一种龙须菜苗种切段的快速出芽方法
阅读说明：本技术 一种龙须菜苗种切段的快速出芽方法 (Rapid budding method for cutting asparagus seedlings ) 是由 钟晨辉 林琪 佘婷婷 唐隆晨 周文发 于 2021-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种龙须菜苗种切段的快速出芽方法,包括如下步骤：1)选择完整、健康的龙须菜,清洗藻体,去除附生杂藻；选取藻体主杆用消毒刀片剔除侧枝,切成长度为1.2-1.8cm的藻段；2)配置盐度为0-6.5％的低盐培养液；3)藻段在低盐培养液中浸泡1-6h；4)藻段在正常盐度培养液中恢复培养。采用本发明的方法,不仅出芽快,出芽数量增加,且相对生长速率增加。(The invention discloses a quick sprouting method for cutting asparagus seedlings, which comprises the following steps: 1) selecting complete and healthy asparagus, cleaning the frond and removing epiphytic mixed fronds; selecting main stems of algae, removing side branches with a disinfection blade, and cutting into sections with the length of 1.2-1.8 cm; 2) preparing a low-salt culture solution with the salinity of 0-6.5%; 3) soaking the algae segments in low-salt culture solution for 1-6 h; 4) the algae section is restored to be cultured in the culture solution with normal salinity. By adopting the method, the germination is fast, the germination quantity is increased, and the relative growth rate is increased.)
技术领域
本发明涉及一种龙须菜苗种切段的快速出芽方法。
背景技术
盐度是调控海藻生长发育的重要生态因子之一，决定着海藻的分布情况。关于盐度胁迫对海藻的影响已被大量的报道。1999年，Martins等发现盐度与Mondego(葡萄牙)河口的肠浒苔(Enteromorpha intestinalis)生长速率有关，海水盐度低于5psu或高于25psu时肠浒苔的生长速率较低，当盐度降至1psu以下时藻体会死亡；贺丽虹等(2002)通过对细基江蓠繁枝变型(Gracilaria tenuistipitata var.liui)的研究发现，过高或者过低的盐度都将对细基江蓠琼胶产量和质量产生影响；相关研究还表明一定范围内盐度的增加可以引起紫菜(Porphyra)中甘露醇的积累；高盐胁迫下鼠尾藻(Sargassum thunbergii)的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)显著性降低，转移至正常海水中培养后迅速恢复到正常水平。
龙须菜(Gracilariopsis lemaneiformis)是我国重要的海藻养殖品种之一，具有重要的经济和生态价值。目前，龙须菜的栽培主要依靠营养繁殖的方式来进行。营养体繁殖虽然生长快，操作简单，但我国南方夏季高温期漫长，藻体生长周期短，产业发展依然面临着需要加快苗种生产的问题。如何在有限的适养时间里，通过优化苗种繁育方式，提高龙须菜生长速率，对增加龙须菜产量具有重大的产业实践意义。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种龙须菜苗种切段的快速出芽方法。
本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：
一种龙须菜苗种切段的快速出芽方法，包括如下步骤：
1)选择完整、健康的龙须菜，清洗藻体，去除附生杂藻；选取藻体主杆用消毒刀片剔除侧枝，切成长度为1.2-1.8cm的藻段；
2)配置盐度为0-6.5％的低盐培养液，其中，当盐度为0时，所述的低盐培养液为水；
3)藻段在低盐培养液中浸泡1-6h；
4)藻段在正常盐度培养液中恢复培养。
优选地，藻段在低盐培养液中浸泡3-6h。
进一步优选，藻段在低盐培养液中浸泡3h。
优选地，步骤1)中，完整、健康的龙须菜先在温度22±0.5℃，光照强度15μmol·m-2·s-1；光照周期12L︰12D，盐度26‰，培养液为Provasoli培养基的环境中培养1-3周，每3d更换一次培养液。
优选地，低盐培养液是Provasoli培养基加水稀释而成。
本发明技术方案与背景技术相比，具有如下优点：
采用本发明的方法，不仅出芽快，出芽数量增加，且相对生长速率增加。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为实施例和对比例龙须菜藻段经不同盐度胁迫不同时间后恢复至正常盐度培养液中培养28d时的出芽数。
图2为不同实施例和对比例低盐处理对龙须菜生长的影响(28d)。
图a-u分别为：a.对照组；b.淡水处理1h；c.淡水处理3h；d.淡水处理6h；e.淡水处理12h；f.盐度6.5‰盐水处理1h；g.盐度6.5‰盐水处理3h；h.盐度6.5‰盐水处理6h；i.盐度6.5‰盐水处理12h；j.盐度6.5‰盐水处理20h；k.盐度13‰盐水处理1h；l.盐度13‰盐水处理3h；m.盐度13‰盐水处理6h；n.盐度13‰盐水处理12h；o.盐度13‰盐水处理20h；p.盐度19.5‰盐水处理1h；q.盐度19.5‰盐水处理3h；r.盐度19.5‰盐水处理6h；s.盐度19.5‰盐水处理12h；t.盐度19.5‰盐水处理20h；u.龙须菜淡水胁迫20h，藻体在4天内全部死亡.
图3淡水胁迫对龙须菜切段再生过程中Fv/Fm的影响
注：藻段未处理前(OS)、胁迫结束(ST)、恢复正常盐度培养2d(R2)、恢复正常盐度培养6d(R6)、恢复正常盐度培养11d(R11)、恢复正常盐度培养16d(R16)、恢复正常盐度培养21d(R21)。
具体实施方式
原料：所用龙须菜为“鲁龙1号”新品种，采自福建省莆田市南日岛海域，在阴凉避光条件下运回实验室。以自然灭菌海水清洗龙须菜表面，以软毛刷子刷洗清除表面附着杂藻，清理完毕用灭菌海水在室内实验室培养2周以适应实验室环境。培养条件：温度22±0.5℃，光照强度15μmol·m-2·s-1；光照周期12L︰12D，盐度26‰，培养液为Provasoli培养基，每3d更换一次培养液。
材料处理：选择完整、健康的龙须菜，清洗藻体，去除附生杂藻。选取藻体主杆(用消毒刀片剔除侧枝)，切成长度为1.5cm的藻段进行实验。
低盐培养液配置：蒸馏水为0‰；取实验室常用的Provasoli培养基(Control，26‰)加蒸馏水，按3:1、1:1以及1:3比例分别将培养液盐度稀释至19.5‰、13‰、6.5‰。
实施例1盐度0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫0‰处理，处理时间设置为1h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
实施例2盐度0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫0‰处理，处理时间设置为3h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
实施例3盐度0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫0‰处理，处理时间设置为6h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例1盐度0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫0‰处理，处理时间设置为12h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例2盐度0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫0‰处理，处理时间设置为20h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养(盐度26‰)基，每3d更换一次培养液。
实施例4盐度6.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫6.5‰处理，处理时间设置为1h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
实施例5盐度6.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫6.5‰处理，处理时间设置为3h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
实施例6盐度6.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫6.5‰处理，处理时间设置为6h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例3盐度6.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫6.5‰处理，处理时间设置为12h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例4盐度6.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫6.5‰处理，处理时间设置为20h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例5盐度13.0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫13.0‰处理，处理时间设置为1h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例6盐度13.0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫13.0‰处理，处理时间设置为3h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例7盐度13.0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫13.0‰处理，处理时间设置为6h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例8盐度13.0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫13.0‰处理，处理时间设置为12h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例9盐度13.0％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫13.0‰处理，处理时间设置为20h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例10盐度19.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫19.0‰处理，处理时间设置为1h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例11盐度19.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫19.0‰处理，处理时间设置为3h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例12盐度19.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫19.0‰处理，处理时间设置为6h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例13盐度19.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫19.0‰处理，处理时间设置为12h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例14盐度19.5％
将预先切段好的藻段20根/组，转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，进行低盐胁迫19.0‰处理，处理时间设置为20h，胁迫结束立即恢复至正常盐度培养液中培养28d。每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，正常盐度培养液为Provasoli培养基(盐度26‰)，每3d更换一次培养液。
对比例15盐度26％
胁迫设计：将预先切段好的藻段20根/组，分别转入规格为含有150mL培养液的180mL的透明塑料杯中，26.0‰中培养25d，每组处理设置3个生物学重复。实验期间统一控制培养条件：温度22±0.5℃，光照强度30μmol·m-2·s-1，光照周期12L︰12D，培养液为Provasoli培养基，每3d更换一次培养液。
所有实施例和对比例均每隔3d测一次其生长指标(包括：鲜质量FW和总出芽数TB)，用相机记录生长情况，实验周期为28d。
计算龙须菜藻段在实验周期内的生物量(鲜重，FW)的变化，以评估其生长。相对生长速率(RGR)的计算公式如下：
式中，WO：实验开始时藻段的鲜重(g)；Wt：实验结束时藻段的鲜重(g)；t：实验天数。
结果表明：
观察实验周期(28d)内所有对比例和实施例龙须菜藻段的生长情况，实施例短时(t<12h)的低盐胁迫可以加快龙须菜出芽速度，增加藻体切段的出芽个数，总出芽数均高于对比例。淡水(0‰，实施例1-3)胁迫3h～6h效果最好，出芽数最多；淡水胁迫超过20h(对比例2)，藻体从第三天开始发白、碎裂，藻体消亡(图1、图2)。出芽总数影响龙须菜藻段鲜质量(FW)的变化，出芽越快、出芽数越多，在后续的培养中FW增加越快，藻体生长优势越明显。龙须菜藻段在不同盐度下耐受不同时间的低盐胁迫后恢复至正常盐度培养液中培养28d，藻段FW的增加情况显著不同(表1)。淡水胁迫时间小于6h的藻段增重较多(实施例1-3)，对应的相对生长速率(RGR)高，与对照组(对比例15)之间差异显著(P<0.05)。培养28d时，淡水胁迫3h(实施例3)的藻段FW增加多，生长速度最快，GRG高达0.9149％·d-1，较对照组提高了61.2727％；淡水胁迫时间≥12h的藻段FW出现负增长，因藻段大量吸水且持续的时间过长，藻体颜色逐渐褪去、溃烂，最终消亡。淡水胁迫20h藻段受胁迫最严重，相对生长速率为-8.6191％·d-1，藻段短时间内全部死亡(尚有部分白化藻段残留)。对比例4盐度稍高，处理时间稍长，出芽效果也较佳，但是处理时间长，如果生产上大量堆积在一起浸泡时间较长，容易烂掉，风险也大大增加。
实验结果显示，短时间的低盐胁迫对龙须菜藻切段再生具有促进作用，以淡水胁迫3h效果最佳。
表1.龙须菜藻段低盐胁迫过后再恢复至正常盐度培养液中培养28d时的鲜质量(FW)增加情况
表2.龙须菜藻段淡水胁迫过后再恢复至正常盐度培养液中培养28d内的相对生长率
龙须菜藻段应对不同时间的淡水胁迫后恢复至正常盐度培养液中培养过程中Fv/Fm变化趋势如图3所示。短时(1h～3h)淡水胁迫，藻段Fv/Fm有轻微的下降，但依然接近对照组的水平，转移至正常盐度培养液中培养后能恢复到对照组水平，甚至略高于对照组，表明龙须菜可以很好的适应短时低盐胁迫，短时低盐胁迫对龙须菜的光合活性没有显著的负面影响。淡水20h胁迫，藻段Fv/Fm值迅速下降至接近0，转入正常盐度培养液中培养无法恢复，说明龙须菜藻段在长时间的淡水胁迫下受到了不可逆的损伤。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。