一种快速荧光检测铬含量的方法
阅读说明：本技术 一种快速荧光检测铬含量的方法 (Method for rapidly detecting chromium content by fluorescence ) 是由 杨健 黄丽娟 房晟忠 夏万永 李琳 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种快速荧光检测铬含量的方法,该方法是采用组胺、酪胺与荧光胺在pH=8的磷酸缓冲溶液中形成荧光衍生物,该衍生物在390nm激发波长下,在488nm处产生强荧光发射,利用衍生物的氮、羟基对Cr(Ⅵ)具有优良亲和力的特性,发生特异的络合作用,Cr(Ⅵ)诱导荧光信号猝灭,构建了铬的荧光探针,可用于样品中Cr(Ⅵ)的荧光检测；在碱性条件下,双氧水将Cr(Ⅲ)氧化成Cr(Ⅵ),可以对样品中进行总铬的测定,本发明方法可以进行铬的形态分析,方法检出限为0.05mg/kg,方法特异性强,其他金属离子无此现象；将本方法应用于环境食品中铬的检测,结果与相关国家标准测定方法相符；方法具有操作简单、灵敏度高、快速等特点。(The invention discloses a method for rapidly detecting chromium content by fluorescence, which is characterized in that histamine, tyramine and fluorescamine are adopted to form a fluorescence derivative in a phosphate buffer solution with the pH =8, the derivative generates strong fluorescence emission at 488nm under the excitation wavelength of 390nm, the characteristic that nitrogen and hydroxyl of the derivative have excellent affinity to Cr (VI) is utilized to generate specific complexation, and the Cr (VI) induces fluorescence signal quenching, so that a chromium fluorescence probe is constructed, and the method can be used for the fluorescence detection of Cr (VI) in a sample; under the alkaline condition, hydrogen peroxide oxidizes Cr (III) into Cr (VI), and the total chromium in a sample can be measured, the method can be used for carrying out morphological analysis on the chromium, the detection limit of the method is 0.05mg/kg, the method specificity is strong, and other metal ions do not have the phenomenon; the method is applied to the detection of chromium in environmental food, and the result conforms to the related national standard determination method; the method has the characteristics of simple operation, high sensitivity, high speed and the like.)
技术领域
本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种快速荧光检测铬含量的方法。
背景技术
铬广泛存在于大气、水体、沉积物及生物体内，铬（Cr）主要以Cr（Ⅲ）及Cr（Ⅵ）存在。铬在生物体内存在的积极意义和毒性大小与其存在的价态有关，Cr（Ⅲ）对于维持葡萄糖、脂质和蛋白质的代谢具有极大作用，是生物体必须的微量元素之一；而Cr（Ⅵ）却是一种对生物系统有毒性作用的元素，其毒性比Cr（Ⅲ）大100-1000倍。近年来，随着工业快速发展，人类活动的不断增加，水环境中铬污染大部分是由于大量废水被任意排放及固体残渣等废弃物所致。然而需要引起注意的是铬所造成的污染是很难被削减或降解的，一般是只能通过在不同的区域或不同环境中相互迁移，在此迁移过程中，由于环境条件的改变，铬会不可避免地发生一些形态或价态的改变，并且会由低浓度的铬逐渐富集成高浓度的铬，通过被食物链中不同级别的生物吸收，造成不同层次的蓄积，进而制约水产养殖业的发展，对人类健康造成无法预估的伤害。
目前，国家标准GB/T7467-1987《水质六价铬的测定 二苯碳酰二肼分光光度法》仅测定六价铬。荧光分析法具有灵敏度高、测定快速和可视化等特点，铬的荧光分析也有不少报道，涉及的荧光探针主要包括荧光量子点等。荧光胺本身与水解产物不显荧光，但与含有伯氨基的化合物(包括蛋白质、肽、氨基酸及其他各种多肽)分别生成类似的、具有强烈荧光性的化合物。利用荧光胺与组胺、酪胺形成的荧光衍生混合物，提高了对Cr（Ⅵ）的识别，相比于荧光胺与单一生物胺形成的衍生物，其特异性及稳定性都得到提高，主要由于Cr与两种荧光衍生物的形成化学键结合位点的特异性，而这也正是荧光分析需要解决的难点，即干扰的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种快速荧光检测铬含量的方法，该方法是采用组胺、酪胺与荧光胺在pH=8的磷酸缓冲溶液中形成荧光衍生物，该衍生物在390nm激发波长下，在488nm处产生强荧光发射，利用衍生物的氮、羟基对Cr（Ⅵ）具有优良亲和力的特性，发生特异的络合作用，Cr（Ⅵ）诱导荧光信号猝灭，构建了铬的荧光探针，可用于样品中Cr（Ⅵ）的荧光检测；在碱性条件下，双氧水将Cr（Ⅲ）氧化成Cr（Ⅵ），进行总铬含量的测定，该方法还可以进行铬的形态分析；本发明方法检出限为0.05mg/kg，方法特异性强，其他金属离子无此现象；将本方法应用于环境食品中铬的检测，结果与相关国家标准测定方法相符；方法具有操作简单、灵敏度高、快速等特点。
本发明快速荧光检测铬含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）Cr（Ⅵ）工作曲线制作
在5mL具塞比色管中加入50～100µL荧光探针、Cr（Ⅵ）标准溶液，混匀静置3～5min，用去离子水稀释到4mL，混匀，其中Cr（Ⅵ）在具塞比色管中的浓度范围在0.1～25mg/kg，在390nm激发波长下，488nm波长处测定荧光强度，以Cr（Ⅵ）浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程；
（2）样品预处理
a、水体样品经过0.22μm的滤膜除去不溶物制得；所述水体样品包括自来水、湖水、海水等；
b、土壤首先用丙酮洗涤两次，然后用水冲洗，然后在30～35℃下干燥，再称取1.0g干燥土壤，用90～110mL质量体积浓度63%的HNO3和40～60mL质量体积浓度30%的H2O2溶解，在150±5℃下反应1.5～2.5h，然后赶酸至近干，用0.22μm聚四氟乙烯滤膜除去不溶物，取滤液5mL，用水定容至50mL，作为土壤样品；
（3）总铬测定
取步骤（2）待测样品2mL，用0.1mol/L的NaOH调节pH=10～11，然后在待测样品中添加质量浓度25～35%的H2O2，反应20～30min后，加入50～100µL荧光探针，混匀静置3～5min，用去离子水稀释到4mL混匀，在390nm激发波长下，488nm波长处测定荧光强度，代入步骤（1）回归方程，计算样品中总铬含量；
所述H2O2的添加量为待测样品质量1～5%；
取步骤（2）待测样品2mL，加入50～100µL荧光探针，混匀静置3～5min，用去离子水稀释到4mL混匀，在390nm激发波长下，488nm波长处测定荧光强度，代入步骤（1）回归方程，计算获得样品中Cr（Ⅵ）含量，Cr（Ⅲ）含量为总铬含量与Cr（Ⅵ）含量的差值。
所述荧光探针是在组胺-酪胺混合液3～5mL中，加入质量体积浓度0.02%的荧光胺5～7mL、pH=8磷酸缓冲溶液3～5mL、去离子水1～3mL，涡旋混合1～2min，静置5～10min后制得；其中组胺-酪胺混合液是将浓度5mmol/L组胺溶液和浓度5mmol/L的酪胺溶液按体积比2:1～0.5的比例混合制得。
本发明的优点在于：
1、本发明利用荧光胺与组胺、酪胺形成的荧光衍生混合物，建立荧光探针检测平台，基于Cr（Ⅵ）对本发明建立的荧光探针具有选择性的猝灭作用，建立了高灵敏、选择性强的Cr（Ⅵ）检测新方法；
2、通过引入组胺、酪胺两种生物胺，形成的荧光衍生物增加了Cr（Ⅵ）结合的特异性，同时稳定性也得到提高；
3、本发明可以进行Cr的形态分析，对于评价铬的迁移特征有重要意义，同时方法操作简单，快速，灵敏，适于工业化生产和市场推广应用。
附图说明
图1为Cr（Ⅵ）对荧光探针产生猝灭的荧光光谱图；
图2为Cr（Ⅵ）对荧光探针产生猝灭的的线性回归方程；
图3为干扰实验结果，图中Blank为检测体系不添加任何物质。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：环境水样中Cr（Ⅵ）及Cr（Ⅲ）的测定
1、荧光探针的制备：取5mmol/L组胺溶液2mL与5mmol/L酪胺溶液1mL混合，然后加入质量体积浓度0.02%的荧光胺5mL、pH=8磷酸缓冲溶液3mL、去离子水1mL，涡旋混合1min，静置5min，得到荧光探针溶液；
2、Cr（Ⅵ）工作曲线制作：在5mL具塞比色管中加入100µL荧光探针、Cr（Ⅵ）标准溶液，混匀静置3min，用去离子水稀释到4mL，混匀，其中Cr（Ⅵ）在具塞比色管中的浓度范围在0.1～25mg/kg ，在390nm激发波长下，488nm波长处测定荧光强度，Cr（Ⅵ）标准溶液的荧光光谱见图1，以Cr（Ⅵ）浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围等见表1、图2；
表1线性方程、相关系数、相对标准偏差、线性范围
；
3、环境水样中Cr（Ⅵ）及Cr（Ⅲ）含量的测定
（1）Cr（Ⅵ）含量测定：取通过0.22μm的滤膜处理的湖泊水样2mL，置于5mL具塞比色管中，加入100µL荧光探针，混匀静置3min，用去离子水稀释到4mL，混匀，在390nm激发波长下，488nm波长处测定荧光强度，代入步骤2的回归方程中，计算样品Cr（Ⅵ）含量为0.15mg/kg；
（2）总铬含量以及Cr（Ⅲ）的测定：取通过0.22μm的滤膜处理的湖泊水样2mL，用0.1mol/L的NaOH调节pH10～11，然后在待测样品中添加质量浓度25%的H2O2100µL，反应25min，加入100µL荧光探针，混匀静置3min，用去离子水稀释到4mL，混匀，在390nm激发波长下，488nm波长处测定荧光强度，代入步骤2回归方程，计算样品总铬含量为0.41mg/kg，Cr（Ⅲ）含量为0.26mg/kg；
（3）回收率与精密度实验：在水样中分别添加3个不同浓度的Cr（Ⅵ）标准溶液；每个浓度平行测定3次，计算加标回收率，并计算出相对标准偏差RSD，结果见表2；测得Cr（Ⅵ）的加标回收率在98.2％～101.6％，RSD在1.01％～1.68％，本方法具有好的准确性和精密度；
表2 样品Cr（）加标回收率及RSD（n = 3）
；
（4）方法特异性考察：将浓度为10mg/kg的可能干扰物质替换浓度为1mg/kg的Cr（Ⅵ），用于验证本发明检测体系的特异性，图3为Cr3+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Ni2+等对荧光信号猝灭的影响结果，结果显示，只有Cr（Ⅵ）诱导荧光信号猝灭，Cr（Ⅵ）对荧光探针体系有较好的选择特异性；
（5）有证标准物质的分析，利用本发明方法进行标准物质中心购买的总铬和Cr（Ⅵ）标准测定，结果见表3；
表3有证标准物质的分析结果
。
实施例2：土壤中Cr（Ⅵ）及Cr（Ⅲ）的测定
1、荧光探针的制备
取5mmol/L组胺溶液3mL与5mmol/L酪胺溶液1mL混合，然后加入质量体积浓度0.02%的荧光胺6mL、pH=8磷酸缓冲溶液4mL、去离子水2mL，涡旋混合2min，静置8min，得到荧光探针溶液；
2、Cr（Ⅵ）工作曲线制作同实施例1；
3、土壤样品中Cr（Ⅵ）及Cr（Ⅲ）含量的测定
（1）样品处理：称取5g土壤先用50mL 丙酮洗涤两次，然后用水冲洗，并在30℃下干燥，再称取1.0g干燥土壤，用100mL HNO3( 63%，m/v)和50mL H2O2 ( 30%，m/v)溶解，在150±5℃下反应2h，然后赶酸至近干，用0.22μm聚四氟乙烯滤膜除去不溶物，取滤液5mL，用水定容至50mL，作为土壤样品溶液；
（2）Cr（Ⅵ）含量测定：取步骤（1）样品溶液2mL，置于5mL具塞比色管中，加入100µL荧光探针，混匀静置4min，用去离子水稀释到4mL，混匀，在390nm激发波长下，488nm波长处测定荧光强度，代入步骤2回归方程，计算样品Cr（Ⅵ）含量为111.5 mg/kg；
（3）总铬含量及Cr（Ⅲ）的测定：取步骤（1）样品溶液2mL，用0.1mol/L的NaOH调节pH10-11，加入质量浓度30%的H2O2 100µL，反应30min，加入100µL荧光探针，混匀静置4min，用去离子水稀释到4mL，混匀，在390nm激发波长下，488nm波长处测定荧光强度，代入步骤2回归方程，计算样品总铬含量为321.9mg/kg，Cr（Ⅲ）含量为210.4 mg/kg。
实施例3：自来水样品中铬含量的测定
1、荧光探针的制备
取5mmol/L组胺溶液4mL与5mmol/L酪胺溶液1mL混合，然后加入质量体积浓度0.02%的荧光胺7mL，pH=8磷酸缓冲溶液5mL、去离子水1.5mL，涡旋混合1min，静置10min，得到荧光探针溶液；
2、Cr（）工作曲线制作：同实施例1；
3、自来水中Cr（Ⅵ）及Cr（Ⅲ）含量的测定：操作同实施例1，未检出Cr（Ⅵ）及Cr（Ⅲ）；
本发明建立的Cr（）及Cr（）含量测定法具有操作简单、灵敏度高、快速等特点，不需要大型仪器设备，在实际检测中具有较强优势。
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