一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型的方法
阅读说明：本技术 一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型的方法 (Method for identifying plasmid type carried by bacterial population based on bacterial genome high-throughput sequencing data ) 是由 赵月峨 周冬生 王鹏 殷喆 赵晓冬 胡凌飞 吴妮尔 于 2021-11-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型的方法。该方法通过对细菌的若干菌株高通量测序数据进行分析和数据拼接,对其所包含的质粒进行鉴定和分型。本发明可在短时间内对大量细菌测序数据进行分析,获得其中包含的质粒类型、耐药/毒力基因等。本发明可作为传统实验室鉴定生物实验的有益补充,达到快速鉴定质粒的目的。本发明具有重要的应用价值。(The invention discloses a method for identifying types of plasmids carried by a bacterial population based on bacterial genome high-throughput sequencing data. The method is used for identifying and typing plasmids contained in the bacteria by analyzing and splicing high-throughput sequencing data of a plurality of bacterial strains. The invention can analyze a large amount of bacteria sequencing data in a short time to obtain the plasmid types, drug resistance/virulence genes and the like contained in the bacteria sequencing data. The invention can be used as a beneficial supplement of the traditional laboratory identification biological experiment, and achieves the purpose of quickly identifying the plasmid. The invention has important application value.)
技术领域
本发明属于生物信息学，具体涉及一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型的方法，尤其涉及通过结合现有目标菌已发现的质粒序列和类型，对该种细菌的所有高通量测序数据进行分析和数据拼接，对其所包含的质粒进行鉴定和分型的方法。
背景技术
质粒是指在细胞的染色体或核区DNA之外、能够自主复制的DNA分子。一种细菌细胞中存在一种或者多种质粒类型。质粒是细菌中重要的功能原件，本身可携带耐药或毒力基因（如对炭疽杆菌毒性起决定性作用的质粒pXO1和pXO2、大肠杆菌中含有的耐四环素基因的质粒）。质粒可在细菌不同菌株间进行转移，在此过程中，可实现细菌中耐药和毒力基因的水平转移，赋予细胞额外的生理代谢能力，提高它的致病力。弄清细菌种群中的质粒类型和数量，对研究细菌耐药和毒力特性、防控细菌感染和进一步传播具有重要作用。
高通量测序技术可以短时间内获得大量细菌基因组数据，这对系统研究细菌种群中质粒类型及其分布提供了条件和挑战。如何从海量细菌基因组高通量测序数据中鉴定细菌种群携带的质粒类型、特性和分布情况，是亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是鉴定细菌种群携带的质粒类型及耐药基因和/或毒力基因是否位于质粒上。
本发明首先保护一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型及耐药基因和/或毒力基因是否位于质粒上的方法，可包括如下步骤：
（c1）分别对细菌的不同菌株的基因组高通量测序数据进行拼接，获得菌株的拼接序列；
（c2）完成步骤（c1）后，分别将不同菌株的拼接序列与质粒数据库进行比对，获得含有质粒复制子的拼接序列；根据质粒复制子获得质粒类型，即细菌种群携带的质粒类型；
（c3）完成步骤（c1）后，分别将不同菌株的拼接序列与耐药基因数据库和/或毒力基因数据库进行比对，获得含有耐药基因和/或毒力基因的拼接序列；
（c4）将质粒复制子的reads覆盖深度除以耐药基因和/或毒力基因的reads覆盖深度，得到reads覆盖深度比；之后进行如下判断：如果reads覆盖深度比在0.90以上且1.10以下，则耐药基因和/或毒力基因在质粒上；否则耐药基因和/或毒力基因不在质粒上；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型的方法，可包括如下步骤：
（a1）分别对细菌的不同菌株的基因组高通量测序数据进行拼接，获得菌株的拼接序列；
（a2）完成步骤（a1）后，分别将不同菌株的拼接序列与质粒数据库进行比对，根据质粒复制子获得质粒类型，即细菌种群携带的质粒类型；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群中耐药基因和/或毒力基因是否位于质粒上的方法，可包括如下步骤：
（b1）分别对细菌的不同菌株的基因组高通量测序数据进行拼接，获得菌株的拼接序列；
（b2）完成步骤（b1）后，分别将不同菌株的拼接序列与质粒数据库进行比对，获得含有质粒复制子的拼接序列；
（b3）完成步骤（b1）后，分别将不同菌株的拼接序列与耐药基因数据库和/或毒力基因数据库进行比对，获得含有耐药基因和/或毒力基因的拼接序列；
（b4）将质粒复制子的reads覆盖深度除以耐药基因和/或毒力基因的reads覆盖深度，得到reads覆盖深度比；之后进行如下判断：如果reads覆盖深度比在0.90以上且1.10以下，则耐药基因和/或毒力基因在质粒上；否则耐药基因和/或毒力基因不在质粒上；
所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护上述任一所述方法在鉴定细菌是否含有质粒或细菌含有的质粒类型中的应用；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
本发明还保护上述任一所述方法在鉴定细菌的耐药性和/或毒力中的应用；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
上述应用中，细菌基因组含有耐药基因即细菌具有耐药性。
上述应用中，细菌基因组含有毒力基因即细菌具有相应的毒力。
本发明还保护上述任一所述方法在鉴定细菌质粒是否含有耐药基因和/或毒力毒力中的应用；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
上述任一所述细菌可为普罗维登斯菌。
上述任一所述质粒数据库可为质粒数据库Plasmidfinder。
上述任一所述耐药基因数据库可为耐药基因数据库Resfinder。
上述任一所述毒力基因数据库可为毒力基因数据库VFDB。
上述任一所述耐药基因为blaNDM和/或blaIMP。
上述任一所述质粒类型为IncC、IncpGZH766-NDM、IncFIIp911012-NDM、IncpPrY2001或IncW。
在本发明的一个实施例中，采用上述方法检测257株普罗维登斯菌。结果表明，这257株普罗维登斯菌含有的质粒包括IncC、IncpGZH766-NDM、IncFIIp911012-NDM、IncpPrY2001、IncW五种质粒类型，含有的耐药基因有两种、分别为blaNDM和blaIMP。
本发明建立了一种基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型的方法，可在短时间内对大量细菌测序数据进行分析，获得其中包含的质粒类型、耐药/毒力基因等。本发明可作为传统实验室鉴定生物实验的有益补充，达到快速鉴定质粒的目的。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型及目标基因是否位于质粒上的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型及目标基因是否位于质粒上的方法的建立
本发明的发明人经过大量实验，着眼于细菌基因组高通量测序数据，结合公共数据库已有的质粒序列资源，采用生物信息学手段，建立了基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型及目标基因（毒力基因和/或耐药基因）是否位于质粒上的方法。具体步骤如下：
1、对细菌基因组高通量测序数据进行拼接，获得细菌的拼接序列。
2、完成步骤1后，将细菌的拼接序列与质粒数据库（包括公共数据库和实验室收集整理的数据库）进行比对，获得含有质粒复制子的拼接序列；分析含有质粒复制子的拼接序列，获得细菌的拼接序列中含有的质粒类型，即细菌种群携带的质粒类型。
3、完成步骤1后，将细菌的拼接序列分别与耐药基因数据库和毒力基因数据库（包括公共数据库和实验室收集整理的数据库）进行比对，获得含有耐药基因和/或毒力基因的拼接序列；定位耐药基因和/或毒力基因所在序列。
4、将质粒复制子的reads覆盖深度除以耐药基因和/或毒力基因的reads覆盖深度，得到reads覆盖深度比。之后进行如下判断：如果reads覆盖深度比在0.90以上且1.10以下，则耐药基因和/或毒力基因在质粒上；否则耐药基因和/或毒力基因不在质粒上。
基于细菌基因组高通量测序数据鉴定细菌种群携带的质粒类型及目标基因是否位于质粒上的流程示意图见图1。
实施例2、实施例1建立的方法的应用
已有研究表明，普罗维登斯菌可以形成7个复合群，分别为S01-S07。本发明的发明人从来自中国12个省市自治区的36家医院获得257株普罗维登斯菌。
257株普罗维登斯菌的基本信息（包括菌株名称、取样地点、年份、年龄、性别、标本、疾病和科室）见表1。
1、普罗维登斯菌的拼接序列的获得
（1）将普罗维登斯菌进行高通量测序，之后过滤（目的为质量控制），获得高质量测序数据，即普罗维登斯菌基因组高通量测序数据。
共检测257株普罗维登斯菌，获得257株普罗维登斯菌的基因组高通量测序数据。
（2）使用Spades软件分别对257株普罗维登斯菌的基因组高通量测序数据进行拼接，获得257株普罗维登斯菌的拼接序列。
2、完成步骤1后，将257株普罗维登斯菌的拼接序列的数据作为query，搜索质粒数据库Plasmidfinder，根据rep基因（质粒复制子）获得质粒类型；并记录rep基因所在contig（记为contig_rep）。
3、完成步骤1后，将257株普罗维登斯菌的拼接序列的数据作为query，搜索耐药基因数据库Resfinder和毒力基因数据库VFDB，记录耐药基因和/或毒力基因所在contig（记为contig_gene）。
4、根据公式1获得contig_rep的reads覆盖深度；contig_repreadsdepth=num（reads）×len(reads)/ len(contig_rep)（公式1）；
其中，contig_repreadsdepth为contig_rep的reads覆盖深度，num（reads）为reads的条数，len(reads)为测序reads的平均长度，len(contig_rep)为rep基因所在contig的长度。
5、根据公式2获得contig_gene的reads覆盖深度；contig_genereadsdepth= num（reads）×len(reads)/ len（contig_gene）（公式2）；
其中，contig_genereadsdepth为contig_gene的reads覆盖深度，num（reads）为reads的条数，len(reads)为测序reads的平均长度，len（contig_gene）为除rep基因外的基因所在contig的长度。
6、完成步骤4和5后，将contig_rep的reads覆盖深度除以contig_gene的reads覆盖深度，得到reads覆盖深度比；进行如下判断：如果reads覆盖深度比在0.90以上且1.10以下，则耐药基因和/或毒力基因在质粒上；否则耐药基因和/或毒力基因不在质粒上。
检测结果见表2。结果表明，257株普罗维登斯菌属于5个复合群；257株普罗维登斯菌含有的质粒包括IncC、IncpGZH766-NDM、IncFIIp911012-NDM、IncpPrY2001、IncW五种质粒类型，含有的耐药基因有两种、分别为blaNDM和blaIMP；大部分质粒都位于普罗维登斯菌SP01上，IncC型质粒在所有普罗维登斯菌中广泛存在。
常规方法检测细菌中含有的质粒类型和耐药基因，需要先进行三代测序获得环化的质粒全序列，之后再判断质粒类型及耐药基因搜索比对。该过程不仅为繁琐，而且耗时且价格昂贵。本发明基于较为便宜的二代测序数据，无需获得质粒全序列，通过reads特征即可判断出质粒类型及其含有的耐药基因，简便易操作，也更经济。由此可见，本发明提供的方法具有重要的应用价值。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。