具体实施方式

下面，根据情况参考附图，针对本发明的实施方式详细地进行说明。需要说明的是，附图中，对相同或相当部分赋予相同或对应的附图标记，省略重复的说明。需要说明的是，各图中的尺寸比存在为了说明而进行夸张的部分，并不必然与实际的尺寸比一致。

[操作细胞的方法(第1实施方式)]

在一个实施方式中，本发明提供了细胞操作方法，所述方法包括：在液体中培养细胞的工序；将能够导入气体的流路配置于上述液体中的工序；于上述流路的端部形成气泡的工序；和使上述细胞附着于上述气泡的工序。本实施方式的方法也可以称为使在固相的表面培养的贴壁细胞从上述固相脱落的方法，所述方法包括使气体与液体的界面与在固相的表面培养的上述贴壁细胞接触，并使上述界面沿着上述表面移动。

在实施例中，如下文所述，本申请的发明人发现，利用本实施方式的方法，无需使用蛋白质分解酶等，就能使贴壁细胞从固相脱落。

本说明书中，贴壁细胞是指粘附于固相上的细胞。本说明书中，即使是本来以浮游状态进行培养的浮游细胞，当其在粘附于固相的条件下进行培养时，也作为贴壁细胞处理。

本实施方式的方法中，作为气体没有特殊限定，可举出空气、氮气等。气体可以被灭菌。作为气体的灭菌方法，没有特殊限定，例如，可举出通过孔径0.22μm左右以下的过滤器等。此外，作为液体，可使用细胞的培养基、缓冲液等。气体与液体的界面只要是气体与液体相接的面即可，没有特殊限定，例如，可以是：由气体形成的气泡的周缘或气泡的表面；在使液体流入流体装置后，再使气体流过时的液体与气体的边界面；在使气体流入流体装置后，再使液体流过时的液体与气体的边界面等。

(第1实施方式)

在第1实施方式所涉及的使细胞脱落的方法中，上述固相的至少一部分形成为流路。此外，通过使气泡在上述流路中流动来实现使气体与液体的界面和上述贴壁细胞接触，以及使上述界面在沿着上述表面的方向上移动。

图1为示出细胞培养容器的一个例子的照片。图1中示出的细胞培养容器中，固相形成为流路，可以向流路供给培养基，以在固相的表面培养贴壁细胞。流路中具备导入口及排出口。可以将培养基、细胞、气体等从导入口导入，并从排出口排出。

根据第1实施方式所涉及的使细胞脱落的方法，将气体从图1中例示出的细胞培养容器的导入口导入，并朝向排出口流动，由此使气体与培养基的界面和贴壁细胞接触，并沿流路的表面移动，因而可以使在细胞培养容器的流路的表面培养的贴壁细胞脱落。对于气体而言，必须以气体与液体的界面和流路表面的细胞相接触的程度的量进行导入。

作为使气体与液体的界面移动的方法，可以是从流路的导入口持续导入气体，也可以是从流路的导入口导入气体而形成气泡后，从流路的导入口进一步导入液体或气体，并使该气泡朝向排出口移动。作为液体，除了细胞的培养基之外，还可以是缓冲液等。由此，气体与液体的界面和贴壁细胞接触，进而界面在沿着流路的表面的方向移动，使细胞从固相脱落。

第1实施方式所涉及的使细胞脱落的方法中，可以将固相的至少一部分配置于流路上。固相的表面是指能够使贴壁细胞粘附而培养的表面，可举出玻璃；聚苯乙烯等树脂；金属；由选自胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白、聚赖氨酸等1种以上的细胞外基质的成分包被的表面；以各种聚合物(例如，能够控制亲水性、对细胞的吸附性的聚合物)包被的表面等，但不限于此。

[细胞操作装置]

在一个实施方式中，本发明提供了细胞操作装置，所述装置具备配置于液体中、能够向上述液体中导入气体的流路，能够于上述流路的端部形成上述气泡，使在上述液体中培养的细胞脱落，并使其附着于气泡上。本实施方式的细胞操作装置有时也可称为如下的细胞脱落装置：所述装置具备筒状部，所述筒状部在端部被配置于液体中时，能够于上述端部生成气泡。本实施方式的细胞脱落装置被构成为上述气泡能够与在固相的表面培养的贴壁细胞接触。

图2的(a)～(c)为示出一个实施方式所涉及的细胞脱落装置的结构的示意图。如图2的(a)及(c)所示，细胞脱落装置200具有筒状部230，所述筒状部230具备供气体210流动的流路220，通过向流路220导入或排出气体210，当筒状部230的端部231被配置于液体240中时，可以于端部231生成气泡211。图2的(a)所示的细胞脱落装置200连接于控制部250而构成为细胞脱落系统，所述控制部250通过控制向流路220导入或排出的气体210的量从而以手动或自动的方式控制气泡211的体积。因此，可以控制气泡211的体积。此外，细胞脱落装置200能够以手动或自动的方式改变端部231距固相或细胞的距离，并且能使端部231沿着固相表面移动。

控制部250可以由例如注射器、泵等构成。在细胞脱落装置200中，流路220是筒状部230的内腔。

图2的(b)为图2的(a)中示出的筒状部230在b-b’线处的向视截面图。如图2的(b)所示，细胞脱落装置200的筒状部230具备在与筒状部的轴向垂直的面上的截面为圆形的流路220。

流路220的端部231中的开口面积只要能够使细胞脱落即可，没有特殊限定，例如，可以设为大于1个细胞的粘附面积左右的面积。此外，流路220的前端的形状没有特殊限定，流路220的内径可以是在前端之前相同，可以是朝向前端逐渐增大，也可以是朝向前端逐渐减小。此外，端面可以设为与流路220的轴垂直的面，也可以设为与流路220的轴不垂直的面。

此外，在细胞脱落装置200中，可以将流路220用于细胞的回收，但筒状部230也可以进一步具备对脱落后的细胞进行回收的第2流路。

(变型例1)

图3的(a)～(c)为示出一个实施方式所涉及的细胞脱落装置的结构的示意图。如图3的(a)所示，细胞脱落装置300的筒状部230由外筒221与内筒261的双重结构形成，外筒221与内筒261之间是供气体210流动的第1流路220，内筒261的内部是对脱落后的细胞进行回收的第2流路260。细胞脱落装置300可以与控制部P¹连接而构成细胞脱落系统，所述控制部P¹通过向第1流路220导入或排出气体210，从而在筒状部230的端部231被配置于液体240中时，在端部231上配置气泡211或控制气泡211的体积。控制部P¹包括例如泵。此外，如图3的(a)所示，细胞脱落装置300也可以与控制第2流路260内的液体流动的控制部P²连接。

图3的(b)为图3的(a)所示的筒状部230在b-b’线处的向视截面图。如图3的(b)所示，细胞脱落装置300的筒状部230具备截面为圆环状的第1流路220，和被第1流路220包围的第2流路260。

在上述例子中，设为向第1流路220导入或排出气体210，并用第2流路260对脱落后的细胞进行回收，但也可以向第2流路260导入或排出气体210，用第1流路220回收细胞。与细胞脱落装置200相比，细胞脱落装置300的主要区别在于使气体210流动以形成气泡的第1流路220独立于用于回收细胞的第2流路260这一点。

此外，如图3的(c)所示，配置于细胞脱落装置300的筒状部230的端部231的气泡211的形状成为圆环状。根据细胞脱落装置300，由于第1流路220与第2流路260是独立的，因此，可以用配置在第1流路220的端部231的气泡211将细胞脱落，同时将脱落的细胞通过第2流路260回收。

(变型例2)

图4的(a)～(c)为示出一个实施方式所涉及的细胞脱落装置的结构的示意图。如图4的(a)所示，细胞脱落装置400可以与筒状部230和控制部P¹连接而构成细胞脱落系统，所述筒状部230具备供气体210流动的流路220，所述控制部P¹通过向流路220导入或排出气体210，从而在使筒状部230的端部231配置于液体240中时，在端部231上配置气泡211或控制气泡211的体积。控制部P¹包括例如泵。

在细胞脱落装置400中，流路220兼作用于回收细胞的流路。

图4的(b)为图4的(a)所示的筒状部230在b-b’线处的向视截面图。如图4的(b)所示，与上述细胞脱落装置200相比，细胞脱落装置400的筒状部230的区别主要在于与筒状部230的轴向垂直的面上的截面形状。

图4的(c)为示出细胞脱落装置400的筒状部230的端部231配置有气泡211的状态的立体图。如图4的(c)所示，形成于细胞脱落装置400的筒状部230的端部231的气泡211在一个方向上较长。因此，容易使更大范围的贴壁细胞脱落。特别地，通过使筒状部230在与筒状部230的长边方向垂直的方向上移动，可以更有效地使贴壁细胞脱落。

细胞脱落装置400中，流路220兼作用于回收细胞的流路，但不限于此，流路220和细胞回收用流路260也可以独立。此时，例如，可以将细胞回收用流路260配置于流路220的内部，也可以将流路220配置于细胞回收用流路260的内部，流路220与细胞回收用流路260具有相同形状，还可以相邻地配置。

[操作细胞的方法(第2～4实施方式)]

(第2实施方式)

第2实施方式所涉及的使细胞脱落的方法包括：使气体与液体的界面和在固相的表面培养的贴壁细胞接触，和使上述界面沿上述表面移动。并且，使气体与液体的界面接触贴壁细胞的操作是通过使在具备筒状部的细胞脱落装置的上述筒状部的端部生成的气泡与贴壁细胞接触来进行的。此外，使界面沿表面移动的操作是通过使气泡沿固相的表面移动来进行的。

图5的(a)～(c)为对第2实施方式的方法的一个例子进行说明的示意图。其中，对使用上述细胞脱落装置200而使细胞脱落的情况进行说明。图5的(a)示出了在培养容器500的表面培养贴壁细胞的状态。将贴壁细胞510用培养基(液体)240进行培养。

首先，如图5的(a)所示，向细胞脱落装置200的流路220中导入气体210，在筒状部230的端部231配置气泡211。然后，使气泡211接触贴壁细胞510。由此，使气体210与液体240的界面212(气泡211与培养容器500的接触面的周围)接触贴壁细胞510。

随后，保持使气泡211与贴壁细胞510接触，并使细胞脱落装置200在沿着培养容器(固相)的表面的方向上移动。图5的(a)中，以箭头示出了细胞脱落装置200的移动方向。对于沿着固相的表面的方向而言，只要是平行于固相的表面的方向即可，没有特殊限定，可以是所有的方向。

实施例中，如下文所述，意外的是，通过上述操作可以使贴壁细胞510从培养容器500脱落。

图5的(b)为示出贴壁细胞510脱落后的状态的示意图。如果以划线的方式移动细胞脱落装置200，可以使贴壁细胞510呈线状脱落。此外，通过改变气泡211的大小，可以使贴壁细胞510呈所期望大小的线状脱落。进而，如图5的(b)所示，本申请的发明人发现，脱落后的贴壁细胞510附着于气泡211的表面。

在此，如图5的(c)所示，通过吸引流路220的气体210，可以回收附着于气泡211的表面的细胞510。根据本实施方式，可以利用简单的构成装置使细胞选择性地脱落，进而能够进行回收。

图6的(a)及(b)为对第2实施方式的方法的一个例子进行说明的示意图。其中，对使用上述细胞脱落装置400使细胞脱落的情况进行说明。图6的(a)为示出在培养容器500的表面培养贴壁细胞510的状态的俯视图。将贴壁细胞510在培养基(液体)240中进行培养。

首先，如图6的(a)所示，向细胞脱落装置400的流路220中导入气体210，在筒状部230的端部231配置气泡211。然后，使气泡211与贴壁细胞510接触。由此，使气体210与液体240的界面212与贴壁细胞510接触。

随后，保持使气泡211与贴壁细胞510接触，并使细胞脱落装置400在沿着培养容器(固相)的表面的方向上移动。图6的(a)中，以箭头示出了细胞脱落装置200的移动方向。沿着固相的表面的方向只要是平行于固相的表面的方向即可，没有特殊限定，可以是所有的方向。

图6的(b)为示出贴壁细胞510脱落后的状态的示意图。其后，可以通过流路260，回收脱落后的贴壁细胞510。

以上，以使用细胞脱落装置200及400的情况为例对第2实施方式的方法进行了说明。然而，在第2实施方式的方法中，作为细胞脱落装置，也可以使用细胞脱落装置200、400以外的细胞脱落装置。作为细胞脱落装置200、400以外的细胞脱落装置，例如，可举出上述细胞脱落装置300等，但不限于此。

(第3实施方式)

第3实施方式所涉及的使细胞脱落的方法包括：使气体与液体的界面和在固相的表面培养的贴壁细胞接触，和使上述界面在沿着上述表面的方向上移动。然后，通过使上述细胞脱落装置(端部配置有气泡)的气泡接触贴壁细胞，来进行使气体与液体的界面与贴壁细胞接触的操作。此外，通过使细胞脱落装置的气泡的体积发生变化，来进行使界面在沿着表面的方向上移动的操作。

图7的(a)及(b)为对第3实施方式的方法的一个例子进行说明的示意图。其中，对使用上述细胞脱落装置200而使细胞脱落的情况进行说明。图7的(a)示出了在培养容器500的表面培养贴壁细胞510的状态。将贴壁细胞510培养在培养基(液体)240中。

首先，如图7的(a)所示，向细胞脱落装置200的流路220中导入气体210，在筒状部230的端部231配置气泡211。然后，使气泡211与贴壁细胞510接触。由此，使气体210与液体240的界面212与贴壁细胞510接触。

随后，使细胞脱落装置200的气泡211的体积发生变化。具体而言，如图7的(b)所示，向流路220中导入气体210，使气泡211的体积增大。

其结果是，气体与液体的界面212(气泡211与培养容器500的接触面的周围)在沿着培养容器的表面的方向上移动。即，气泡的表面以存在于流路220的正下方的贴壁细胞510为中心，向周围的所有方向移动。

实施例中，如下文所述，利用以上操作也可以使贴壁细胞510从培养容器500脱落。此外，如图7的(b)所示，本申请的发明人发现，脱落后的贴壁细胞510附着于气泡211的表面。

在此，通过吸引流路220内的气体210，可以回收附着于气泡211的表面的细胞510。

以上，以使用细胞脱落装置200的情况为例对第3实施方式的方法进行了说明。然而，在第3实施方式的方法中，作为细胞脱落装置，也可以使用细胞脱落装置200以外的细胞脱落装置。作为细胞脱落装置200以外的细胞脱落装置，例如，可举出上述细胞脱落装置300、细胞脱落装置400等，但不限于此。

(第4实施方式)

第4实施方式所涉及的使细胞脱落的方法包括：使气体与液体的界面和在固相的表面培养的贴壁细胞接触，和使上述界面在沿着上述表面的方向上移动。然后，通过使端部配置有气泡的上述细胞脱落装置的气泡与贴壁细胞接触，来进行使气体与液体的界面和贴壁细胞接触的操作。此外，通过使细胞脱落装置与贴壁细胞之间的距离发生变化，来进行使界面向沿着表面的方向移动的操作。

图8的(a)及(b)为对第4实施方式的方法的一个例子进行说明的示意图。其中，对使用上述细胞脱落装置200而使细胞脱落的情况进行说明。图8的(a)示出了在培养容器500的表面培养贴壁细胞510的状态。将贴壁细胞510培养在培养基(液体)240中。

首先，如图8的(a)所示，向细胞脱落装置200的流路220中导入气体210，并在筒状部230的端部231配置气泡211。然后，使气泡211与贴壁细胞510接触。由此，使气体210与液体240的界面212与贴壁细胞510接触。

随后，使细胞脱落装置与贴壁细胞之间的距离发生变化。具体而言，如图8的(b)所示，将筒状部230靠近培养容器的表面。其结果是气泡211发生变形。

其结果是，使气体与液体的界面212(气泡211与培养容器500的接触面的周围)在沿着培养容器的表面的方向上移动。即，气泡的表面以存在于流路220的正下方的贴壁细胞510为中心，向周围的所有方向移动。

利用以上操作，可以使贴壁细胞510从培养容器500脱落。此外，如图8的(b)所示，本申请的发明人发现，脱落后的贴壁细胞510附着于气泡211的表面。

在此，通过吸引流路220内的气体210，可以回收附着于气泡211的表面的细胞510。

以上，以使用细胞脱落装置200的情况为例对第4实施方式的方法进行了说明。然而，在第4实施方式的方法中，作为细胞脱落装置，也可以使用细胞脱落装置200以外的细胞脱落装置。作为细胞脱落装置200以外的细胞脱落装置，例如，可举出上述细胞脱落装置300、细胞脱落装置400等，但不限于此。

在上述各实施方式中，针对使粘附于固相上的贴壁细胞脱落的技术进行了说明，但本发明的实施方式不限于此。例如，脱落后的贴壁细胞通过与气泡接触而附着于气泡的表面，但细胞在气泡表面的附着对于浮游在培养液中的浮游细胞也可以适用。

[细胞操作系统]

在一个实施方式中，本发明提供了细胞脱落系统，所述系统具备：(i)细胞脱落装置，其具备将端部配置于液体中时能够在上述端部生成气泡的筒状部；和(ii)控制部，其通过向上述细胞脱落装置的筒状部导入或排出上述气体，来控制上述气泡的生成。

控制部与上述情况相同，例如，可以由注射器、泵、对它们进行控制的CPU等构成。利用本实施方式的细胞脱落系统，可以高效地实施上述细胞脱落方法。也可以回收脱落后的细胞。

[流体装置系统]

在一个实施方式中，本发明提供了流体装置系统，所述系统具备：在流路内配置有能够在表面培养贴壁细胞的固相的流体装置；和上述细胞脱落系统。利用本实施方式的流体装置系统，可以培养贴壁细胞，进而使细胞脱落。还可以回收脱落后的细胞。

如上所述，细胞脱落装置、细胞脱落系统、流体装置系统能够用简单构成的装置，使细胞选择性地脱落、回收。因此，例如，在饲养细胞上培养目标细胞时，可以用于仅除去不需要的饲养细胞，可以应用于再生医疗。此外，对于评价针对将细胞脱落回收后的部分的细胞游走速度的划痕试验而言也是有用的。

实施例

下面示出实施例来说明本实施方式，但本发明不限于以下实施例。

[实验例1]

(流路中的细胞的脱落)

《培养容器的制作》

制作图1中照片所示的细胞培养容器。具体而言，在玻璃基板上，依次层叠厚度为0.1mm的第1聚二甲基硅氧烷(PDMS)层、厚度为2mm的第1丙烯酸类树脂板、厚度为0.1mm的第2PDMS层、厚度为2mm的第2丙烯酸类树脂板，来制作细胞培养容器。

第1PDMS层和第2PDMS层以及第1丙烯酸类树脂板使用激光加工器(型号“VLS2.30”，Yokohama Systems Co.,ltd.)来钻出图1所示形状的流路图案并层叠。此外，在第2丙烯酸类树脂板上形成成为导入口及排出口的孔并层叠。随后，在导入口及排出口上安装图1所示的接头(adaptor)，得到细胞培养容器。

《细胞的培养》

在制作而得的细胞培养容器的流路内培养细胞。作为细胞，使用作为人胃癌细胞株的KatoIII细胞。

《细胞的脱落》

从培养开始约1天后，在细胞培养容器的流路中流动空气，随后流动培养基，用显微镜进行观察。图9的(a)～(e)为对细胞培养容器的流路进行拍摄而得的显微镜照片。倍率为4倍。图9的(a)为导入空气前的流路的照片。图9的(b)为对空气向流路的观察区域流入的途中的状态进行拍摄而得的照片。图9的(c)为对流路的观察区域完全充满空气后的状态进行拍摄而得的照片。图9的(d)为对空气从流路的观察区域流出的途中的状态进行拍摄而得的照片。图9的(e)为对流路的观察区域再次充满培养基后的状态进行拍摄而得的照片。

该结果确认了在图9的(e)中，流路内的细胞脱落而流出至观察区域外的情况。由该结果可知，通过使气体与液体的界面和在固相的表面培养的贴壁细胞接触，随后使界面在沿着表面的方向上移动，能够使贴壁细胞从固相脱落。

[实验例2]

(使用细胞脱落装置而得的细胞的脱落1)

使用与上述细胞脱落装置200具有相同构成的细胞脱落装置来进行贴壁细胞的脱落。

首先，使用细胞培养用培养皿来培养细胞。作为细胞，使用作为来源于人宫颈癌的细胞株的HeLa细胞。将细胞培养成为汇合状态之后，进行脱落实验。

图10的(a)～(c)为对细胞的脱落实验的情况进行拍摄而得的显微镜照片。倍率为4倍。首先，如图10的(a)所示，使细胞脱落装置的端部接近细胞。箭头示出了细胞脱落装置的端部。

随后，如图10的(b)所示，在细胞脱落装置的端部形成空气气泡而使其与细胞接触，使细胞脱落装置向平行于细胞培养用培养皿的底面的方向移动。图10的(b)中，箭头示出了细胞脱落装置的端部。

图10的(c)为对细胞脱落后的状态进行拍摄而得的照片。图10的(c)中，虚线圈出的部分示出了细胞脱落的区域。正如气泡移动的样子，可见细胞脱落呈线状。该结果进一步支持：通过使气体与液体的界面和在固相的表面培养的贴壁细胞接触，随后使界面在沿着表面的方向上移动，能够使贴壁细胞从固相脱落。

[实验例3]

(使用细胞脱落装置而得的细胞的脱落2)

使用与上述细胞脱落装置200具有相同构成的细胞脱落装置来进行贴壁细胞的脱落。

首先，使用细胞培养用培养皿来培养细胞。作为细胞，使用作为来源于人宫颈癌的细胞株的HeLa细胞。将细胞培养成为汇合状态之后，实施脱落实验。

图11的(a)～(c)为对细胞的脱落实验的情况进行拍摄而得的显微镜照片。倍率为4倍。首先，如图11的(a)所示，使细胞脱落装置的端部接近细胞。图11的(a)中，箭头示出了细胞脱落装置的端部。

随后，如图11的(b)所示，在细胞脱落装置的端部形成气泡，并使导入细胞脱落装置的流路中的空气的量增加，使气泡的体积增大。图11的(b)中，箭头示出了细胞脱落装置的端部。进行4次相同的操作。此外，气泡的体积每次均有变化。

图11的(c)为对细胞脱落后的状态进行拍摄而得的照片。图11的(c)中，虚线圈出的部分示出了细胞脱落的区域。气泡的周围所经过的近似圆形的区域中细胞脱落。可见，通过使气泡的体积发生变化，可以控制细胞脱落的面积。该结果进一步支持：通过使气体与液体的界面与在固相的表面培养的贴壁细胞接触，随后使界面在沿着表面的方向上移动，能够使贴壁细胞从固相脱落。

附图标记说明

200，300，400…细胞脱落装置(细胞操作装置)、210…气体、211…气泡、212…界面、220…流路(第1流路)、221…外筒、230…筒状部、231…端部、240…液体、250，P¹，P²…控制部、260…第2流路、261…内筒、500…培养容器、510…贴壁细胞。