素受体LBD结合能力，且对人源雌激素受体LBD的变构影响较小，而过长的碳链可能导致了结合口袋的破坏和更弱的结合稳定性。

本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。