具体实施方式

以下，针对本发明的内容进行详细说明。以下所记载的技术特征的说明基于本发明的代表性的实施方案、具体例子而进行，但本发明不限定于这些实施方案、具体例子。需要说明的是：

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，使用“任选”或“任选的”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。

本说明书中，如果没有特别说明，则本说明书之模型构件涉及的外部或环境条件均为室温条件下所得到，并且，所使用的“室温”表示“25℃”的室内环境温度。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本发明首要地提供了一种微生物金属离子吸附能力检测方法，本发明的检测方法为一种基于流式细胞技术的检测方法。在一些具体的实施方案中，本发明的对微生物的金属离子的吸附能力的检测方法是一种定性的检测方法；在另外一些具体的实施方案中，本发明的对微生物的金属离子吸附能力的检测方法也可以是一种定量的或半定量的方法。

(微生物)

对于适用于本发明的微生物的种类，原则是没有特别限制，只要是那些可以吸附金属离子的微生物即可。

对于这样的微生物，可以列举的包括但不限于酵母菌、大肠杆菌、贪铜菌属、枯草芽孢杆菌、真菌孢子或微生物文库。对于所述微生物文库，可以是通过基因编辑、修饰或人工合成等方法得到的微生物的种类。

另外，对于上述的微生物，也可以通过现有的微生物转化方式(例如质粒扩增等)转化成其他种类的微生物。在本案发明一些具体的实施方案中，可以通过可控的质粒扩增的方法得到各种具有预先设计的基因片段的微生物，进而将这些微生物组成微生物文库，以进一步检测其对金属离子的吸附能力或筛选出对金属吸附能力相对较强的微生物。

对于微生物的培养，本发明没有特别限制，可以使用本领域常用的培养基进行培养，可以列举的培养基例如YPD(Yeastextract Peptone Dextrose)培养基、MM(Minimalmedium)培养基、SC(Synthetic complete)培养基等，但从本发明检测精度的角度考虑，优选使用MM或SC，更优选地使用SC作为培养基。

(金属离子)

对于本发明所述的金属离子，指的是在水或者酸溶液中可以以离子形式存在的那些金属离子。

在本发明一些具体的实施方案中，这些金属离子可以包括但不限于选自以下任意一种或多种金属的任意离子形式：Mg、Al、Si、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Y、Nb、Mo、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、In、Te、Os、Ir、Pt、Au、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm和Yb。

(微生物对金属离子的吸附)

将本发明的微生物与金属离子在水溶液或酸溶液中混合，微生物可以吸附或吸收金属离子，在一些具体的实施方案中，通过生物化学作用，微生物可以将金属离子还原为金属单质，或者，可以将金属离子转变为金属氧化物。

(流式细胞测试方法)

本发明基于现有的流式细胞测试方法对吸附了金属离子的微生物的侧向散射光(SSC)值的变化量进行检测，从而能够以定性、定量或半定量的方式检测微生物对于上述金属离子的吸附能力。其中，本发明中所述侧向散射光(SSC)值，指的是SSC中位数值。

如前所述，本发明认为，微生物吸附了某些金属离子之后，金属离子被还原成0价或者是金属氧化物的纳米颗粒。进一步，现有的流式细胞测试技术能够分析单个细胞的侧向散射光(SSC)值。侧向散射光(SSC)性质对细胞膜、胞质、核膜的折射率敏感，也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。因此，利用流式细胞技术分析微生物细胞吸附了金属离子之后侧向散射光值的变化量，能够间接的定性或者半定量的微生物的金属离子吸附能力。并且，在一些优选的实施方案中，所述侧向散射光值的变化量为微生物吸收金属离子后其侧向散射光值的增加量。

通常对于侧向散光值而言，可能会收到多种因素影响，例如：微生物的种类、培养基的种类、微生物的影响成分、微生物的培养时间、微生物的浓度、微生物吸附的金属离子的种类和含量以及缓冲体系的组成或pH值等均可能对流式细胞测试中的SSC值产生影响。因此，在一些具体的实施方案中，为了量化或比较研究的方便，需通常使用在相同条件下培养的微生物在相同的缓冲溶液的体系中完成对金属离子的吸附，从而通过它们之间的SSC值的变化值来进行量化分析或相互比较。

本发明中，对于使用侧向散射光(SSC)值的变化值来作为定性、定量或半定量确定微生物吸附金属能力主要基于以下两点：

①在微生物对于金属离子吸附时，微生物浓度具有适当的范围，以使得在流式细胞仪测试时SSC变化明显，从这点考虑，本发明在使用微生物吸收金属离子时，微生物的浓度为2～25g/L，优选为2.5～20g/L。

②通过流式细胞测试方法测得的侧向散射光(SSC)值的变化量与微生物的吸附量(单位质量的金属吸附量)能够呈现出高的线性关系。例如通过线性回归处理，能够呈现出线性相关系数大于0.9，优选为0.93以上的直线关系。

通过以下所述的验证，表明本发明的测试方法能够满足以上两个条件，从而为以下两种检测提供可能：

i)定性比较或筛选金属吸附能力相对更强的微生物。具体而言，以相同的培养条件得到各种微生物，并将这些微生物分别以相同的条件与金属离子接触(相同的条件，包括缓冲体系、微生物浓度、金属离子种类和浓度相同)。之后采用流式细胞测试方法检测这些微生物的侧向散光(SSC)值的变化量。进而，变化金属离子的浓度或种类，可以比较相同金属离子种类下不同浓度时那种微生物的金属离子吸附性更强或者也可以比较相同金属离子浓度下那种微生物对于不同的种类的金属离子吸附能力更强。

ii)作为一种定量或半定量的方法，可以选择一种微生物其在确定的培养基中培养得到，并制作在特定微生物浓度(2～25g/L)下的吸附量与SSC值的标准曲线或工作曲线。然后使用该工作曲线，检测在类似的培养基条件下得到的微生物的吸附量(被检测微生物吸附金属离子时的浓度与制作工作曲线时相同)。

进一步，可以通过使用本发明的方法，从自然存在或人工合成等得到的微生物群或文库中筛选出吸附金属离子能力强的微生物，进而使用该微生物吸附或回收污水、废水等物质中残留的金属离子。

实施例

以下将通过实施例和附图对本发明做出进一步的说明。实施例中使用的物质除了微生物以外均可以通过商购获得。

实施例1(培养基种类在Pd吸附中对侧向散射光系数的影响)

(1)培养基的配制：

YPD液体培养基(1L)：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g，余量为H₂O。

Minimal medium(MM)液体培养基(1L)：酵母基础氮源(YNB)1.5g、硫酸铵5g、D-葡萄糖20g、肌醇0.002mg、腺嘌呤半硫酸盐0.1g、氨基苯甲酸0.1g、色氨酸0.0224g、亮氨酸0.2g，余量为H₂O。

Synthetic complete(SC)液体培养基(1L)：酵母基础氮源(YNB)1.5g、硫酸铵5g、D-葡萄糖20g、肌醇0.002mg、色氨酸0.0224g、尿嘧啶0.1g、亮氨酸0.2g、腺嘌呤半硫酸盐0.1g、谷氨酸0.1g、苯丙氨酸0.1g、丙氨酸0.1g、脯氨酸0.1g、丝氨酸0.1g、天冬氨酸0.1g、异亮氨酸0.1g、苏氨酸0.1g、天冬酰胺0.1g、亮氨酸0.1g、酪氨酸0.1g、半胱氨酸0.1g、赖氨酸0.1g、缬氨酸0.1g、谷氨酰胺0.1g、蛋氨酸0.1g、甘氨酸0.1g、精氨酸0.1g、组氨酸0.1g、氨基苯甲酸0.1g，余量为H₂O。

在上述液体培养基中加入2％琼脂粉，制备成上述液体培养基对应的固体培养基。

(2)菌种活化与培养

将保藏于甘油管中的菌株S.cerevisiae EBY100(Invitrogen,Carlsbad,CA)在SC平板上划线培养，30℃培养72h。在平板上挑取一个单菌落于5mL YPD、SC和MM液体培养基中，30℃、200rpm分别培养12h。取1mL菌悬液加入到100mL YPD、SC和MM液体培养基中30℃、200rpm震荡再分别培养12h。4000rpm离心3min收集菌体，25mM HEPES缓冲液洗涤一次再次离心收集菌体。

(3)Pd离子吸附实验

准确称取菌体湿重，用25mM HEPES悬浮细胞制备20g/L的菌悬液母液，菌体湿重：菌体干重＝10:1.777。在24孔板中，按照1mL的吸附体积，配制Pd离子浓度为0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0mM，菌体浓度(下文简称为“菌浓”)为10.0g/L吸附体系，实验设两个重复。30℃，220rpm震荡吸附1h后，4000rpm离心3min分离菌体。

(4)ICP-OES和流式细胞技术分析

将离心后的上清用于ICP-OES测定。菌体用1000μL 25mM的HEPES悬起，4000rpm离心3min后去除上清，菌体再用1000μL 25mM的HEPES悬起用于流式细胞仪(AgilentNovoCyte)分析其侧向散射光系数(SSC)的变化。其中，流式细胞技术分析时，将单细胞门圈出来用于SSC值分析。

实验结果如图1(a)所示，不同培养基(YPD、MM和SC)培养的S.cerevisiae EBY100菌体，在10g/L菌浓下，对Pd离子的吸附能力有差异。其中，MM培养基中培养的菌体对Pd离子吸附能力最低(2mM Pd浓度下，吸附量为127.6μM/g)，YPD培养的菌体吸附能力居中(2mM Pd浓度下，吸附量为148.4μM/g)，SC培养基中培养的菌体对Pd离子吸附能力最高(2mM Pd浓度下，吸附量为214.6μM/g)，最高吸附量与最低吸附量之间相差1.68倍。

上述实验结果表明：菌体表面的特性和培养基成分(菌体生长情况)有关，完全培养基(SC培养基)与基本培养基(MM培养基)相比，其能够提供菌体生长所有的营养物质，有利于健康菌体表面的形成。

图1(b)为Pd离子浓度为0.25-1.5mM内(Pd离子浓度为0.125-0.25mM和1.5-2.0mM之间的数据因为没有相关性而没在图1(b)中显示)，单位菌体的吸附量与流式细胞中SSC值增量之间的关系。由图1(b)可知，不同培养基培养的菌体，吸附了Pd离子之后的吸附量与SSC值之间的相关性不同，其中YPD培养的菌体相关系数最低(R²＝0.70)，而MM培养基和SC培养基的相关系数分别达到0.93和0.95。其原因主要是，YPD培养基成份复杂，培养出来的菌体与SC和MM等合成培养基相比，所培养的菌体均一性不够，而流式细胞技术测定的是单个菌体的SSC值，因此单个菌体的吸附能力和SSC值增量之间的相关系数较低。此实施例说明，在合适的培养基培养下，S.cerevisiae EBY100菌体的吸附能力和SSC值增量之间有较强的相关系数，可以通过测定SSC值间接表征菌体对Pd离子的吸附量。

实施例2(酵母菌体浓度在Pd吸附中对侧向散射系数的影响)

(1)菌种活化与培养

将保藏于甘油管中的菌株S.cerevisiae EBY100在SC平板上划线培养，30℃培养72h。在平板上挑取一个单菌落于5mL SC液体培养基中，30℃、200rpm震荡培养12h。取1mL菌悬液加入到100mL SC液体培养基中30℃、200rpm震荡培养12h。4000rpm离心3min收集菌体，25mM HEPES缓冲液洗涤一次再次离心收集菌体。

(2)Pd离子吸附实验

准确称取菌体湿重，用25mM HEPES悬浮细胞分别制备40、20、10、和5g/L的菌悬液母液，其中菌体湿重：菌体干重＝10:1.777。在24孔板中，按照1mL的吸附体积，配制Pd离子浓度为0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0mM，菌浓为2.5、5.0、10.0和20.0g/L吸附体系，实验设两个重复。30℃，220rpm震荡吸附1h后，4000rpm离心3min分离菌体。

(3)ICP-OES和流式细胞技术分析

将离心后的上清用于ICP-OES测定。菌体用1000μL 25mM的HEPES悬起，用于流式细胞仪(Agilent NovoCyte)分析其侧向散射光系数(SSC)的变化。其中，流式细胞技术分析时，将单细胞门圈出来用于SSC值分析。

实验结果如图2(a)所示，在Pd离子浓度为0.125-2.0mM条件下，单位菌体的吸附能力随着菌体浓度的升高而降低，且随着Pd离子浓度的增加，不同浓度菌体之间的吸附能力差异增大。

在0.125mM的Pd离子条件下，2.5g/L和20g/L的菌浓，其菌体吸附能力分别为25.7和6.2μM/g(干菌)；在2.0mM的Pd离子浓度下，菌体吸附能力为336.5μM/g(2.5g/L)和160μM/g(20g/L)。其原因主要是：在相同初始Pd离子浓度下，高浓度菌体(20g/L)相对比低浓度菌体(2.5g/L)，其细胞数量和金属离子数量的比值低，因此单位菌体的吸附量低。

图2(b)显示了不同Pd离子初始浓度下，菌体的侧向散射光系数(SSC值)的变化。总体而言，SSC值随着初始浓度的增加而增加，到达0.7左右的增幅后，再增加初始Pd离子浓度也不能提高SSC值。另外，SSC值对初始Pd浓度的敏感度随着菌浓的增加而降低。在2.5g/L菌浓下，SSC值在0.5mM的Pd浓度下已趋近最大值，在0.125-0.5mM的Pd浓度范围内，SSC值与Pd初始浓度有极强的相关性(R²＝0.95)。随后，SSC值与Pd初始浓度的相关区间逐渐增大，在20g/L的菌浓下，SSC值在2.0mM Pd离子浓度内均保持着极好的相关性(R²＝0.99)。

图2(b)中相关区间内，单位菌体的吸附量(即具体的吸附能力)和菌体SSC中位数增量如图2(c)所示。单位菌体对Pd离子的吸附量与SSC值的增量(即SSC中位数增量)呈正比，在2.5-20g/L的菌浓内，二者的相关系数均在0.9以上，在20g/L的菌浓时达到0.96。此实施例说明，在一定范围内，流式细胞技术中SSC值的变化可以反映出单位菌体上Pd离子的吸附量。

实施例3(流式细胞分选方法在高通量筛选高金属吸附菌株中的应用)(1)S.cerevisiae EBY100表面展示文库的建立

利用表1中所示的引物1-2和3-4(具体参见表1)对酿酒酵母表面展示质粒pYD1(Addgene 73447)进行扩增(PCR反应体系和PCR扩增条件分别如表2和表3所示)，并胶回收PCR产物。

用一步克隆方法(ClonExpress II One Step Cloning Kit)按照表4的所示的体系在37℃、30min条件下将两个片段连接。

表1质粒克隆引物表

表2 PCR反应体系

表3 PCR扩增条件

表4一步克隆体系(连接体系)

其中，表1中的引物1-2用于扩增金属结合多肽片段和部分质粒骨架；表1中的引物3-4用于扩增部分质粒骨架。所述引物1中的N代表A、G、C或T中的任一种碱基；所述引物1-2扩增的金属结合多肽片段和部分质粒骨架与引物3-4扩增的部分质粒骨架的长度接近。引物3-4的PCR反应体系与表2中所示的PCR反应体系相同。

具体操作如下：

取100μL E.coli DH 5α感受态细胞在冰上融化，加入10μL连接后的产物，轻轻混合后，冰上静置30min，42℃热击45s，迅速放入冰上2-3min后加入900μL无抗性的LB培养基，37℃震荡培养1h，全部涂布于Kan抗性平板上。用细胞铲将平板上的E.coli单菌落收集之后提取质粒。按照以下方法将质粒转入S.cerevisiae EBY100中：收集50mL OD₆₀₀达到1.0的S.cerevisiae EBY100菌体，去除上清后加入10mL 0.1M醋酸锂溶液悬浮菌体，3000rpm离心3min收集菌体；加入300μL 0.1M醋酸锂溶液悬浮菌体，混合均匀后取60μL菌悬液分装到2.0mL离心管中；向每个管中5μL提取质粒、300μL转化预混液(包括300μL 50％(w/v)PEG3350、40.6μL 1M醋酸锂溶液、3.8μL 1M Tris(pH 7.6)、0.75μL 0.5M EDTA和10μL鲑鱼精)，30℃旋转培养30min，然后42℃热击20min，1500rpm离心30sec后去除部分上清，将菌体全部涂布与不含色氨酸的SC培养基(SC-Trp)中，30℃培养2-3天。用细胞铲将平板上的菌落收集起来，分装后即为S.cerevisiae EBY100表面展示文库。

(2)S.cerevisiae EBY100表面展示文库中高金属吸附能力菌株的筛选

吸取100μLS.cerevisiae EBY100表面展示文库，接种到5mL以葡萄糖为碳源的SC-Trp培养基中，培养过夜(30℃，18h)。然后，吸取200μL上述菌悬液接种到5mL以半乳糖为碳源的SC-Trp诱导培养基中，30℃培养24h。4000rpm离心3min收集菌体，将菌体用25mM HEPES(pH＝5.5)洗涤一次，再加入适量的25mM HEPES缓冲液配成20g/L的菌悬液。以1mL为吸附体系，其中加入25μL 5mM的Pd离子母液、475μL 25mM HEPES缓冲液和500μL20 g/L的菌悬液，220rpm，30℃吸附1h。4000rpm离心3min收集菌体，用25mM HEPES将菌体洗涤一次后稀释到合适浓度用于流式细胞分选。将单细胞门圈出来用于SSC值分析，分选SSC值最大的0.5％细胞群，总计分选25700个细胞，全部涂布于SC-Trp培养基中，30℃培养2-3天长出单菌落。

(3)S.cerevisiae EBY100单菌落金属离子吸附能力的鉴定

平板挑取380个单菌落于24孔板中，每个孔中加入1.0mL以葡萄糖为碳源的SC-Trp培养基，350rpm，30℃培养24h。然后转接10μL到新鲜的1mL以半乳糖为碳源的SC-Trp诱导培养基中，诱导表达36h，3000rpm离心3min，倒掉上清，加入1mL HEPES缓冲液洗涤一次，离心倒掉上清之后加入适量HEPES悬浮菌体使得菌浓为10g/L。在新的24孔板中加入100μL5mMPd溶液，400μL 25mM的HEPES和500μL稀释到10g/L的菌液。220rpm吸附1h，3000rpm离心3min，上清用于ICP-OES测定Pd浓度。将吸附量提高的菌体按照上述方法，在Pd离子终浓度为0.5、1.0、1.5和2.0mM条件下，进行菌体吸附能力二次验证，实验2个重复。

实验结果如表5和图3所示，经过SSC值分选过的单菌落，其中5个单菌(具体分别命名为菌株1、菌株2、菌株3、菌株4和菌株5)的吸附能力相对于对照组菌株(未展示金属结合多肽片段的S.cerevisiae EBY100)的吸附能力均有提高，其中2号和3号菌的吸附能力在2.0mM的Pd离子浓度下，较对照组提高了32.2％和47.8％，达到414.3μM/g和463.0μM/g。同时，通过计算单个细胞下的金属离子吸附量可知(表5)，在2.0mM的初始Pd离子浓度下，筛选出的5个菌株，单细胞平均吸附的Pd离子数目较对照细胞分别提高了0.93、2.23、3.31、1.38和1.24×10⁹个。

结果表明：(1)通过基因工程手段表面展示特异性吸附金属离子的多肽能够有效提高酵母细胞的金属吸附能力；(2)通过流式细胞技术对单个细胞的吸附能力进行分析，能够有效的从文库中筛选出高吸附能力的菌株。

表5高吸附菌株吸附能力测定

需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本公开应不限于此。

以上已经描述了本公开的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

产业上的可利用性

本发明的金属吸附能力较强的微生物筛选方法可以在工业上被利用。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种检测微生物吸附金属离子能力的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> unsure

<223> n=a, c, g 或 t

<400> 1

gctagcatga ctggtggaca gnnngacnnn aacnnngacn nnttcnnnga cnnnnnngaa 60

nnnnnnnnnt gagtttaaac ccgctgatc 89

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcagcactg cataattctc t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgtccacca gtcatgctag c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agagaattat gcagtgctgc c 21