一种草甘膦快速间接检测方法
阅读说明：本技术 一种草甘膦快速间接检测方法 (Rapid indirect detection method for glyphosate ) 是由 徐梦蕾 韩晓霞 赵冰 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种草甘膦快速间接检测方法,其方法为：步骤一、样品中草甘膦残留的提取液的制备；步骤二、提取液的净化；步骤三、茚三酮工作液的配制；步骤四、提取液的衍生；步骤五、Ag NPs的制备；步骤六、衍生液的测定；步骤七、草甘膦含量的计算；有益效果：反应条件温和易于控制,衍生过程简单,所需设备少,步骤简单,易于操作等优点；用量少,方法灵敏度高,快速简单,具有较高的实际应用和推广价值；选用茚三酮作为显色剂、Ag NPs作为光谱增强试剂,具有提高灵敏度,降低检出限的优点。(The invention discloses a rapid indirect detection method of glyphosate, which comprises the following steps: step one, preparing an extracting solution of glyphosate residues in a sample; step two, purifying the extracting solution; step three, preparing ninhydrin working solution; step four, derivation of the extracting solution; step five, preparing Ag NPs; step six, measuring the derivative liquid; step seven, calculating the content of glyphosate; has the advantages that: the reaction condition is mild and easy to control, the derivatization process is simple, the required equipment is less, the steps are simple, the operation is easy, and the like; the method has the advantages of small using amount, high sensitivity, rapidness and simplicity, and higher practical application and popularization values; ninhydrin is used as a color developing agent, and Ag NPs is used as a spectrum enhancing reagent, so that the method has the advantages of improving sensitivity and reducing detection limit.)
技术领域
本发明属于农药快速检测技术领域，特别涉及一种草甘膦快速间接检测方法。
背景技术
目前，草甘膦(Glyphosate)是全球生产和使用量最大、使用时间最长的除草剂品种，约占据全球除草剂30％的市场份额，广泛用于农田各种杂草的除防。随着抗草甘膦作物的培育成功，草甘膦的用量逐年递增。文献报道草甘膦具有广泛的生殖毒性、诱突变性等一些环境激素效应，可以通过环境中的水体、土壤等进入到食品中，对人体健康构成危害。草甘膦被世界卫生组织旗下的国际癌症研究机构列入2A类致癌物清单，是很可能致癌的物质。因此，在国内外环境、食品、土壤等领域农药残留检测中，草甘膦残留分析是重要的检测内容。
草甘膦现有的检测方法主要分为直接检测方法和间接检测方法两大类。其中，直接检测方法主要是离子色谱法，采用离子色谱法不需要对草甘膦进行衍生化，但是对仪器条件要求较高，检测成本昂贵，没有得到普遍的推广。草甘膦的间接检测方法包括仪器分析方法和快速检测方法。其中间接检测的仪器分析方法包括气相色谱及其与质谱(GC-MS)联用技术、液相色谱及其与质谱(LC-MS)联用技术。在GC-MS法中，草甘膦分子溶于水，且具有极性大、不易挥发的特点，样品需要在-40℃至-60℃与三氟乙酸酐、七氟丁醇混合物混合冷却，并在90℃的条件下衍生，通过分析衍生物的含量间接获得草甘膦的含量。在LC-MS法中，由于草甘膦化合物结构中无特征的吸收峰不具有可以被荧光检测的官能团，同样需要采取柱前与9-芴基甲基三氯甲烷过夜衍生，通过分析衍生物的含量间接获得草甘膦的含量。但存在衍生化过程繁琐、耗时且柱后生成物不稳定，衍生试剂对人体有害的问题。草甘膦间接检测的快速分析方法包括多孔过氧化物酶活性抑制法、草甘膦受体识别法等。其中，多孔过氧化物酶活性抑制法基于草甘膦对Co3O4作为H2O2水解酶活性的抑制作用，当草甘膦存在时，H2O2不能水解，作为显色剂的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺不能被氧化为蓝色，通过颜色间接判断草甘膦的含量。草甘膦受体识别法通过草甘膦受体蛋白质与草甘膦识别，并标记上荧光蛋白显色的方法，实现对草甘膦的间接检测。
以上各种检测方法中直接检测方法存在仪器设备昂贵、对人员专业技术要求高、检测成本高等问题；间接检测方法中，仪器分析方法存在前期处理复杂、衍生化条件苛刻等问题，快速检测方法中存在灵敏度不高、受体蛋白制备困难等问题。因此，建立更加简便、快速、准确、经济的新的检测方法成为草甘膦检测迫切需要解决的重要问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的草甘膦检测方法中仪器分析方法普遍存在的设备昂贵、前期处理复杂、衍生化条件苛刻、对人员专业技术要求高，以及快速检测方法中不够灵敏、检测成本高等问题，而提供的一种草甘膦快速间接检测方法。
本发明提供的草甘膦快速间接检测方法，其方法如下所述：
步骤一、样品中草甘膦残留的提取液的制备：采用溶剂浸提、超声提取草甘膦残留，离心获得上清液备用，针对不同液体样品，采用正己烷或二氯甲烷有机溶剂去除有机物，离心获得上清液作为提取液备用。
样品提取液的制备至关重要，针对不同的样品基质，需要采用不同的方法去除影响检测结果的蛋白质、油脂等。针对土壤样品，利用磷酸钠和柠檬酸钠去除有机物；针对食品样品，利用二氯甲烷去除有机物。
1)针对土壤样品，一份用于测定干物质的含量，即在高温条件下烘至恒重，以烘干前后的土壤样品质量差值计算干物质和水分的含量；另一份采用离心去除水分后，加入磷酸钠和柠檬酸钠混合，超声提取提取草甘膦残留，离心获得上清液用滤纸过滤，作为提取液备用。
2)针对固体食品样品，采用水浸提，再加入二氯甲烷，振荡后离心，取水层；残渣再加入水重复浸提，合并两次上清液，作为提取液备用。
3)针对液体食品样品，加入少量盐酸，离心后取上清液，再加入二氯甲烷，振荡后离心，取上清液水层，作为提取液备用。
4)针对水体样品，可不经过提取，直接进行步骤二中的净化操作。
步骤二、提取液的净化：利用有机溶剂萃取步骤一中上清液中有机物，并除去有机相，涡旋振荡后离心取上清液，经过CAX小柱的净化，用滤膜过滤，得到净化后的提取液备用。
样品提取液的净化同样重要，土壤样品提取液需要经过正己烷除去有机物；食品样品提取液需要再经过CAX小柱的净化；所有样品均需要滤膜过滤。
1)针对土壤样品提取液，加入少量浓盐酸，静置后用滤纸过滤得到上清液；加入正己烷，振荡后静置，弃去有机相；水相用正己烷再萃取一次，并用滤膜过滤，得到净化后的提取液待衍生。
2)针对食品样品提取液，利用活化后CAX小柱净化，并用CAX洗脱液淋洗并收集，减压旋转蒸发近干，加入少量水溶解残渣，用滤膜过滤，得到净化后的提取液待衍生。
3)针对水体样品，静置后用滤纸过滤得到上清液，用滤膜过滤净化，得到净化后的提取液备用。
步骤三、茚三酮工作液的配制：茚三酮工作液由茚三酮、水、醋酸-醋酸钠缓冲液组成，茚三酮、水和醋酸缓冲液的体积比为1：1：1-3：1：1，其中，茚三酮浓度为5％，醋酸-醋酸钠缓冲液浓度为0.4mol·L-1，pH值为5.5；
缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液，醋酸缓冲液对调节反应体系pH值至关重要，是后续与茚三酮反应的关键控制环节。缓冲液使用量过少，不足以起到维持pH稳定的效果；缓冲液使用量过多，增加反应溶液体积，降低反应灵敏度。因此缓冲溶液为0.4mol·L-1醋酸-醋酸钠，茚三酮工作液为5％茚三酮、水与0.4mol·L-1醋酸-醋酸钠缓冲溶液的混合溶液。
步骤四、提取液的衍生：取步骤二中净化后得到的提取液，加入步骤三中的茚三酮工作液，再加入钼酸钠作为催化剂，提取液、茚三酮工作液和钼酸钠溶液的体积比为1：1：1-3：1：1，钼酸钠溶液浓度为1％-10％，在80-100℃的条件下，衍生时间为20-40min，得到类似罗曼紫的物质，类似罗曼紫的物质紫外吸收峰在560-600nm之间；
草甘膦与茚三酮反应进行结果显示，草甘膦农药残留量与衍生的罗曼紫物质在一定程度上呈线性关系，茚三酮的量应满足通常草甘膦的测定范围，过少的量不足以满足测定的需要，过多的量会形成基质干扰并使标准曲线弯曲，影响检验结果准确性。
步骤五、Ag NPs的制备：AgNO3分散在超纯水中，加热沸腾后加入柠檬酸钠，温度降低后，得到灰绿色胶体，冷却至室温备用，Ag NPs的紫外吸收峰在400nm-450nm之间，颗粒大小大于或小于或等于60nm；
步骤六、衍生液的测定：吸取步骤四中衍生后的提取液，加入步骤五中的Ag NPs，Ag NPs与类似罗曼紫物质的重量百分比为1：1-3：1，利用紫外可见分光光度计检测560-600nm之间吸光度；
步骤七、草甘膦含量的计算：利用空白样品建立标准曲线，并计算草甘膦的含量，按照以下公式(1)和(2)计算：
土壤样品由于水分的影响，还需要进一步的计算：
其中w1为土壤样品中草甘膦的浓度，单位mg/kg；
ρ为标准曲线计算所得的草甘膦浓度，单位μg/L；
Vs为新鲜土壤样品的含水量，单位mL；
V1为提取液体积，单位mL；
m为样品湿重，单位g；
wdm为土壤样品中的干物质含量，单位％。
本发明中Ag NPs为紫外-可见吸收光谱增强试剂。Ag NPs通过其局域表面等离子体效应，增强草甘膦衍生来的类似罗曼紫物质的吸收峰，达到提高灵敏度，降低检出限的目的。
本发明的检测原理如下：
本发明首先提取固体样品或者液体样品中残留的草甘膦，经过适当的净化后利用茚三酮工作液进行衍生，得到类似罗曼紫的物质后加入Ag NPs增强紫外可见光谱的吸收，并进行光谱测定。在适当的反应条件下，草甘膦与茚三酮会发生反应并显色，Ag NPs增强峰的强度，通过紫外可见光谱的测定以及标准曲线的建立，计算草甘膦的含量。
本发明的检测流程依次为：样品中草甘膦残留的提取液的制备、提取液的净化、茚三酮工作液的配制、提取液的衍生以及衍生液的测定。
本发明的有益效果：
本发明提供的草甘膦快速间接检测方法，首先针对不同样品提取草甘膦，进行提取、净化等步骤，然后将草甘膦与茚三酮工作液在钼酸钠催化下进行反应，得到类似罗曼紫的物质，加入AgNPs增加物质的紫外可见吸收光谱的吸光度，起到提高灵敏度、降低检出限的作用，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明相比直接检测方法具有反应速度快，反应条件温和易于控制，衍生过程简单，所需设备少，步骤简单，易于操作等优点；
(2)本发明相比间接检测方法具有试剂成本低，用量少，方法灵敏度高，快速简单，具有较高的实际应用和推广价值；
(3)本发明所选用茚三酮作为显色剂、Ag NPs作为光谱增强试剂，具有提高灵敏度，降低检出限的优点。
附图说明
图1为本发明所述Ag NPs增强草甘膦与茚三酮反应衍生物紫外-可见吸收峰强度示意图。
图2为本发明所述草甘膦间接检测方法标准曲线示意图。
具体实施方式
请参阅图1和图2所示：
本发明提供的草甘膦快速间接检测方法中，检测波长范围为560-580nm，能够检测1.00×10-8mol·L-1草甘膦。
具体方法如下所述：
实施例一、试剂的配制以及仪器条件：
步骤一、茚三酮工作液的配制：
茚三酮工作液由5％茚三酮、水、醋酸-醋酸钠缓冲液(0.4mol·L-1，pH值为5.5)组成，茚三酮、水和醋酸缓冲液的体积比为1：1：1-3：1：1。
步骤二：空白样品与茚三酮工作液、钼酸钠混合溶液的制备及加热处理：
空白样品、茚三酮工作液、钼酸钠的体积比为1：1：1-3：1：1。在80-100℃的条件下，加热20-40min，溶液冷却后溶液颜色没有变化。
步骤三：Ag NPs的制备：
36mg AgNO3分散在200mL超纯水中，加热沸腾后加入适量柠檬酸钠(1％，4mL)，颜色开始变化后温度保持在85℃，40min后得到灰绿色胶体，冷却至室温备用。本发明中AgNPs的紫外吸收峰在400nm-450nm之间，颗粒直径在60nm左右。
步骤四：空白样品与茚三酮工作液、钼酸钠混合溶液的光谱测定：
Ag NPs加入至空白样品、茚三酮工作液、钼酸钠混合溶液中，利用Perkinelmer公司的lambda1050+型紫外-可见吸收光谱仪测定光谱，在560-580nm没有明显的吸收峰。
实施例二、草甘膦标准品的测定及标准曲线建立：
步骤一：草甘膦标准品与茚三酮工作液、钼酸钠混合溶液的制备及衍生处理：
配制不同浓度的草甘膦溶液(1.0×10-9-1.0×10-4mol·L-1)，分别均与茚三酮工作液、钼酸钠混合，在80-100℃的条件下，加热20-40min，衍生为不同深浅的类似罗曼紫的物质。
步骤二：光谱测定：
Ag NPs加入至不同浓度草甘膦的衍生溶液中，利用Perkinelmer公司的lambda1050+型紫外-可见吸收光谱仪测定560-580nm的吸收峰，如图1所示。。
步骤三：标准曲线的建立：
根据草甘膦浓度的常用对数值与扣除空白的吸光度值建立线性的标准曲线。如图2所示。
实施例三、检测土壤样品中草甘膦残留：
步骤一、土壤样品中草甘膦残留的提取液的制备：
准确称取2份新鲜土壤样品，一份用于干物质含量测定，另外一份(干物质含量大于10g)用于草甘膦含量。新鲜土壤样品经离心去除水分后，加入50.0mL磷酸钠和柠檬酸钠混合，超声提取30min，8000-12000r/min离心5min，取上清液用滤纸过滤。
步骤二、提取液的净化：
加入少量浓盐酸，静置10min后用滤纸过滤得到上清液；加入50mL正己烷，振荡后静置，弃去有机相，水相用50mL正己烷再萃取一次，水相用0.45μM滤膜过滤，得到净化后的提取液待衍生。
步骤三、提取液的衍生：
取300μL-900μL净化后的土壤提取液，加入300μL茚三酮工作液，加入300μL钼酸钠作为催化剂，在80-100℃，衍生时间为20-40min。
步骤四、空白样品的测定
用石英砂代替样品，按照与试样的提取、净化、衍生相同的步骤进行空白试样的制备。
步骤五、衍生液的测定：
准确吸取500μL衍生化后的提取液，加入适量Ag NPs，利用紫外可见分光光度计检测吸光度，利用空白样品建立标准曲线，并计算草甘膦的含量。
步骤六、草甘膦含量的计算：
(1)新鲜土壤样品的含水量，按照公式3计算：
其中Vs为新鲜土壤样品的含水量，mL；
m为样品质量(湿重)，g；
wdm为土壤样品中干物质的含量，％；
ρH2O为20℃时水的密度，g/mL。
(2)土壤样品中草甘膦的浓度(mg/kg)按照公式2计算
表1土壤中草甘膦含量测定
样品
草甘膦含量
土壤样品
未检出
空白样品
未检出
(3)添加回收率实验结果如下表：
表2土壤中草甘膦含量添加回收率测定
加标浓度(mg/kg)
草甘膦回收率
0.5
79.2-85.3％
2
75.6-90.6％
5
85.4-90.2％
实施例四、检测茶叶样品(固体)中草甘膦残留：
步骤一、样品中草甘膦残留的提取液的制备：
取代表性样品约200g，粉碎后过2.0mm的筛，准确称取5g均匀茶叶样品，加入100mL水提取30min，再加入50mL二氯甲烷，振荡20min后离心，取水层备用。残渣再加入50mL水重复提取，合并两次提取液待净化。
步骤二、提取液的净化：
CAX小柱经10mL水活化后，加入0.1mL提取液，用CAX洗脱液(160mL水+2.7mL盐酸+40mL甲醇)淋洗2次，再用11mL CAX洗脱液洗脱并收集，洗脱液于45℃减压旋转蒸发近干，加入1mL水溶解残渣，用0.45μM滤膜过滤，得到净化后的提取液待衍生。
步骤三、提取液的衍生：
取300μL-900μL净化后的水样品，加入300μL茚三酮工作液，加入300μL钼酸钠作为催化剂，在80-100℃，衍生时间为20-40min。
步骤四、空白样品的测定
用超纯水代替样品，按照与试样的提取、净化、衍生相同的步骤进行空白试样的制备。
步骤五、衍生液的测定：
准确吸取500μL衍生化后的提取液，加入适量Ag NPs，利用紫外可见分光光度计检测吸光度，利用空白样品建立标准曲线，并计算草甘膦的含量。
步骤六、草甘膦含量的计算：
(1)茶叶中草甘膦的浓度(mg/kg)按照公式2计算
表3茶叶中草甘膦含量测定
样品
草甘膦含量
茶叶样品
未检出
空白样品
未检出
(2)添加回收率实验结果如下表：
表4茶叶中草甘膦含量添加回收率测定
实施例五、检测牛奶中的草甘膦残留：
步骤一、样品中草甘膦残留的提取液的制备：
量取20.0mL牛奶样品，加入100μL盐酸，离心后取上清液，加入15mL二氯甲烷，振荡20min后离心，取上清液水层，作为提取液备用。
步骤二、提取液的净化：
CAX小柱经10mL水活化后，加入0.1mL提取液，用CAX洗脱液(160mL水+2.7mL盐酸+40mL甲醇)淋洗2次，再用11mL CAX洗脱液洗脱并收集，洗脱液于45℃减压旋转蒸发近干，加入1mL水溶解残渣，用0.45μM滤膜过滤，得到净化后的提取液待衍生。
步骤三、提取液的衍生：
取300μL-900μL净化后的水样品，加入300μL茚三酮工作液，加入300μL钼酸钠作为催化剂，在80-100℃，衍生时间为20-40min。
步骤四、空白样品的测定
用超纯水代替样品，按照与试样的提取、净化、衍生相同的步骤进行空白试样的制备。
步骤五、衍生液的测定：
准确吸取500μL衍生化后的提取液，加入适量Ag NPs，利用紫外可见分光光度计检测吸光度，利用空白样品建立标准曲线，并计算草甘膦的含量。
步骤六、草甘膦含量的计算：
(1)牛奶中草甘膦的浓度(mg/kg)按照公式2计算
表5牛奶中草甘膦含量测定
样品
草甘膦含量
牛奶样品
未检出
空白样品
未检出
(2)添加回收率实验结果如下表：
表6牛奶中草甘膦含量添加回收率测定
加标浓度(mg/kg)
草甘膦回收率
0.5
75.3-85.3％
2
81.2-90.1％
5
85.4-95.7％
实施例六、检测水样品中的草甘膦残留：
水样品不需要提取，直接进行净化步骤即可。
步骤一、水样品的净化
静置10min后用滤纸过滤得到上清液，用0.45μM滤膜过滤，得到净化后的水提取液备用。
步骤二、提取液的衍生：
取300μL-900μL净化后的水样品，加入300μL茚三酮工作液，加入300μL钼酸钠作为催化剂，在80-100℃，衍生时间为20-40min。
步骤三、空白样品的测定
用超纯水代替样品，按照与试样的提取、净化、衍生相同的步骤进行空白试样的制备。
步骤四、衍生液的测定：
准确吸取500μL衍生化后的提取液，加入适量Ag NPs，利用紫外可见分光光度计检测吸光度，利用空白样品建立标准曲线，并计算草甘膦的含量。
步骤五、草甘膦含量的计算：
(1)水中草甘膦的浓度(mg/kg)按照公式2计算
表7谁中草甘膦含量测定
样品
草甘膦含量
水样品
未检出
空白样品
未检出
(2)添加回收率实验结果如下表：
表8水中草甘膦含量添加回收率测定
加标浓度(mg/kg)
草甘膦回收率
0.5
85.3-95.3％
2
90.5-95.3％
5
92.4-98.8％