一种沙眼衣原体抗原检测用增强液及检测方法
阅读说明：本技术 一种沙眼衣原体抗原检测用增强液及检测方法 (Enhancing solution for detecting chlamydia trachomatis antigen and detection method ) 是由 张树文 刘光明 丁继英 于 2021-11-15 设计创作，主要内容包括：本申请属于免疫检测技术领域,具体涉及一种沙眼衣原体抗原检测用增强液及检测方法,沙眼衣原体抗原检测用增强液包括增强液A和增强液B,所述增强液A为草酸钛钾和表面活性剂的混合溶液；所述增强液B为银离子溶液。本申请的增强液A中的表面活性剂具有增溶、润湿、乳化和去垢等作用,可消除试剂条背景不干净的情况,避免影响检测结果的观察,同时通过增强液A的还原性将增强液B中的银离子还原成银颗粒,将“胶体金*抗体-抗原-抗体(固定于膜上)的夹心复合物”变成“银颗粒-胶体金*抗体-抗原-抗体(固定于膜上)的夹心复合物”,增加试剂条的灵敏度,操作简单、不需要改变传统的生产工艺,不需要借助仪器依然能提高试剂条的灵敏度。(The application belongs to the technical field of immunodetection, and particularly relates to an enhancement solution for detecting a chlamydia trachomatis antigen and a detection method, wherein the enhancement solution for detecting the chlamydia trachomatis antigen comprises an enhancement solution A and an enhancement solution B, and the enhancement solution A is a mixed solution of titanium potassium oxalate and a surfactant; the enhancement solution B is silver ion solution. The surfactant in the enhancement solution A has the effects of solubilization, wetting, emulsification, scale removal and the like, the condition that the background of the reagent strip is not clean can be eliminated, the observation of a detection result is prevented from being influenced, meanwhile, silver ions in the enhancement solution B are reduced into silver particles through the reducibility of the enhancement solution A, a sandwich compound of colloidal gold antibody-antigen-antibody (fixed on a membrane) is changed into a sandwich compound of silver particles-colloidal gold antibody-antigen-antibody (fixed on the membrane), the sensitivity of the reagent strip is increased, the operation is simple, the traditional production process is not required to be changed, and the sensitivity of the reagent strip can be still improved without an instrument.)
技术领域
本申请属于免疫检测技术领域，具体涉及一种沙眼衣原体抗原检测用增强液及检测方法。
背景技术
体外诊断试剂在临床检测中应用很广，其示踪物有很多种：胶体金、乳胶颗粒、荧光微球、荧光素、时间分辨微球、磁颗粒等等。其中胶体金应用较广。
胶体金试剂的主要原理是：将特异性抗体固定于硝酸纤维素膜上检测区，在样品区滴加样品后，借助毛细作用，样品泳动至玻璃纤维膜、胶体金结合垫，样品液会将结合垫中的金标复合物溶解，并与样品进行抗原抗体反应，形成抗原-标记抗体-胶体金颗粒的复合物，继续泳动至硝酸纤维素膜的检测区，带有金标记的复合物被检测区抗原捕获，形成捕获抗体-抗原-标记抗体-胶体金颗粒的复合物，呈现红色条带。如样品中没有待测抗原，则不发生结合，即不显色。在硝酸纤维素膜检测区附近一般再固定上针对金标结合物相应的抗体作为质控带，无论样品中有无待测物，质控线都应显示，如无，则检测失败。整个过程一般在10-30分钟内完成，操作简单、快速，且不需任何仪器。
为了提高胶体金方法的灵敏度，日本富士集团基于胶体金方法，通过银放大技术提高感光度和特异性的技术来进行照相显影，简而言之，就是在“捕获抗体-抗原-标记抗体-胶体金颗粒的复合物”基础上通过银颗粒聚集在金颗粒附近，放大复合物的尺寸，使检测线条带更清晰，从而提高胶体金检测灵敏度。但该技术改变了试剂条的传统构造，新添了增强液的加样孔和吸水纸，提高了生产的复杂度和试剂的成本，无法采用传统生产线进行生产。而且，该技术虽然提高了检测灵敏度，但是需要借助于机器进行检测操作，检测条件要求高，提高了检测成本，不便于临床大规模检测。不仅如此，该技术在银扩增后存在背景不干净的现象，影响检测结果的观察。
除了日本富士集团之外，英国立明的衣原体快速检测试剂盒（免疫层析法）操作简单，保持了传统生产工艺，生产成本低，但灵敏度有待提高。
发明内容
为了解决目前日本富士的检测试剂盒背景不干净、操作复杂，以及英国立明的检测试剂盒灵敏度不够的问题，本申请公开了一种沙眼衣原体抗原检测用增强液及检测方法，增强液A为草酸钛钾和表面活性剂的混合溶液，其中的表面活性剂具有增溶、润湿、乳化和去垢等作用，可帮助消除试剂条背景不干净的情况，避免影响检测结果的观察，同时通过增强液A的还原性将增强液B中的银离子还原成银颗粒，将“胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物”变成“银颗粒-胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物”，增加试剂条的灵敏度，在原有试剂条的基础上增加增强液，操作简单、不需要改变传统的生产工艺，不需要借助仪器依然能提高试剂条的灵敏度。
第一方面，本申请提供一种沙眼衣原体抗原检测用增强液，采用如下的技术方案：
一种沙眼衣原体抗原检测用增强液，包括增强液A和增强液B，所述增强液A为草酸钛钾和表面活性剂的混合溶液；所述增强液B为银离子溶液。
具有还原性的增强液A，将增强液B液中游离的银离子还原成银颗粒，通过将“胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物”变成“银颗粒-胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物”，有效的增加了试剂条的灵敏度。
作为优选，上述增强液A中草酸钛钾的质量百分比浓度为2-3%，表面活性剂的质量百分比浓度为2-10%；所述增强液B为5-15 μmol/L的硝酸银溶液。
作为优选，上述表面活性剂为triton X-100、吐温-20和NP40中的一种或几种。
作为优选，上述表面活性剂为triton X-100和吐温-20 的混合物。
作为优选，上述triton X-100和吐温-20的质量比为1:0.5-1.5。
作为优选，上述增强液A为：2-3%质量百分比浓度的草酸钛钾、4-6%质量百分比浓度的triton X-100和4-6%质量百分比浓度的吐温-20。
作为优选，上述硝酸银溶液的浓度为15 μmol/L。
第二方面，本申请提供一种沙眼衣原体抗原检测方法，采用如下的技术方案：
一种沙眼衣原体抗原检测方法，包括如下步骤：先向试剂条滴加待检样品，间隔一段时间后向试剂条滴加所述的增强液A，再隔一段时间后向试剂条滴加所述的增强液B，判断检测结果。
作为优选，上述检测方法具体为，先向试剂条滴加待检样品，10 min后从加样孔滴加增强液A，5 min后再从加样孔滴加增强液B，再过5 min判定阴性和阳性结果。
作为优选，上述增强液A的滴加量为0.1-0.15 mL，所述增强液B的滴加量为0.1mL。
本申请具有如下的有益效果：
（1）本申请的沙眼衣原体抗原检测用增强液，其中的增强液A为草酸钛钾和表面活性剂的混合溶液，其中的表面活性剂具有增溶、润湿、乳化和去垢等作用，可帮助消除试剂条背景不干净的情况，避免影响检测结果的观察，同时通过增强液A的还原性将增强液B中的银离子还原成银颗粒，将“胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物”变成“银颗粒-胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物”，增加试剂条的灵敏度，在原有试剂条的基础上增加增强液，操作简单、不需要改变传统的生产工艺，不需要借助仪器依然能提高试剂条的灵敏度。
（2）本申请的增强液A中的表面活性剂优选triton X-100、吐温-20和NP40等非离子型表面活性剂，可以有效提高增强液A的稳定性，不容易受无机盐和酸碱溶液的影响。
（3）本申请的增强液A中的表面活性剂优选triton X-100和吐温-20 的混合物，其中triton X-100和吐温-20的质量比为1:0.5-1.5，发明人经大量试验发现，增强液A中选择上述用量比的两种表面活性剂，有助于获得干净的试剂条的背景且不影响试剂条的灵敏度。
附图说明
下面结合附图和实施例对本申请进一步说明。
图1是本申请的检测原理图。
具体实施方式
现在结合实施例对本申请作进一步详细的说明。
试剂条的制备：
（1）制备胶体金
通过柠檬酸钠还原法制备胶体金。将100ml、0.01%氯金酸水溶液置于磁力搅拌器上加热至沸腾。在搅拌环境下，加入2mL的1%柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸。煮沸15min，直到溶液的颜色呈现透明酒红色。然后，在室温下冷却、用去离子水补充至原始体积，4℃保存备用。使用紫外分光光度计扫描200nm-800nm处的吸收峰，确定烧制的胶体金的最大吸收峰和吸光度。
（2）胶体金标记物的制备
确定胶体金标记抗沙眼衣原体抗体的最佳pH值及最小标记浓度：用0.2 M的K2CO3，调节胶体金溶液的pH值至5.0、5.5、6.0、6.5和7.0、7.5、8.0，各取1 mL，分别加入沙眼衣原体抗体 100 mL（1mg/mL），振荡混匀后，室温静置15min。每管加入20 mL的10%NaC1混匀，室温静置15 min，使胶体金溶液颜色稳定不变。
调节胶体金溶液pH至最佳值（pH 7.0），各取1mL至一系列干净的离心管中，分别加入0，0.5，1、2、4、6、8、10，12，14 mg的沙眼衣原体抗体，混匀后静置5 min，各加入100 mL10%NaCI，混匀后室温静置2h，以胶体金颜色稳定不变的沙眼衣原体抗体量10 mg为最小标记蛋白量。在最小标记量基础上增加20%作为最佳标记蛋白量。
制备胶体金-衣原体抗体偶联物：首先将1mL上述制备好的胶体金溶液加入烧杯中，使用200mM的硼酸缓冲液调节胶体金的PH值至最适PH值（即PH=8.4），在搅拌的条件下，将已经用50mM PBS稀释好的沙眼衣原体抗体（CT，浓度为2.0mg/ml）逐滴加入，继续搅拌15min，然后加入40ul 10%BSA封闭液进行封闭，封闭时间为3 h。封闭结束后，将上述混合液置于高速离心机中进行离心，离心条件为转速4℃、8000r/min、10min，弃上清，用1mL、20mM的PBST洗涤沉淀，重复离心洗涤3次，以除去多余的未结合胶体金的抗体，最终用含有0.5%酪蛋白、0.03%叠氮钠的100mM的PBS重悬至100 mL，涡旋混合，置于4℃下保存待用。
（3）样品垫的制备
使用50mM 磷酸盐缓冲液（0.5% CaseinA，0.5% PEG8000）浸泡样本垫2 h，置于37℃真空干燥6 h。
（4）金标结合垫的制备
使用50mM Tris-HCI（1% BSA，0.5% Tween-20）缓冲液浸泡结合垫，浸泡1 h后取出沥干，置于37 ℃真空干燥6 h。
在温湿度分别为37℃、40%的条件下，使用自动化喷点机将已经制备好的胶体金-衣原体抗体溶液喷至已经处理好的上述结合垫上，喷量为2.0 mL /cm，制成金标结合垫。
（5）试剂条的制作
在温湿度分别为37℃、40%的条件下，使用自动化喷点机将沙眼衣原体抗体和兔抗鼠二抗喷到硝酸纤维素NC膜上分别作为检测（T）和质控线（C线）质量浓度均为1.2 mg/mL，喷量均为1.0 mL/cm，然后置于37 ℃真空过夜干燥；将上述处理好的样本垫、金标结合垫、NC膜、吸水纸粘在PVC底板上，然后自动切条机将其切成4mm宽，包装成卡，即得到制备好的沙眼衣原体检测免疫层析试纸条。
增强液的制备（增强液A中各组分均为质量百分比浓度）：
增强液A1：2 %的草酸钛钾、10%的triton X-100。
增强液A2：2.5%的草酸钛钾、5%的triton X-100、5%的吐温-20。
增强液A3：3 %的草酸钛钾、3%的triton X-100、3%的NP40、3%的吐温-20。
增强液A4：2.5%的草酸钛钾、5%的NP40、5%的吐温-20。
增强液A5：2.5%的草酸钛钾、5%的triton X-100、5%的NP40。
增强液A6：2.5%的草酸钛钾、4%的triton X-100、3%的吐温-20、3%的NP40。
增强液B1：5 μmol/L硝酸银溶液。
增强液B2：10 μmol/L硝酸银溶液。
增强液B3：15 μmol/L硝酸银溶液。
增强液B4：20 μmol/L硝酸银溶液。
分别将上述增强液应用于沙眼衣原体抗原检测中，测试不同增强液的选择对于检测结果的影响，具体方法为：将沙眼衣原体抗原先分别稀释至5×107 IFU/mL、1×106 IFU/mL，用沙眼衣原体试剂条进行检测，所有的试纸条加入待检样品后10 min滴加0.1 mL增强液A至加样孔，5 min后滴加0.1 mL增强液B至加样孔，5 min后判定阴性和阳性结果。将实验结果分别记录于表1和表2中：
表1 沙眼衣原体抗原浓度为5×107 IFU/mL时的实验结果
表2 沙眼衣原体抗原浓度为1×106 IFU/mL时的实验结果
结合表1和表2可以看出：在增强液B的阴离子浓度为5-15 μmol/L时，采用增强液A1-A6均可以获得较为干净的背景（除了表1中增强液A5搭配增强液B3的情况），说明5-15 μmol/L的银离子浓度有助于获得干净的背景。另外，从表2中可以看出，当沙眼衣原体抗原浓度为1×106 IFU/mL时，只有增强液A2搭配增强液B3的情况具有较高的灵敏度，结合表1中增强液A2搭配增强液B3的情况具有干净的背景和“++++”强阳性的结果，可知，以5%的tritonX-100、5%的吐温-20作为表面活性剂的增强液A2和15 μmol/L硝酸银溶液的增强液B3配合起来可以在保证背景干净的同时获得更高的灵敏度。
因此，通过实验对比可以看出，以triton X-100和吐温-20作为表面活性剂配合草酸钛钾配制而成的增强液A更加有利于提高检测的灵敏度，增强液B中较高的银离子浓度不利于获得干净的背景，宜将银离子浓度控制在15 μmol/L以下。
采用本申请的增强液的检测原理：
检测时，将处理过的标本滴入检测卡加样孔内，标本液体与胶体金结合垫中预先包被的用胶体金颗粒标记的沙眼衣原体特异性抗体及蓝色乳胶标记的亲和素混合。然后，混合物随之在毛细效应下向另一端层析。如果是阳性标本，胶体金颗粒标记的沙眼衣原体抗体先与标本中的沙眼衣原体抗原结合形成胶体金*抗体-抗原复合物，在层析过程中经过测试区时，复合物会被固定在测试区的另一个沙眼衣原体抗体所捕获，形成胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物。在增强液A、增强液B的作用下，增强液A具有还原性，将增强液B液中游离的银离子还原成银颗粒，游离的胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物大量地聚集在金核附近，使测试区（T）处的胶体金外围形成一层银外壳最终形成“银颗粒-胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物”，在测试区（T）内会出现一条黑色条带。如果是阴性标本，由于不含沙眼衣原体抗原，则测试区（T）内不能形成上述夹心复合物，将没有黑色条带出现。膜上的质控区（C）内固定有生物素-BSA联结物，将捕获混合物中层析过来的蓝色乳胶颗粒标记的亲和素，在质控区（C）形成蓝（绿）色乳胶*亲和素-生物素-BSA（固定于膜上）的复合物。因此，无论沙眼衣原体抗原是否存在于临床标本中，一条蓝色条带都会出现在质控区（C）内。质控区（C）内所显现的蓝色条带是判定是否有足够标本、层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
沙眼衣原体胶体金免疫试纸条的性能检测：
根据上述检测原理，以下检测过程中，所有的试纸条加入待检样品后10 min滴加增强液A至加样孔，5 min后滴加增强液B至加样孔，5 min后判定检测结果。（备注：根据性能检测验证的需要，表3、表6和表7中的实验数据，为试剂条结果判读时置于免疫层析检测仪上进行检测，得到的实验数据）
一、灵敏度检测：将沙眼衣原体抗原用先稀释至5×107 IFU/mL，然后再倍比稀释10次，用沙眼衣原体试剂条进行检测，记录实验结果，每个浓度重复检测三次，计算三次检测T线胶体金信号值的平均值，见表3。沙眼衣原体检测试剂可以实现105 IFU/mL的检测。并与英国立明公司生产的英国立明衣原体快速检测试剂盒（免疫层析法）进行对比实验，结果见表4。
表3
从表3可以看出：本申请采用增强液的沙眼衣原体检测试剂可以实现105 IFU/mL的检测，并且样本浓度越高，信号值越稳定，产品的检测结果越稳定。
表4
从表3和表4可以看出：本发明沙眼衣原体检测试剂可以实现1.95*105 IFU/mL的检测，而英国立明可以实现3.13*106 IFU/mL的检测，即与英国立明公司生产的英国立明衣原体快速检测试剂盒（免疫层析法）相比，本发明沙眼衣原体检测试剂灵敏度增强了10倍。
二、特异性检测：检测以下浓度的干扰物和交叉物对沙眼衣原体胶体金免疫试纸条的性能影响情况：50μl/ml全血，10mg/ml粘蛋白，50μL/ml尿液，5mg/mL制霉菌素（栓），5mg/mL咪康唑（栓），5mg/ml替硝唑（凝胶），5mg/ml甲硝唑（凝胶），20μL/mL洁尔阴（洗液），20μL/mL肤阴洁（洗液）；变形杆菌，痢疾志贺氏菌，甲型溶血性链球菌，乙型溶血性链球菌，丙型链球菌，人型支原体，解脲脲原体，人乳头瘤病毒，表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，白色念珠菌，阴道毛滴虫（以上微生物浓度均为1×107IFU/mL）。检测结果见表5：
表5
从表5可以看出，以上干扰物和交叉物对衣原体检测试剂的性能无影响。
三、重复性：用高值（2.5E7）、中值（3.13E6）、低值（7.81E5）三个浓度样本对试剂条进行重复性检测试验，每个浓度检测10次，计算10次测量的T线胶体金信号值的平均值、标准偏差和变异系数。重复性在20%以内。结果见表6：
表6
从表6可以：在高中低浓度样本时本申请采用增强液的沙眼衣原体检测试剂变异系数均在20%以内，产品重复性好，满足临床检测的要求。
四、稳定性：37℃放置一个月，分别于第1、3、5、7、14、21、30天取出试剂条，用高值（2.5E7）、中值（3.13E6）、低值（7.81E5）三个浓度样本对试剂条进行重复性检测试验，每个浓度检测5次，记录5次测量的T线胶体金信号值的平均值，记录成表，计算7次检测的统计结果，计算T线胶体金信号值的平均值、标准偏差和异系数。结果见表7：
表7
从表7可以看出，试剂条的稳定性良好。
在传统的胶体金免疫层析试剂盒基础上，本申请应用了在还原剂作用下将金颗粒周围的银离子还原成银颗粒，通过将“胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物”变成“银颗粒-胶体金*抗体-抗原-抗体（固定于膜上）的夹心复合物”，有效的增加了试剂条的灵敏度，可以实现105 IFU/mL的检测。与英国立明公司生产的英国立明衣原体快速检测试剂盒（免疫层析法）相比，灵敏度增强了10倍。为广大的基础临床检验提供了更大的帮助。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
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