数字微流体凝集测定
阅读说明：本技术 数字微流体凝集测定 (Digital microfluidic agglutination assay ) 是由 A·斯卡拉沃诺斯 J·L·拉曼纳 A·R·惠勒 于 2020-05-04 设计创作，主要内容包括：本公开提供一种用于在“双板”DMF装置格式上执行凝集测定的方法。将含有感兴趣分析物(颗粒、细胞等)的液滴加载到所述DMF装置中,并且使其与溶液相或干燥的凝集抗体或抗原混合。所述凝集剂结合到它们在所述样品液滴中的互补靶标(例如,抗体或抗原),从而导致形成不溶性聚集物。DMF装置上的主动混合减少了反应时间并且增强了凝集效果。由于凝集的样品夹在所述DMF装置上的两个板之间,因此可直截了当地通过肉眼或经由数码相机查看结果。(The present disclosure provides a method for performing agglutination assays on a "two-plate" DMF device format. The droplets containing the analyte of interest (particles, cells, etc.) are loaded into the DMF device and mixed with solution phase or dry agglutinated antibody or antigen. The agglutinating agent binds to their complementary target (e.g., antibody or antigen) in the sample droplet, resulting in the formation of insoluble aggregates. Active mixing on a DMF device reduces reaction time and enhances agglutination effect. The results can be viewed directly by eye or via a digital camera, since the agglutinated sample is sandwiched between two plates on the DMF device.)
技术领域
本公开涉及一种用于使用“双板”数字微流体(DMF)装置格式执行凝集测定的方法。将含有感兴趣分析物(颗粒、细胞等)的液滴加载到所述DMF装置中，并且使其与液相或干燥的凝集抗体或抗原混合。
背景技术
凝集测定通常用于检测样品中分析物的存在；典型的应用包括传染病和病原体检测，以及针对供体相容性的血型定型。凝集测定依赖于抗体或抗原与感兴趣分析物的相互作用；此相互作用的结果是形成肉眼可见的大的不溶性团块或聚集物。因此，相对于用于此类测定的其他技术(其依赖于光子能或电能的仪器测量的)，凝集测定具有独特的优势—测定结果的读取非常直截了当。
在传统的凝集测定中，将涂覆有抗体或抗原的颗粒与样品组合，进行手动混合，并且通过视觉检查确定聚集物的存在。标准技术的明显缺点包括手动混合的需要、解读测定读数出错的可能以及低通量。最近开发了微流体装置中的凝集测定以努力解决这些缺点。例如，Castro等人1描述了一种用于凝集测定的微流体方法，所述方法依赖于水动力混合结合基于成像的检测，据报道所述方法对于限制用户输入并最小化分析变异性是有用的。凝集测定的其他微流体实现方式依赖于流式细胞术、2光散射、3荧光4和光学显微镜。5,6这些检测方法对于方法开发和优化是有用的，但它们需要辅助检测器，这些辅助检测器(最终)否定了凝集的主要优势—无需复杂检测方案即可读取测试结果的能力。
影响先前报道的基于微流体的凝集测定的另一个挑战是要求在引入微流体装置之前必须稀释样品，这增加了测定的复杂性。5一种理想的方法将是接受未经处理的样品，这将与非专家使用相容。另外，在狭窄通道中操纵凝集物可能会引起通道堵塞，从而可能导致装置故障和可靠性问题。最后，作为常规微流体的另选方案，存在许多以基于测流的“纸微流体”格式(例如，Yoon和You7)实施的凝集测定方法的实例，但这些方法通常具有低通量和/或需要手动清洗步骤。这里介绍了一种依赖于数字微流体(DMF)的新方法，所述方法克服了上述技术的局限性。
DMF是一种液体处理技术，其使用静电力来操纵皮升至微升大小的液体液滴。DMF的最强有力的格式是“双板”构型，其中液滴夹在对电极顶板与底板之间，从而露出绝缘电极阵列。当以双板格式操作时，可对液滴进行分配、分流、合并和混合，从而使DMF非常适用于样品处理、8免疫测定9-11和化学反应。12DMF相对于传统微流体有众多不同之处，包括多功能性(通用装置架构可应用于多种应用)、在不移动部件的情况下对(液态或干燥)试剂的位置的绝对控制、以及在开放几何中无通道堵塞机会的操作。
本发明人知道在DMF装置上实施的凝集测定的两个先前报道。一种方法使用背光散射检测进行乳胶免疫凝集测定，7并且另一种方法使用功能化金纳米颗粒来凝集感兴趣生物标志物，结合微分离程序进行检测。13应指出，这些技术中的任一者都未在数字微流体的“标准”格式中进行展示。也就是说，第一种方法7并不使用电场来操纵液滴(相反，使用XYZ阶段控制的导线在表面周围机械地推/拉液滴)，并且第二种方法13使用所谓的“单板”DMF(与本文所公开的方法中使用的更强有力的“双板”DMF格式形成对比)。这些“非标准”DMF格式7 , 13对概念验证有用，但我们认为它们几乎肯定与已成为用于双板数字微流体的通用板的完全集成的样品进答案出(sample-in-answer-out)系统类型不相容。11
术语数字微流体(DMF)已经广泛用于描述液体液滴操纵系统。已经报道了若干流体致动器，诸如使用化学14或热梯度、15磁体、16声波、17机械7和电气方法。13由于本发明依赖于使用静电液体操纵力，通常称为介质上电润湿(EWOD)，因此将只关注单板与双板DMFEWOD装置之间的比较，将不再进一步讨论所有其他装置(非EWOD)，因为它们使用与本发明无关的其他液体操纵技术。
DMF EWOD系统通常分为两个主要类别；单板DMF和双板DMF。从单板DMF装置转向双板DMF装置存在若干原因和重大技术挑战。术语单板DMF装置用于描述其中液滴自由地位于水平固体基质上的开放系统，而术语双板DMF装置用于描述其中液滴局限于两个板之间的覆盖系统。两种类型的装置都需要足够的接地来进行操作；单板装置需要与液滴直接接触的外部导线或与致动电极位于同一平面内的电极，而在双板装置中，接地位于顶板内。
除了板的数量之外，这两种类型的DMF装置在其执行液滴操作的能力方面也大不相同。在双板系统中，液滴运动更容易。另外，液滴的分流和分配几乎是双板系统的独有选项。相反，当需要充分混合、蒸发(用于物种浓缩)和直接接触液体液滴时，单板装置是优选的，因为液滴是易于获得的。单板装置通常在高得多的电压和低得多的频率下操作，这需要与双板系统不同的硬件仪器。因此，尽管先前已经有关于用于凝集测定的数字微流体的报道，7,13但尚不清楚如何将凝集从这些装置过渡到双板DMF系统，因为两种类型的装置之间存在众多技术差异，这些差异需要优化和确定以便在这里所报道的双板DMF装置上进行凝集测定。
此外，即使从凝集测定的角度来看，先前报道中的任一者也都不理想—反向散射技术7需要辅助仪器进行分析，并且基于纳米颗粒的技术13是缓慢的(因为用户必须等待每个样品蒸发，之后进行分析)并且需要定制的、昂贵的、基于纳米颗粒的试剂。应指出，这两种方法都是在十多年前报道的，没有后续出版物，这表明群体领会缓慢(或没有领会)。
发明内容
本公开提供一种用于在“双板”数字微流体(DMF)装置格式上执行凝集测定的新颖方法。将含有感兴趣分析物(颗粒、细胞等)的液滴加载到所述DMF装置中，并且使其与溶液相或干燥的凝集抗体或抗原混合。所述凝集剂结合到它们在所述样品液滴中的互补靶标(例如，抗体或抗原)，从而导致形成不溶性聚集物。DMF上的主动混合减少了反应时间并且增强了凝集效果。由于凝集的样品夹在所述DMF装置上的两个板之间，因此可直截了当地通过肉眼或经由数码相机查看结果。
因此，本公开提供一种使用具有多个驱动电极的双板电润湿数字微流体装置(DMF)表征含有分析物的样品的方法，所述方法包括以下步骤：
将凝集剂加载在所述DMF装置上；
将含有所述分析物的流体样品加载在所述DMF装置上；以及
使用电润湿来使所述流体样品与所述凝集剂接触
以使所述分析物凝集，从而产生凝集物。
所述方法还可包括以下步骤：表征由所述凝集剂引起的所述分析物的凝集量。
加载在所述DMF装置上的流体可含有表面活性剂。
所述表面活性剂可呈预干燥形式，并且所述方法还可包括：用所述预干燥形式的表面活性剂在预定点中涂覆一个或多个驱动电极或跨装置表面涂覆，使得当所述流体样品与所述预干燥的表面活性剂接触时，所述流体样品溶解，并且所述表面活性剂可以至少0.01重量％的量存在于所述流体中。在所述DMF装置上干燥和重组试剂的过程可根据US2014/0141409 A1(Foley等人18)中所描述的方法执行。
所述表面活性剂可以是离子表面活性剂和非离子表面活性剂中的一种。所述离子表面活性剂可选自由十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、西曲溴铵、西曲氯铵和月桂基硫酸钠组成的组。非离子表面活性剂包括但不限于烷基酚羟基聚乙烯(例如，Triton X RTM)、聚山梨醇酯(例如，Tween RTM)、泊洛沙胺(例如，Tetronic RTM)、泊洛沙姆(例如，Pluronic RTM)和山梨聚糖酯。所述泊洛沙姆可包括
所述凝集剂可以是加载并计量到预选驱动电极的液体。
所述凝集剂可呈预干燥形式，并且所述方法还可包括：用所述预干燥形式的凝集剂在所述DMF装置的所述表面的预定点中涂覆一个或多个驱动电极，使得当流体与所述预干燥的凝集剂接触时，所述预干燥的凝集剂溶解。在所述DMF装置上干燥和重组试剂的过程可根据US 2014/0141409 A1(Foley等人18)中所描述的方法执行。
所述方法还可包括以下步骤：在所述DMF装置上使用电润湿将所述凝集剂与所述流体样品主动混合。
所述凝集剂可包括能够产生凝集物的物质中的任一种或其组合。物质的实例包括化学凝集剂和生物凝集剂。对于红血细胞的凝集，化学凝集剂可选自由以下组成的组：聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚(二甲基二烯丙基铵)氯化物(RTM、RTM、RTM)、聚-L-精氨酸盐酸盐、聚-L-组氨酸、聚(4-乙烯基吡啶)、聚(4-乙烯基吡啶)盐酸盐、交联聚(4-乙烯基吡啶)、甲基氯季盐、聚(4-乙烯基吡啶-共聚苯乙烯)；聚(4-乙烯基吡啶聚(氟化氢))；聚(4-乙烯基吡啶-对甲苯磺酸盐)；聚(4-乙烯基吡啶-三溴化物)；聚(4-乙烯基吡咯烷酮-共聚-2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯)；交联聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯吡咯烷酮、聚(三聚氰胺-共聚-甲醛)；部分甲基化；溴化己二甲胺；聚(谷氨酸，赖氨酸)1:4氢溴酸盐；聚(赖氨酸，丙氨酸)3:1氢溴酸盐；聚(赖氨酸，丙氨酸)2:1氢溴酸盐；聚-L-赖氨酸琥珀酰化；聚(赖氨酸，丙氨酸)1:1氢溴酸盐；和聚(赖氨酸，色氨酸)1:4氢溴酸盐。
所述化学凝集剂可以是聚(二甲基二烯丙基铵)氯化物。
所述生物凝集剂可选自由蛋白质、抗体、病毒和抗原、DNA、RNA以及基于DNA或RNA的适体组成的组。
所述蛋白质可包含能够可逆地结合糖类结构的外源凝集素。所述抗体可包括抗-A、抗-B和抗-D。
所述病毒可包括流感病毒。
所述表征由所述凝集剂引起的所述分析物的凝集量的步骤可包括视觉表征。此视觉表征可通过人观察所述DMF装置以估计凝集量来进行。另选地，使用相机执行视觉表征的步骤。所述相机可以是网络摄像头、手机相机、数码相机(包括数码单反相机DSLR)、摄像机、监控相机、傻瓜相机、带CCD检测器的相机、带CMOS检测器的相机、单色相机、黑白相机、彩色相机。
颗粒可涂覆有所述凝集剂。这些可包括聚合物颗粒(例如，胶乳)、金、银、纳米颗粒和微米颗粒中的任一种或其组合。所述聚合物颗粒可包括胶乳。
正在针对其进行检测的分析物可以是抗体，并且其中所述颗粒可涂覆有抗原或能够捕获感兴趣抗体的其他剂。
正在针对其进行检测的分析物可以是抗原，并且其中所述颗粒可涂覆有抗体或能够捕获感兴趣抗原的其他剂。
正在针对其进行检测的分析物可以是细菌，并且其中所述颗粒可涂覆有抗体或能够捕获感兴趣细菌的其他剂。
正在针对其进行检测的分析物可以是病毒，并且其中所述颗粒可涂覆有抗体或能够捕获感兴趣病毒的其他剂。
所述方法可用于聚合物颗粒的悬浮液的凝集。
所述方法可用于纳米颗粒的悬浮液的凝集。
所述方法可用于红血细胞的悬浮液的凝集。
所述流体可以是包含至少红血细胞的血液样品。
所述流体可含有病毒悬浮液以用于使用红血细胞或颗粒的凝集来检测病毒。
所述方法可用于白血细胞的悬浮液的凝集。
所述流体可以是包含至少白血细胞的血清样品或血浆样品。
所述方法可用于任何其他类型的真核细胞的悬浮液的凝集。
所述凝集剂可以是能够引起细胞凝集的任何物质。
细胞可以是红血细胞。
所述凝集剂在与红血细胞一起使用时可用于确定血细胞比容水平。
本发明提供一种双板电润湿DMF装置，其包括：
第一极板、与所述第一极板间隔开的第二极板，所述第一极板和所述第二极板中的一个具有多个驱动电极；以及
所述第一板或所述第二板上的表面、所述第一板或所述第二板上的另一表面，所述表面具有在预选位置中涂覆所述表面或涂覆整个板的呈预干燥形式的表面活性剂，所述另一表面具有在预选位置中涂覆所述另一表面的呈预干燥形式的凝集剂。
由表面活性剂涂覆的表面和涂覆有凝集剂的表面是不同的或相同的。
本公开提供一种试剂盒，其包括：
双板电润湿数字微流体装置(DMF)，所述DMF具有多个驱动电极；
表面活性剂，所述表面活性剂用于放置在所述两个板中的一个上；以及
凝集剂，所述凝集剂用于放置在所述两个平板中的一个上。
所述凝集剂可被选择用于红血细胞的凝集。
通过参考以下详细描述和图式，可实现对本公开的功能和有利方面的进一步理解。
附图说明
现在将仅通过举例的方式参考图式来描述实施方案，在图式中：
图1在三(3)个图中示出DMF装置和在DMF装置上进行的凝集测定的相关联步骤，其中标记为(i)的最左侧图示出将含有感兴趣分析物的一个或多个样品加载到含有凝集剂的DMF装置中，标记为(ii)的中间图示出将样品计量成子样品，然后将每个子样品与凝集剂混合预定时间段，并且标记为(iii)的最右侧图示出在视觉上或通过相机在DMF装置上观察到凝集。
图2是描绘用于血型定型的DMF凝集测定的结果的图式。将全血样品加载到装置上，之后将其计量成四个子液滴。在DMF装置上将每个子液滴与含有抗A(左)、抗B(左二)、抗A/抗B共混(右二)和抗D(右)抗体的分离液滴混合。在混合2分钟之后，可通过肉眼确定结果。这里的特定样品与抗A、抗AB和抗D(Rh)形成凝集物，这指示A+类型。
图3是描绘基于珠的DMF凝集测定的结果的图式。将第一细菌裂解物样品加载到装置中，然后将其计量成一对子液滴，将所述一对子液滴与含有涂覆有PBP2抗体的乳胶珠(左)的液滴或涂覆有对PBP2非特异性的抗体的乳胶珠(左二)的液滴混合。第一样品与涂覆有PBP2抗体的乳胶珠形成弱凝集物，并且与涂覆有对PBP2非特异性的抗体的乳胶珠不形成凝集物，这指示细菌易受甲氧西林影响。类似地，将第二细菌裂解物样品加载到装置中，然后将其计量成一对子液滴，将所述一对子液滴与含有涂覆有PBP2抗体的乳胶珠(右二)的液滴和涂覆有对PBP2非特异性的抗体的乳胶珠(右)的液滴混合。第二样品与涂覆有PBP2抗体的乳胶珠形成强凝集物，并且与涂覆有对PBP2非特异性的抗体的乳胶珠不形成凝集物，这指示细菌耐甲氧西林。在这两种情况下，在加载样品之后，使过程自动化，从而在约2分钟的混合之后得到结果。
图4是示出用于确定DMF凝集测定的输出的自动化图像分析的工作流程的图式。A)从数码相机收集的图像，其示出从初始图像捕获到ROI(感兴趣区域)的隔离的步骤。(i)以一定角度捕获装置的图像以减少反射。(ii)执行透视校正。(iii)隔离以装置的中心为特征的图像部分。(iv)在隔离图像中，针对每个液滴识别感兴趣区域(ROI)，并且(v)遮掩每个ROI并将其作为分离图像进行存储以用于分析。B)示出对每个ROI的分析的图像(左)和数据(右)。每个ROI的像素强度变化指示凝集程度。
图5是描绘用于确定血细胞比容水平的DMF凝集测定的结果的图式。在左侧示出四个液滴，它们具有不同血细胞比容水平(红血细胞体积与总血液体积之比)—20％(上)、40％(上二)、60％(下二)、80％(下)。将液滴与化学凝集剂混合，从而导致红血细胞的非特异性凝集。血细胞比容水平越高，凝集点就将越大。血细胞比容水平可通过裸眼估计或使用数码相机确定。在右侧示出经处理的使用数码相机捕获的图像的输出。像素强度差异可用于确定样品的血细胞比容水平。
图6是具有三个图的图式，其描绘用于供体相容性测试的DMF凝集测定的结果。将全血样品加载到装置上，之后将其计量成四个子液滴，如最左侧图所示。接着在DMF装置上将每个子液滴与含有来自预期血液供体的血浆的分离液滴混合，如中间图所示。在混合5分钟之后，可通过肉眼确定结果。这里的特定样品与左侧的前两个样品D1、D2(在右手侧图中)形成凝集物，这指示这些供体样品与受体的血液不相容，并且其他两个样品D3、D4(在右侧)未示出任何凝集迹象，这指示这些供体样品与受体的血液相容。
图7是描绘用于确定血细胞比容水平的DMF凝集测定的结果的排序像素强度对像素数量的曲线图。在纵轴的左侧，示出五个液滴，它们具有介于20％与60％之间的不同的、人为定义的血细胞比容水平—60％(上)、50％(上二)、40％(上三)、30％(下二)、20％(下)。将液滴与化学凝集剂混合，从而导致红血细胞的非特异性凝集。血细胞比容水平越高，凝集点就将越大。使用图像分析确定血细胞比容水平。在右侧示出经处理的使用数码相机捕获的图像的输出。每个样品的像素强度的积分用于确定样品的血细胞比容水平。
图8是血细胞比容分数对血细胞比容(％)的曲线图，其描绘从图7所示的图像生成的校准曲线。标记物是实验数据，并且误差条表示每个条件下n＝3次实验的±1标准偏差。虚线二阶多项式拟合到数据，其中R2＝0.9990。
图9示出使用黄金标准(左)和DMF-DMF上液滴凝集评估(DAAD)方法(右)从来自志愿者的12个手指点刺全血样品收集的血细胞比容测量结果的条形图。对于这组12个样品，黄金标准与DMF-DAAD方法之间的比较产生p≥0.5045。
图10A至图10D是一系列曲线图，它们描绘用于检测344个样品图像中的凝集的凝集检测算法之间的性能比较。已知数据包括如通过黄金标准方法限定的225个阳性样品和119个阴性样品。阴性是并不表现出任何凝集迹象的样品，并且阳性是表现出任何凝集迹象的样品。
图10A示出直方图方法的性能。
图10A左手侧图是通过直方图方法产生的样品图像的凝集分数对黄金标准结果的曲线图。在曲线图内，黑色和灰色表示使用阈值T(10a.u.)的正确/不正确评估的次数。
图10A右手侧图是接受者操作特征(ROC)曲线的曲线图，其示出所述方法的真阳性率对所述方法的假阳性率。ROC曲线中的虚线表示随机猜测(抛硬币)的结果。所述方法的曲线下面积(AUC)为0.981。
图10B示出标准偏差方法的性能。
图10B左手侧图是通过标准偏差方法产生的样品图像的凝集分数对黄金标准结果的曲线图。在曲线图内，黑色和灰色表示使用阈值T(0.13a.u.)的正确/不正确评估的次数。
图10B右手侧图是接受者操作特征(ROC)曲线的曲线图，其示出所述方法的真阳性率对所述方法的假阳性率。ROC曲线中的虚线表示随机猜测(抛硬币)的结果。所述方法的曲线下面积(AUC)为0.9990。
图10C示出方差方法的性能。
图10C左手侧图是通过方差方法产生的样品图像的凝集分数对黄金标准结果的曲线图。在曲线图内，黑色和灰色表示使用阈值T(1a.u.)的正确/不正确评估的次数。
图10C右手侧图是接受者操作特征(ROC)曲线的曲线图，其示出所述方法的真阳性率对所述方法的假阳性率。ROC曲线中的虚线表示随机猜测(抛硬币)的结果。所述方法的曲线下面积(AUC)为0.9997。
图10D示出DMF上液滴凝集评估(DAAD)方法的性能。
图10D左手侧图是通过DAAD方法产生的样品图像的凝集分数对黄金标准结果的曲线图。在曲线图内，黑色和灰色表示使用阈值T(0.152a.u.)的正确/不正确评估的次数。
图10D右手侧图是接受者操作特征(ROC)曲线的曲线图，其示出所述方法的真阳性率对所述方法的假阳性率。ROC曲线中的虚线表示随机猜测(抛硬币)的结果。所述方法的曲线下面积(AUC)为1.000。
具体实施方式
将参考下面讨论的细节描述本公开的各种实施方案和方面。以下描述和图式是对本公开的说明，而不应解释为限制本公开。描述了众多具体细节以提供对本公开的各种实施方案的全面理解。然而，在某些情况下，为了提供对本公开的实施方案的简明讨论，未描述众所周知的或常规的细节。
如本文所用，术语“包括”和“包含”应解释为包含性和开放性的，而不是排他性的。具体地，当在说明书和权利要求中使用时，术语“包括”和“包含”及其变体意味着包括指定的特征、步骤或部件。这些术语不应解释为排除其他特征、步骤或部件的存在。
如本文所用，术语“示例性”意味着“用作实例、例子或例示”，并且不应解释为相对于本文所公开的其他配置是优选的或有利的。
如本文所用，术语“约”和“大约”，当与颗粒尺寸范围、混合物组成或其他物理特性或特征结合使用时，意在涵盖尺寸范围的上限和下限中可存在的轻微变化，以便不排除其中平均来将大多数尺寸得到满足但统计尺寸可能存在于此区域之外的实施方案。无意从本公开中排除诸如这些的实施方案。除非另外指明，否则术语“约”和“大约”意味着正负25％或更小。
应理解，除非另外指明，否则任何指定范围或组是作为单独提及范围或组的每一个成员以及其中包含的每一个可能的子范围或子组、并且对于其中的任何子范围或子组都类似地提及的简便方式。除非另外指明，否则本公开涉及并且明确地包含每一个具体成员以及子范围或子组的组合。
如本文所用，术语“近似”，当与数量或参数结合使用时，是指跨越所陈述数量或参数的大约十分之一到十倍的范围。
如本文所用，“凝集”是指其中由于特异性抗体与抗原成分之间的相互作用或由于可诱导相同结块效应的其他化学物质而形成细胞或惰性颗粒的团块的过程。
凝集被定义为通过对表面抗原成分(直接凝集)或者对吸附或化学偶联至红细胞或惰性颗粒(分别为被动红血球凝集和被动凝集)的抗原成分特异性的抗体形成细胞或惰性颗粒的团块。19红细胞还通过非抗体物质凝集，所述非抗体物质诸如植物蛋白、病毒、重金属盐、无机胶质酸和碱以及碱性蛋白(鱼精蛋白、组蛋白)。凝集抑制或红血球凝集抑制是指可溶性抗原对这些反应的抑制，所述可溶性抗原与抗体的结合位点反应并由此防止它们与颗粒的结合和凝集。
如本文所用，短语“凝集测定”是指使用凝集过程定性评估和定量测量目标实体(分析物)的存在、量和功能活性的研究程序。
凝集测定不同于其他测定，例如，它如下不同于诸如US2017/0056887(Hadwen等人20)中所公开的凝结测定：
凝集是颗粒(固体/半固体或细胞)结块的过程。存在许多凝集实例。例如，红血球凝集是红血细胞的聚集，并且白血球凝集是白血细胞的聚集。
另一方面，凝结是液体变成固体/半固体状态的过程。凝结的实例是血液凝固的过程，其中血液从液体变为凝胶，从而形成血凝块。血液凝固类似于凝胶化过程。凝固有三个主要步骤；i)血小板栓形成，ii)内源性或外源性途径，以及iii)共同途径。
凝集与凝结之间的主要区别在于：凝集是颗粒聚集的过程，而凝结是形成定形血凝块的过程。许多颗粒能够凝集，而只有血液能够凝结。
凝集是由于抗原-抗体反应，而凝结是由于多个血浆因子的活化。
如本文所用，短语“凝集剂”是指凝集测定中所使用的任何物质，其可导致产生颗粒聚集(凝集物)。
如本文所用，短语“化学凝集剂”是指凝集测定中所使用的物质，其将产生与颗粒聚集相同的效果，但不依赖于抗原-抗体反应，而是依赖于将破坏颗粒悬浮液并且迫使颗粒坍塌到彼此并形成凝集物的其他过程。
图1示出用于在本公开中使用的双(2)板数字微流体装置，其用于在针对特定分析物的存在或不存在被测试的液体分析物样品中产生凝集。在从最左侧图到最右侧图的三(3)个图中描绘使用DMF装置的主要步骤。在DMF装置中，在DMF装置上进行凝集测定的步骤开始于：标记为(i)的最左侧图，其示出将含有感兴趣分析物的一个或多个样品加载到含有凝集剂的DMF装置中；标记为(ii)的中间图，其示出将样品计量成子样品，然后将每个子样品与凝集剂混合预定时间段；以及标记为(iii)的最右侧图，其示出在视觉上或通过相机在DMF装置上观察到凝集。
因此，广义地说，本公开提供一种使用具有多个驱动电极的双板电润湿数字微流体装置(DMF)表征含有分析物的样品的方法。DMF装置的双板构型允许对液滴进行分配、分流和合并。在单板DMF装置中，需要更高的力/电压来对液滴进行分流和分配—甚至高于电介质的介电击穿。另外，双板DMF装置对于对液滴和液滴的内容物进行成像是理想的，因为液滴的大部分呈现为平坦区域，而在单板DMF装置中，液滴的曲率不允许同样的成像容易性。此外，在单板DMF装置中，液滴暴露于空气的面积更大，从而导致液滴蒸发得更快，这可能会干扰测定。
所述方法包括：将含有针对其进行测试的分析物的流体样品(其可含有表面活性剂)和凝集剂(其可含有表面活性剂)加载在DMF装置的预选数量的驱动电极上，之后使用电润湿让流体样品与凝集剂进行接触以使分析物凝集产生凝集物，然后表征由凝集剂引起的分析物的凝集量。
在一个实施方案中，流体样品和/或凝集剂可含有表面活性剂。表面活性剂可用于减少分析物与DMF装置的顶板或底板的非特异性结合。表面活性剂还可用于改善流体样品或凝集剂在DMF装置上的移动。
在一个实施方案中，表面活性剂呈预干燥形式，并且当表面活性剂呈预干燥形式时，所述方法还包括：用预干燥形式的表面活性剂在预定点中涂覆一个或多个驱动电极或跨整个装置表面涂覆，使得当流体样品与预干燥表面活性剂进行接触时，流体样品溶解，使得表面活性剂以至少0.01重量％的量存在于流体中。在另一实施方案中，凝集剂是加载并计量到预选驱动电极的液体凝集剂。
在优选实施方案中，所述方法包括以下步骤：在DMF装置上使用电润湿将凝集剂与流体主动混合，这在存在针对其进行测试的分析物时有利地加速凝集过程。
根据针对其进行测试的分析物，表面活性剂可以是离子表面活性剂或非离子表面活性剂。离子表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠、硬脂酸钠、西曲溴铵、西曲氯铵和月桂基硫酸钠。非离子表面活性剂包括但不限于烷基酚羟基聚乙烯(例如，Triton X RTM)、聚山梨醇酯(例如，Tween RTM)、泊洛沙胺(例如，Tetronic RTM)、泊洛沙姆(例如，PluronicRTM)和山梨聚糖酯。要使用的离子或非离子表面活性剂的选择依据要执行的凝集测定的类型和正在分析的样品类型。应对用于具体测定和样品类型的表面活性剂进行筛选以确定表面活性剂相容性。
例如，当测试血液以确定血型时，非离子表面活性剂是优选的，如以下实施例中将讨论的。非离子表面活性剂与血液一起使用以维持细胞的等渗环境，从而防止细胞裂解。
所述凝集剂可包括能够产生凝集物的物质中的任一种或其组合。物质的实例包括化学凝集剂和生物凝集剂。对于红血细胞的凝集，化学凝集剂可选自诸如以下的物质：聚合阳离子，包括但不限于：聚-L-赖氨酸氢溴酸盐、聚(二甲基二烯丙基铵)氯化物(例如，RTM、RTM、RTM)、聚-L-精氨酸盐酸盐、聚-L-组氨酸、聚(4-乙烯基吡啶)、聚(4-乙烯基吡啶)盐酸盐、交联聚(4-乙烯基吡啶)、甲基氯季盐、聚(4-乙烯基吡啶-共聚-苯乙烯)；聚(4-乙烯基吡啶聚(氟化氢))；聚(4-乙烯基吡啶-对甲苯磺酸盐)；聚(4-乙烯基吡啶-三溴化物)；聚(4-乙烯基吡咯烷酮-共聚-2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯)；交联聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯吡咯烷酮、聚(三聚氰胺-共聚-甲醛)；部分甲基化；溴化己二甲胺；聚(谷氨酸,赖氨酸)1:4氢溴酸盐；聚(赖氨酸,丙氨酸)3:1氢溴酸盐；聚(赖氨酸,丙氨酸)2:1氢溴酸盐；琥珀酰化聚-L-赖氨酸；聚(赖氨酸,丙氨酸)1:1氢溴酸盐；以及聚(赖氨酸,色氨酸)1:4氢溴酸盐。最优选的聚合阳离子是聚(二甲基二烯丙基铵)氯化物。
化学凝集剂用于引起任何红血细胞的凝集，因此它们可用作血液凝集测定的阳性对照，并且也可用于凝集红血细胞以确定血细胞比容水平，如以下实施例中将讨论的。
生物凝集剂是能够产生凝集物的任何生物性质的物质。对于红血细胞的凝集，实例包括蛋白质诸如外源凝集素(能够可逆地结合糖类结构的蛋白质)和抗体(例如，抗A、抗B、抗D)、病毒(例如，流感病毒)、抗原、DNA、RNA和基于DNA或RNA的适体。生物凝集剂用于确定红血细胞或样品中的感兴趣的特定分析物的存在或不存在。例如，抗体抗A用于检测红血细胞表面上抗原A的存在或不存在。作为另一实例，流感病毒用于确定血浆中存在的对抗所述病毒的抗体的量并且确定患者样品的免疫水平。
表征由凝集剂引起的分析物的凝集量的步骤优选地是通过视觉/光学表征。已报道的其他表征方法包括使用电化学(例如，阻抗谱)、吸光度和浊度技术。然而，这些技术的实施需要另外的硬件设备和对DMF装置的若干修改，使得使用通过操作员视觉检查凝集反应的结果进行的视觉表征或使用相机的本过程是相当有利的，因为无需对系统进行任何另外的修改。
视觉表征可通过人视觉观察DMF装置以估计凝集量来进行。另选地，使用相机执行视觉表征的步骤。可使用的相机的非限制性实例包括网络摄像头、手机相机、数码相机(包括数码单反相机DSLR)、摄像机、监控相机、傻瓜相机、带CCD检测器的相机、带CMOS检测器的相机、单色相机、黑白相机、彩色相机。为了进行涉及相机的视觉/光学表征，开发出DMF上液滴凝集评估(DAAD)。DAAD是用于自动检测DMF装置上的液滴中的凝集物的图像分析算法。DAAD算法可存储在与相机相关联的微处理器中，或它们可存储在连接到控制DMF装置的驱动电极的DMF电源的微处理器上，或可存储在远程计算机上。DAAD算法可由微处理器或计算机执行。
在一个实施方案中，凝集剂包括涂覆有凝集剂的颗粒。非限制性实例包括聚合物(例如，乳胶)、金、银、纳米颗粒和微米颗粒。根据感兴趣分析物，颗粒涂覆有凝集剂。例如，为了检测抗原，颗粒涂覆有抗体或能够捕获感兴趣抗原的其他剂。在检测抗体的情况下，颗粒应涂覆有抗原或能够捕获感兴趣抗体的其他剂。
所述方法可用于聚合物颗粒的悬浮液的凝集。非限制性实例包括用于风疹抗体检测的涂覆乳胶颗粒、21涂覆有用于检测任何病毒的抗体的乳胶颗粒、22涂覆有链球菌溶血素O的乳胶颗粒、23涂覆有用于C反应蛋白检测的抗体的乳胶颗粒、24用于识别金黄色葡萄球菌的涂覆乳胶颗粒、25以及用于识别任何类型的细菌的涂覆乳胶颗粒。
本文所公开的方法可用于纳米颗粒悬浮液的凝集。非限制性实例包括涂覆有用于检测抗原的抗体的纳米颗粒以及涂覆有用于检测特异性抗体的抗原的纳米颗粒。
所述方法可用于红血细胞的悬浮液的凝集以确定患者的血型，如以下实施例中将讨论的。在此应用中，流体是至少仅包含红血细胞的血液样品。将这些血细胞与液体稀释剂混合，所述液体稀释剂诸如但不限于血浆、等渗缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS))、含有PBS和血清白蛋白(例如，人血清白蛋白、牛血清白蛋白)的溶液。
然而，将了解，可使用此方法表征其他类型的血液样品，包括全血(白细胞和红细胞、血小板和血浆)，还可包括稀释的血液(取全血的一部分并将其与别的东西混合，举一些实例而言)，白血细胞、血清和血浆的悬浮液。
所述方法可用于红血细胞的悬浮液的凝集以确定血细胞比容水平，如以下实施例中将讨论的。在此应用中，流体是包含至少红血细胞的血液样品。可将这些血细胞与液体稀释剂混合。在此实例中，可使用任何凝集剂来确定血细胞比容水平。
可使用此方法表征其他类型的流体样品，包括液体稀释剂中的病毒悬浮液，所述液体稀释剂诸如但不限于全血、血清、血浆、等渗缓冲溶液(例如，PBS)、含有PBS和血清白蛋白(例如，人血清白蛋白、牛血清白蛋白)的溶液、鼻粘液、鼻咽粘液、尿液和唾液。这些流体样品可与凝集剂混合以用于病毒检测。
可使用此方法表征其他类型的流体样品，包括任何其他类型的真核细胞的悬浮液。所述凝集剂可以是能够引起细胞凝集的任何物质。
实施例
现在将讨论本文所公开的方法的非限制性和示例性实施例，但将了解，本公开不限于这些实施例。
实施例1
图2所示的第一实施例是血型定型测定，其使用血液凝集抗体引起红血细胞凝集。使用一组3种抗体(单克隆或多克隆)—对抗原A(抗A)、B(抗B)和RhD(抗D)以及A和B的共混物(抗A,B)特异性—确定ABO和恒河猴(Rh)血型。在图2所示的实施例中，将凝集试剂以溶液形式加载到装置中；还展示类似的方法，其中将凝集试剂作为干燥点预加载到装置上，所述干燥点在暴露于样品或另一试剂(例如，溶解缓冲液)时溶解。完整的测定只需几分钟，并且是完全自动化的。
在使用预干燥试剂的实施例中，如Foley等人18在US2014/0141409A1中所描述执行重组。
所述测定依赖于称为红血球凝集的现象。根据美国国家医学图书馆，血细胞凝集(或红血球凝集)被定义为“通过凝集素包括抗体、外源凝集素和病毒蛋白进行的红血球的聚集”。26传统上，已经使用血细胞凝集测定检测在红血细胞膜上发现的表面标记物(抗原)的变异或多态性，以按类别(血型)对血液进行分类。目前有339种经认证的血型抗原，其中297种属于33种血型系统中的一种。在这些血型系统中，ABO和Rh因为它们在输血医学中的重要性而是最著名的系统。
ABO系统具体地是独一无二的，因为它是其中抗原不存在于红血细胞的表面上、相反互补抗体(reciprocal antibody)一致地且可预测地作为血浆中的可溶性实体被发现的唯一血型系统。ABO抗原通常叫做组织血型抗原，因为它们的广泛分布意味着它们通常也可用作组织相容性抗原。最重要的是，抗A和抗B的广泛分布使得不同血型的输血是灾难性的，因为溶血性输血反应(HTR)会导致不相容的肾脏、肝脏和心脏移植物的超急性排斥反应。同样，Rh抗原通常用于预防胎儿和新生儿溶血病(HDFN)。27,28
此实施例中所描述的测定在血液样品中实施；相关测试可在血清中进行，这通常称为反定型。在反定型中，将患者的血清与具有已知表面抗原的红血细胞(例如，ABO的A细胞和B细胞)混合，并且血细胞凝集的观察结果指示对应抗体的存在或不存在。29在任一哪种格式(正或“反”)中，都存在开发新颖、快速且易于执行的血型定型测定的强烈动机，如预计到2022年将达到25亿美元的全球血型定型市场所证明。30
实施例2
新平台的另一应用是使用所述系统进行血液供体-受体交叉匹配，这是在(时间宝贵的)高风险环境诸如急诊室或创伤护理实验室中必须快速现场执行的关键操作。具体地，在这种环境下献血浆的第一步是根据ABO/Rh系统确定受体的类型以便能够识别供体的类型(例如，B+供体用于B+受体)。但是这种选择性水平是不够的，因为还有许多其他未被ABO/Rh系统捕获的可能会导致不相容的子类型，使得通常执行第二步(通常在患者的床边，就在输血之前执行)，其中针对与患者血液的凝集直接测试来自潜在供体的血浆。图6中示出通过DMF红血球凝集执行并且通过DAAD分析的模拟交叉匹配测试的实施例。在此实施例中，发现四个潜在供体中的两个与潜在受体相容。
实施例3
红血细胞的凝集可用于确定血液样品的血细胞比容。图5是示出用于确定血细胞比容水平的DMF凝集测定的结果的图式。在图5的左侧示出个液滴，它们具有不同血细胞比容水平(红血细胞体积与总血液体积之比)—20％(上)、40％(上二)、60％(下二)、80％(下)。将液滴与化学凝集剂混合，从而导致红血细胞的非特异性凝集。血细胞比容水平越高，凝集点就将越大。血细胞比容水平可通过裸眼估计或使用数码相机确定。在右侧示出经处理的使用数码相机捕获的图像的输出。像素强度差异可用于确定样品的血细胞比容水平。
特别是对于血细胞比容确定，在像素总数的一小部分之间(包含地)发现的像素强度的积分被定义为‘血细胞比容分数’。[图7在初始实验中，找到来自人为定义的血细胞比容水平在20％与60％之间的稀释血液样品的训练集的血细胞比容分数，并且将其绘制为血细胞比容水平的函数并与二阶多项式：y＝-0.0249x2+1.092x+107.3拟合。]将每个液滴的血细胞比容分数与校准曲线进行比较以确定预测％血细胞比容(图8)。
图7示出用于确定血细胞比容水平的DMF凝集测定的结果。在图7的左侧示出五个液滴，它们具有不同血细胞比容水平(红血细胞体积与总血液体积之比)–60％(上)、50％(上二)、40％(上三)、30％(下二)、20％(下)。类似于图5，将液滴与化学凝集剂混合，从而导致红血细胞的非特异性凝集。血细胞比容水平越高，凝集点就将越大。
图8示出作为已知血细胞比容水平的函数的血细胞比容分数的校准曲线。标记物是实验数据，并且误差条表示每个条件下n＝3次实验的±1标准偏差。虚线二阶多项式拟合到数据，其中R2＝0.9990。
图9示出使用黄金标准(左)和DMF-DAAD方法(右)从来自志愿者的12个手指点刺全血样品收集的血细胞比容测量结果的条形图。对于这组12个样品，黄金标准与DMF-DAAD方法之间的比较产生p≥0.5045。
实施例4
图3所示的本公开的第四实施例是乳胶免疫凝集测定(LIA)，其使用乳胶颗粒的悬浮液来检测感兴趣分析物。在分析物不存在的情况下，珠作为单独单元悬浮，并且悬浮液看起来“平滑”(即，没有异质团块)，而在分析物存在的情况下，颗粒聚集，从而形成肉眼可见的异质凝集物。这些测定具有广泛的实用性，诸如检测单价和多价抗原、蛋白质、药物、类固醇激素以及甚至微生物。31LIA通常被临床医生用于流感检测、32和抗生素易感性测试。33对于后者，对能够在耐或不耐抗生素的细菌的菌株之间进行分辨以确定开出哪种疗法有极大兴趣。例如，医院中被感染的主要原因是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌34(MRSA)；显然，给感染MRSA的患者开出甲氧西林浪费时间和资源。作为原理证明，开发出DMF上基于乳胶珠的凝集测定以用于检测细菌的菌株中的甲氧西林耐药性和易感性，如图3所特写的。
在此实施例中，将细菌的易感菌株(第一样品—左侧的一对液滴)和耐药菌株(第二样品—右侧的一对液滴)与涂覆有青霉素结合蛋白2(PBP2)抗体(单克隆或多克隆)的乳胶珠混合(每对中的左侧液滴)。还将每个样品与涂覆有对PBP2非特异性的抗体的乳胶珠混合，以作为阴性对照(每对中的右侧液滴)。结果指示：第一样品显示出弱凝集，从而指示易感性(表明感染这些细菌的患者可能够用甲氧西林治疗)，并且第二样品显示出强凝集(表明感染这些细菌的患者应接受另选治疗)。总之，基于DMF的测定允许快速检测可通过肉眼容易地识别的三种状态：无凝集(对于阴性对照)、抗生素易感细菌的弱凝集和耐抗生素细菌的强凝集)。
凝集结果的视觉确定
凝集测定的最简单检测模式是用户用肉眼观察；此方法适用于上述已经付诸实践的实施例。但是凝集也适于通过图像处理来完成自动化。已经有若干流体通道中的血细胞凝集的自动化检测的报道，但它们依赖于辅助设备(例如，显微镜、5波导、35等)和复杂的后处理程序。例如，Huet等人5在MATLAB中训练人工网络来检测凝集的进展，但算法不是通用的，并且每个新的成像设置需要新的训练集。
相比之下，如图4A和图4B所描绘的本方法是直截了当的，并且可应用于任何带有数码相机的系统。为了进行涉及相机的光学表征，在8个步骤中执行DMF上液滴凝集评估(DAAD)。对于血型定型(图2)、乳胶凝集测定(图3)、血细胞比容分析(图5)和供体相容性测试(图6)，前六个图像预处理步骤(i-vi)是相同的。
图4A-I示出步骤i)，其中使用相机来收集装置的图像。相机相对于垂直于DMF装置的平面成一定角度定位。通常以每台相机的最大分辨率捕获图像(但也可处理更低分辨率的图像)。
图4A-ii示出步骤ii，其中通过定义源图像中的四个坐标和四个参考坐标来对图像进行透视校正。基于每组坐标(图像-参考对应对)计算3×3矩阵，然后将相同的矩阵应用于源图像以获得透视校正图像。
图4A-iii示出步骤iii)，其中通过检测已知装置特征来自动定位DMF装置的中心，并且隔离图像的此区域以用于进一步处理。
图4A-iv示出步骤iv，其中通过识别轮廓并组合相邻轮廓以形成每个液滴的用于定义掩模以提取图像的矩形感兴趣区域(ROI)来检测液滴。
图4A-v示出步骤v，其中将对应于每个液滴的ROI图像进行遮蔽、隔离并从RGB转换为灰度。
图4B-左侧示出步骤vi，其中将每个隔离的图像展平为一维阵列并进行归一化，使得像素强度覆盖整个8位范围[0-255]，然后按像素值从最低到最高进行排序。
图4B-右侧示出步骤vii，其中接着将此梯度中的像素强度的斜率用作凝集程度的指示(在血型定型、供体相容性测试、步骤viii中使用的过程)。例如，在图4B中，A、D(Rh)和A,B共混物的像素强度的陡峭斜率指示凝集，而B的平坦斜率指示无凝集。开发出类似的图像处理方法来使乳胶珠凝集的检测(图3)自动化，与先前报道相比，突出显示此方法的灵活性。5
在视觉表征内，可执行其他分析方法。测试三种另选凝集检测算法并将其与DAAD进行比较：直方图方法、标准偏差方法和方差方法。在直方图方法中，执行DAAD子步骤(i)–(v)以隔离每个ROI图像。对于每个图像，根据每个像素强度值的像素数生成直方图。用移动平均滤波器(窗口＝10个箱)使直方图平滑，并且在平滑的数据集中，通过借由比较像素强度与相邻值找到局部最大值来识别主峰。
将平滑的直方图中的主峰的平均像素强度定义为阈值T。最后，将凝集分数定义为100×(S>T/S)，其中S是ROI图像中的像素数，并且S>T是强度大于T的像素数。在标准偏差方法(改编自先前报道36)中，执行DAAD子步骤(i)–(vi)，之后(再次)将阵列归一化到范围[0,1]，并且将像素强度的标准偏差σ定义为凝集分数。在方差方法(改编自先前报道5,6,37)中，执行DAAD子步骤(i)–(v)以隔离每个ROI图像。使用3×3矩阵计算每个像素相对于其相邻像素的局部方差，并且确定图像中所有像素的平均方差。
将凝集分数定义为通过DAAD和三种另选方法评估一系列86个样品(344个ROI)。发现另选方法的“最佳”凝集阈值(对于最高真阳性率和最低假阳性率)对于直方图方法、标准偏差方法和方差方法分别为10a.u.、0.13a.u.和1a.u.(图10)。
总之，发明人报道能够进行凝集测定的第一双板数字微流体系统和方法。发明人已经在以上四个实施例中展示本发明的四个非限制性和示例性实施方案。第一实施方案是血型定型血细胞凝集测定—所知道的要在双板DMF装置上实施的第一实施方案。此方法被证明与溶液相或干燥凝集抗体的使用相容，可将抗体与未稀释的全血混合，数分钟内即可通过肉眼确定结果。作为血型定型测定的延伸，当血液样品与预期供体样品混合时，可执行供体相容性测试，以指示用于受体患者的正确供体(第二实施方案)。另外，展示使用红血球凝集进行以上测定，其使用化学试剂来确定样品的血细胞比容(第三实施方案)。在第四实施方案中，实施用于进行乳胶免疫凝集测定(LIA)的DMF方法。在此实施例中，针对抗生素易感性展示测试；但预计任何LIA都应是相容的。最后，利用用于解释DMF凝集测定的结果的自定义但可推广的算法报道基于成像的读数。当一起考虑时，用户可加载样品、按下按钮并且在数分钟内收到结果。
下表1是概述这里报道的新方法与文献中报道的两种先前DMF凝集方法之间的一些显著差异。
表1：使用数字微流体平台的其他凝集方法与本文所公开的本方法之间的比较。
发明人知道展示使用数字微流体进行凝集测定的文献报道，但它们都与本发明无关。7,13先前报道均未使用双板电润湿装置来执行凝集测定。相比之下，已经在双板DMF装置上展示不同类型的测定：凝结测定20和使用外源凝集素进行的血浆分离38，但以上均与本发明无关。另外，通过裸眼或使用DAAD(我们独特的检测算法，其检测利用数码相机捕获的图像中的凝集)执行凝集的检测。本方法确实依赖于使用吸光度模块来确定凝集，如先前报道的39，并且所述算法不使用任何先前报道的方法来检测凝集，因为这些方法依赖于昂贵的成像设备(显微镜设置或高端DSLR相机)7,13并且高度取决于成像条件(亮度、对比度、白平衡等)。将一些其他先前报道的方法的性能与DAAD进行比较，并且在本文中已经显示出本DAAD胜过所有这些方法。
概括地说，一方面，本公开提供一种使用具有多个驱动电极的双板电润湿数字微流体装置(DMF)表征含有分析物的样品的方法。所述方法包括以下步骤：将含有分析物和表面活性剂的流体样品与凝集剂加载到所述DMF装置上；并且使用电润湿来使流体样品与凝集剂接触以使分析物与凝集剂凝集。
另一方面，本公开提供一种双板电润湿DMF装置，其包括：第一板、与所述第一板间隔开的第二板，所述第一板和所述第二板中的一个具有多个驱动电极；以及所述第一板或所述第二板上的表面、所述第一板或所述第二板上的另一表面，所述表面具有在预选位置中涂覆所述表面的呈预干燥形式的表面活性剂，所述另一表面具有在预选位置中涂覆所述另一表面的呈预干燥形式的凝集剂。
由表面活性剂涂覆的表面和涂覆有凝集剂的表面是不同的或相同的。
本公开还提供一种试剂盒，其包括：双板电润湿数字微流体装置(DMF)，所述DMF具有多个驱动电极；表面活性剂，所述表面活性剂用于放置在所述两个板中的一个上；以及凝集剂，所述凝集剂用于放置在所述两个板中的一个上。
已经通过举例的方式示出上述具体实施方案，并且应理解，这些实施方案可易于存在各种修改和另选形式。还应理解，权利要求不意图局限于所公开的特定形式，而是意图涵盖落入本公开的精神和范围内的所有修改、等效物和另选方案。
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