一种柏子或柏子提取物及其用途
阅读说明：本技术 一种柏子或柏子提取物及其用途 (Semen Platycladi or semen Platycladi extract and its application ) 是由 叶阳 唐希灿 章海燕 姚胜 王维 季萍 于 2013-08-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种柏子或柏子提取物的用途。具体地,本发明柏子或柏子提取物用于具有良好的抗疲劳效果,可用于制备抗疲劳的组合物,其中,所述的柏子提取物具有以下一个或多个特征：(a)所述提取物的分子量分布为280-310；(b)所述提取物中不饱和脂肪酸总含量≥80wt％；和/或(c)所述提取物中来源于柏子的二萜类物质总含量≤0.5wt％。本发明柏子或柏子提取物在食品及保健品领域具有广泛应用。(The invention provides an application of cedar seed or cedar seed extract. Specifically, the cedar seed or cedar seed extract disclosed by the invention has a good anti-fatigue effect and can be used for preparing an anti-fatigue composition, wherein the cedar seed extract has one or more of the following characteristics: (a) the molecular weight distribution of the extract is 280-310; (b) the total content of unsaturated fatty acid in the extract is more than or equal to 80 wt%; and/or (c) the total content of diterpenoid substances derived from the cedar seeds in the extract is less than or equal to 0.5 wt%. The cedar seed or cedar seed extract of the invention has wide application in the fields of food and health care products.)
本申请是申请日为2013年08月12日、申请号为201310349888.5、发明名称为“一种柏子或柏子提取物及其用途”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及中药提取物领域，具体地，涉及一种从柏子中提取的高活性成分，作为提高认知能力、改善认知功能障碍、抗疲劳药物及功能食品的用途。
背景技术
认知功能是指人脑加工、储存和提取信息的能力，包括记忆、语言、视空间、执行、计算和理解判断等方面的能力[1]。认知功能障碍是指上述一项或多项能力受损，常见于各种类型的痴呆患者，其中最高发的是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和血管性痴呆(vascular Dementia,VaD)。
AD是发生于老年前期或老年期，以进行性痴呆、认知障碍为主要症状，同时伴有精神行为异常的神经退行性疾病。其特征性临床表现为严重的学习记忆功能下降、分析判断能力衰退、情绪改变、行为失常、甚至意识模糊。随着人类社会年龄结构老龄化，老年性痴呆症发病率日趋上升，已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的第三大健康杀手。据报道，65岁以上老年人口中，AD的患病率占总人口的4wt％-7wt％，80岁以上的老年人可达20wt％；至2015年，我国老年人口将超过2亿，本世纪40年代后期可能突破4亿。AD发病率随着人口老龄化的进展呈逐年上升的趋势，寻找治疗AD的有效药物已成为医药领域的研究热点之一。
AD的临床表现主要为智能和认知功能障碍，属于中医呆病、善忘、痴呆、文痴等范畴。中药具有效性确切和安全低毒的特点，在以AD为代表的认知功能障碍病症的预防和治疗方面具有更大的潜力。
柏子仁(arboruitae seed)，又称柏实，为裸子植物柏科侧柏(Platycladusorientalis(L.)Franco)的干燥成熟种仁。主产于山东、河南、河北等地。柏子仁味甘、性平，有养心安神、敛汗、润肠通便之功效。柏子仁应用历史悠久，始载于《神农本草经》，列为上品。《神农本草经》记载“主惊悸、安五脏、益气、除风湿痹，久服令人润泽美色、耳目聪明、不饥不劳、轻身延年”；《本草纲目》记载：柏子仁具有“养心气，润肾燥，安魂定魄，益智宁神，烧沥，泽头发，治疥癣”功效，用于惊悸怔忡，失眠健忘，盗汗，肠燥便秘。明代倪朱漠在《本草汇言》中提到，“柏子仁味甘气平……，此药气极蜂芬芳，则脾胃所喜；质及润泽，则肝肾所宜。故前古谓安养五脏、主惊悸、定心神、悦颜色、聪耳目，为延年却痛之上剂也。”
近年化学研究表明，柏子仁含脂肪酸、柏木醇、谷甾醇和二萜类成分，其中二萜类成分主要红松内脂(pinusolide)、15,16-双去甲-13-氧代半日花-8(17)-烯-19酸(15,16-bisnor-13-oxo-8(17)-labdene-19-oic acid)、15,16-双去甲-13-氧代半日花-8(17)；11E-二烯-19-酸、二羟基半日花三烯酸(12R,13RS-dihydroxyconmunic acid)。另有α-雪松醇(α-cedrol)，柏子仁双醇(platydiol)，5-羟基松柏酸(5-hydroxypinusolidie acid)。酚酸性化合物包括：(+)-儿茶精[(+)-Catechin]、(-)-表儿茶精[(-)-epicatechin]及其聚合体丙氰定B1，B3(Proeyanidin Bl，B3)、5-羟基-7,4-二甲氧基黄酮(5-hydroxy-7,4-dimethoxy flavone)和木质素等。
近年药理研究表明，柏子仁具有促智、镇静、润畅通便的作用。1992年日本学者西山信好[西山信好等，国外医学中医药分册，1992,14(4),53-54.]通过小鼠被动学习回避试验探讨了柏子仁对破坏杏仁核小鼠学习障碍的作用，明暗室法试验中表明，柏子仁乙醇提取物250,500mg/kg口服给药对对杏仁核破坏后小鼠的学习障碍无效，但在跳台试验中能明显改善、保持、恢复记忆，但对大脑皮层、海马、丘脑下部的乙酰胆碱酯酶活性未见影响。日本学者楮鹏江[楮鹏江等，国外医学中医药分册，1993,15(2),40-41.]研究柏子仁对前脑基底核破坏小鼠被动回避学习障碍的影响时发现，避暗法和跳台试验表明，柏子仁乙醇提取物250,500mg/kg口服给药后对前脑基底核破坏小鼠的被动学习障碍有改善作用，但对运动低下无拮抗作用。Nishiyama等[Nishiyama N,et al.,Phytotherapy Research,1992,6,289-293.]。
研究表明，柏子仁乙醇提取物250,500mg/kg口服给药对扁桃体损伤引起的记忆获得障碍有改善作用，但未能改善记忆保持，对皮质、海马和下丘脑中的胆碱乙酸基转移酶的活性未见作用，对扁桃体损伤引起的显微病理改变未见影响。
因此，本领域迫切需要开发一种对提高认知能力、改善认知功能障碍有良好效果、活性成分高且易获得的提取物及其组合物。
发明内容
本发明提供了的柏子提取物，具有活性剂量高、提高认知能力、改善认知功能障碍、抗疲劳效果明显的优点。
本发明提供了一种柏子或柏子提取物的用途，，用于制备抗疲劳的组合物。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物、食品组合物和/或保健品组合物。
在另一优选例中，所述的柏子提取物具有以下一个或多个特征：
(a)所述提取物的分子量分布为280-310；
(b)所述提取物中不饱和脂肪酸总含量≥80wt％；和/或
(c)所述提取物中来源于柏子的二萜类物质总≤0.5wt％。
在另一优选例中，所述的柏子提取物还具有以下一个或多个特征：
(d)所述的提取物中的二萜类含量小于0.5wt％或无；
(e)所述的提取物还含有10-14wt％的饱和脂肪酸。
在另一优选例中，所述提取物同时具有所述特征(a)、(b)、(c)、(d)和(e)。
在另一优选例中，所述的提取物还用于制备促智的组合物。
在另一优选例中，所述的柏子提取物的含量被配制成每日施用剂量为0.01-50mg/kg体重；更佳地，为30-40mg/kg体重(小鼠)，约为0.3-45mg/kg体重(人),。
在另一优选例中，所述的二萜类物质包括红松内脂、15,16-双去甲-13-氧代半日花-8(17)-烯-19酸、15,16-双去甲-13-氧代半日花-8(17)；11E-二烯-19-酸、二羟基半日花三烯酸、南洋杉酸、13-表柏酸(13-epicupressic acid)；
在另一优选例中，所述的提取物中，南洋杉酸的含量≤0.5wt％，13-表柏酸(13-epicupressic acid)的含量≤0.5wt％。
在另一优选例中，其中，所述的饱和脂肪酸包括棕榈酸、硬脂酸；
所述的不饱和脂肪酸包括油酸、亚油酸、亚麻酸、9-二十碳烯酸、11-二十碳烯酸、5,11-二十烷二烯酸、12,17-二十烷二烯酸、8,11,14-二十烷三烯酸、5,11,14,17-花生四烯酸。
在另一优选例中，所述的亚麻酸含量为25wt％；
在另一优选例中，所述的柏子提取物是用以下方法制备的：
(i)获得成熟柏子粉碎，从而形成柏子粉；
(ii)将步骤(i)中获得的柏子粉经提取形成柏子提取物。
在另一优选例中，所述的提取包括超临界萃取和石油醚提取。
在另一优选例中，所述的组合物包括：(i)作为活性成分的柏子提取物，和(ii)药学上或食品上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的作为活性成分的柏子提取物具有以下一个或多个特征：
(a)所述提取物的分子量分布为280-310；
(b)所述提取物中不饱和脂肪酸总含量≥80wt％；
(c)所述提取物中来源于柏子的二萜类物质总含量≤0.5wt％。
在另一优选例中，所述的组合物的剂型为口服剂型(片剂、颗粒剂、胶囊、口服液)。
本发明第二方面，提供了一种抗疲劳的方法，给需要的对象施用有效剂量的柏子或柏子提取物。
在另一优选例中，所述的施用量为每日施用剂量为0.01-50mg/kg体重；更佳地，为30-40mg/kg体重(小鼠)，约为0.3-50mg/kg体重(人),。
在另一优选例中，所述的对象是哺乳动物，更佳地包括小鼠、大鼠、人。
在另一优选例中，所述的对象包括幼儿、儿童、青少年、老年人、易疲劳者。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1A-B显示了柏子经不同提取方法得到的活性部位以及市售鱼油对东莨菪碱致小鼠记忆障碍均有不同程度记忆改善作用，其中，带壳柏子的提取物BZ-1-SFC的效果优于其他方法获得的提取物，与其效果相当的为乙醇柏子仁提取物BZR-E，但BZR-E的剂量为BZ-1-SFC的10倍。
图2A显示了柏子提取物BZ-1-SFC多个剂量下均能不同程度的缩短小鼠到达逃脱平台的时间，而6mg/kg表现出最佳改善作用；图2B显示了BZ-1-SFC多个剂量下均能减少小鼠进入盲端的错误次数，在6mg/kg时作用也最明显。其作用强度与阳性对照石杉碱甲相当。
图3显示了BZ-1-SFC随着测试浓度的增加，抗疲劳作用效果也随之增强。其中36mg/kg能明显改善小鼠体力疲劳现象，有显著性统计意义。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次发现了对带壳柏子进行提取，所获得的提取物在很低的剂量下即对提高认知能力、改善认知功能障碍有良好的作用，本发明人同时通过实验证明，本发明提取物还能够有效地产生抗疲劳作用，在食品及保健品领域中有着广泛的应用前景。在此基础上，完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明柏子提取物”、“本发明柏子有效部位”、“本发明柏子活性部位”、“BZ-1-SFC”可互换使用，均指将带壳柏子通过提取后获得的柏子提取物，且所述的柏子提取物均具有不饱和脂肪酸含量≥80wt％，二萜类物质≤0.5wt％，并在低剂量下具有提高认知能力、改善认知功能障碍的特性。
术语“促智”、“促智活性”可以互换使用，均指对人体或动物施用药物后，具备提高认知能力、改善认知功能障碍的效果。
柏子提取物
本发明提供的柏子提取物为一种通过将带壳柏子经过超临界萃取、石油醚提取等方法获得的高活性提取物。柏子提取物具有极高含量(大于80wt％)的不饱和脂肪酸，且对提高认知能力、改善认知功能障碍无活性的物质等物质含量极小，其中二萜类物质含量≤0.5wt％。由此，本发明柏子提取物可以在极低的剂量下(0.01-50mg/kg体重，较佳地，2-10mg/kg体重(小鼠)，0.02-11mg/kg体重(人)，更佳地，为4-6mg/kg体重(小鼠)，0.04-6.6mg/kg体重(人))，对提高认知能力、改善认知功能障碍有良好作用。
本发明柏子提取物可通过超临界萃取、石油醚提取等方法进行提取。
其中，超临界萃取的方法如下：带壳或去壳柏子仁粉碎后，置于超临界萃取装置的萃取釜(设备：江苏南通华安超临界萃取有限公司，HA221-40-11型超临界萃取装置)中，在萃取釜温度为32℃、压力为25MPa、CO2流速为30-34L/h的条件下萃取1.5小时，萃取完毕后提取液转移至分离釜，在分离釜温度为38℃、压力为6MPa条件下分离出柏子仁SFC提取物。
石油醚萃取的方法如下：带壳或去壳柏子仁粉碎后，至于3000ml的锥形瓶中，加等量的石油醚(沸点60-90℃)超声提取3次，每次1h；提取液合并减压蒸干即得柏子仁石油醚提取物。
在本发明柏子提取物中，不饱和脂肪酸含量占≥80wt％，所述不饱和脂肪酸包括油酸、亚油酸、亚麻酸、9-二十碳烯酸、11-二十碳烯酸、5,11-二十烷二烯酸、12,17-二十烷二烯酸、8,11,14-二十烷三烯酸|、5,11,14,17-花生四烯酸；
本发明柏子提取物中所述的二萜类物质含量≤0.5wt％，包括红松内脂、15,16-双去甲-13-氧代半日花-8(17)-烯-19酸、15,16-双去甲-13-氧代半日花-8(17)；11E-二烯-19-酸、二羟基半日花三烯酸、南洋杉酸、13-表柏酸(13-epicupressic acid)；其中，代表性的二萜类物质包括南洋杉酸、13-表柏酸(13-epicupressic acid)。
本发明柏子提取物中，还包括10-15wt％的饱和脂肪酸，所述的饱和脂肪酸包括棕榈酸、硬脂酸。
本发明柏子提取物在低剂量下(0.01-50mg/kg，较佳地2-10mg(小鼠)，0.02-11mg/kg(人)；更佳地4-6mg/kg(小鼠)，0.04-6.6mg/kg(人))具有改善记忆、促智的作用，且还具有一定的抗疲劳效果。因此，本发明也提供了通过给需要的受试者施加有效量的所述柏子提取物来预防、改善或治疗所述疾病的方法。
组合物
本发明提供一种组合物，以所述组合物总重量计，它含有重量百分比为1-99wt％的本发明提供的柏子提取物作为活性成分和药学上或食品学上可接受的载体。
在本发明中，各种组合物可以按本领域熟知的方法配制，可以将柏子提取物与药学上或食品学上可接受的载体混合配制。药学上或食品学上可接受的载体的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。所述的有药学上或食品学上可接受的载体中还可以包含甘草提取物等天然提取物、维生素和微量元素等营养强化剂及膳食纤维、糊精。
“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋型剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的，可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。
在本发明的另一优选方式中，所述的食品学上可接受的载体或赋形剂可含有：填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓释剂。
对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；优选的，所述的剂型可选自胶囊、软胶囊、粉剂、片剂、颗粒剂、口服液、喷雾剂、霜剂、乳剂、水剂或膏体等。
本发明的组合物包括药物组合物、食品组合物、保健品组合物、食品配料组合物、膳食补充剂组合物、天然药物原料组合物、或化妆品功能成分组合物；也可以是保健饮料、酒类等。只要它们含有或基本上由柏子提取物组成即可。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
柏子提取物BZ-1-SFC促智活性总结与成人剂量换算
按照《药理试验方法学》(人民卫生出版社，第四版)中附表资料，小鼠和人的体表面折算的等效剂量比值为387.9。以小鼠1mg/kg剂量为例，计算人给药剂量＝1*0.02kg(小鼠平均体重)*387.9/70kg(人平均体重)＝0.11mg/kg。
在另一优选例中，根据本发明示范例数据，带壳柏子提取物有效剂量范围为1-50mg/kg，折算成人的剂量为0.1-5mg/kg。然而，由于药物在不同种属动物代谢的差异以及不同种属动物分子生物学的差异可能导致药物效应的浮动。因此在上述计算剂量下上下各浮动10倍，折算成人的剂量应为0.01-50mg/kg。
同理，在确定了应用于小鼠的最佳剂量后，通过此方法同样能够方便地推算的应用于成人的最佳剂量。
本发明的有益效果：
1.柏子提取物活性高，施用剂量小：本发明提供的带壳柏子提取物在低剂量下(0.01-50mg/kg，较佳地2-10mg/kg(鼠)，0.02-11mg(人)，更佳地4-6mg/kg(小鼠)，0.04-6.6mg/kg(人))即有提高认知能力、改善认知功能障碍的作用，活性较传统柏子仁提取物大幅上升(250、500mg/kg体重(小鼠))，更易于施用，从而有助于改善施用对象的服用依从性。
3.提取方法来源充足、经济、方便：本发明采用对带壳柏子的提取，取代了传统去壳柏子仁提取，效果优于去壳柏子仁的同时，大幅提升了原料获得的便利性、经济性，从而降低了生产成本，更有利于工业生产推广。
实施例1：柏子提取物的制备
1.1SFC提取：取带壳柏子288g粉碎后至于SFC中(SFC仪器型号HA221-40-11，江苏南通华安超临界萃取有限公司)，萃取条件：萃取釜温度：32℃，萃取釜温度压力：25MPa；分离釜温度：38℃，分离釜温度压力：6MPa；超临界CO2流速；30-40L/h；萃取时间：1.5h。得柏子提取物BZ-1-SFC 23.2g，得率为8.0wt％。
1.2石油醚提取：取带壳柏子5.2g粉碎后至于500ml的锥形瓶中，加入250ml石油醚，超声提取3次，每次1h。石油醚提取液合并，减压蒸馏得活性部位BZR-1-PE 1.2g，得率为23.1wt％。
对比例1柏子仁提取物的制备
1.1c SFC提取：取去壳柏子仁270g粉碎后至于SFC中(SFC仪器型号HA221-40-11，江苏南通华安超临界萃取有限公司)，萃取条件：萃取釜温度：32℃，萃取釜温度压力：25MPa；分离釜温度：38℃，分离釜温度压力：6MPa；超临界CO2流速；30-40L/h；萃取时间：1.5h。得柏子仁提取物BZR-SFC 23.0g，得率为8.5wt％。
1.2c石油醚提取：取去壳柏子仁5g粉碎后至于500ml的锥形瓶中，加入250ml石油醚，超声提取3次，每次1h。石油醚提取液合并，减压蒸馏得活性部位BZR-PE 1.2g，得率为24wt％。
1.3c乙醇提取：取去壳柏子仁20.45g按照文献(Nishiyama N,et al.,Phytotherapy Research,1992,6,289-293)提供的方法制得柏子仁提取物BZR-E2.11g，得率为10.3wt％。
实施例2：柏子或柏子仁提取物中半日花烷型二萜南洋杉酸和13-表柏酸(13-epicupressic acid)含量的测定
2.1.柏子仁提取物中半日花烷型二萜南洋杉酸(imbricatolic acid)和13-表柏酸(13-epicupressic acid)的分离与纯化：
按文献(Wang YZ.et al.,Phytochemistry,2008,69,518-526.)的方法将干燥柏子仁(10.2kg)碾碎后，在室温下用95wt％工业乙醇(20L×3)提取，经过不同的柱层析手段得化合物南洋杉酸(imbricatolic acid)81.8g，得率为8.2wt％；得化合物13-表柏酸(13-epicupressic acid)2.54g。化合物南洋杉酸和13-表柏酸(13-epicupressic acid)的波谱数据如下：
南洋杉酸，imbricatolic acid
白色粉末，[α]D(20℃)+50(c 1.5,CHCl3)；1H-NMR(CDCl3,300MHz):δ0.60(3H,s,CH3-20),0.90(3H,d,J＝6.4Hz,CH3-16),1.22(3H,s,CH3-18),3.68(2H,m,H-15),4.50(1H,s,H-17),4.84(1H,s,H-17).13C-NMR(CDCl3,75MHz):δ12.7(q,C-20),19.8(q,C-16),19.9(t,C-2),21.1(t,C-11),26.0(t,C-6),28.9(q,C-18),30.2(t,C-13),36.4(t,C-12),38.0(t,C-3),38.7(t,C-7),39.1(t,C-1),39.5(t,C-14),40.5(s,C-10),44.1(s,C-4),56.3(d,C-5),56.6(d,C-9),61.2(t,C-15),106.3(t,C-17),148.2(s,C-8),183.3(s,C-19)。上述数据与文献报道[Su,W.C.,Fang,J.M.,Cheng,Y.S.Labdanes from Cryptomeriajaponica.Phytochemistry,1994,37,1109-1114.]一致。
13-表柏酸(13-epicupressic acid)
白色粉末，[α]D(20℃)+57(c 4.5,CHCl3)；1H-NMR(CDCl3,300MHz):δ0.58(3H,s,CH3-20),1.22(3H,s,CH3-18),1.26(3H,s,CH3-16),4.43(1H,s,H-17),4.82(1H,s,H-17),5.02(1H,dd,J＝10.7,1.0Hz,H-15),5.20(1H,dd,J＝17.3,1.0Hz,H-15),5.90(1H,dd,J＝17.3,10.7Hz,H-14)；13C-NMR(CDCl3,75MHz):δ12.7(q,C-20),17.8(t,C-11),19.8(t,C-2),26.0(t,C-6),27.9(q,C-16),28.9(q,C-18),37.9(t,C-3),38.7(t,C-7),39.1(t,C-1),40.6(s,C-10),41.3(s,C-12),44.1(s,C-4),56.3(d,C-5),56.4(d,C-9),73.8(s,C-13),106.5(t,C-17),111.7(t,C-15),144.7(d,C-14),148.0(s,C-8),183.5(s,C-19)。上述数据与文献报道[Su,W.C.,Fang,J.M.,Cheng,Y.S.Labdanes from Cryptomeriajaponica.Phytochemistry,1994,37,1109-1114.]一致。
2.2.柏子提取物中南洋杉酸和13-表柏酸(13-epicupressic acid)含量测定
柏子活性部位中半日花烷型二萜南洋杉酸和13-表柏酸(13-epicupressic acid)的含量测定采用高效液相色谱(HPLC)法，液相条件为：
流动相：二氯甲烷：乙腈＝30:70等梯度洗脱
检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)
流速：1ml/min
柱色谱：Waters Acquity Column BEH RP-C18,1.7μm,2.1×100mm
柱温：40℃
测定方法：
供试品溶液的制备：精密称取活性部位20.0mg，二氯甲烷溶解后转移至100ml的容量瓶中并定容至刻度，作为供试溶液；
对照品溶液的制备：分别称取半日花烷型二萜南洋杉酸和13-表柏酸(13-epicupressic acid)各10mg，精密称定，加二氯甲烷制成1ml含200μg的溶液，即得。
分别精密量取20μl对照品和供试品溶液，加入到高效液相色谱仪自动进样器中，测定。
2.3.含量测定结果如表1所示
表1:柏子仁或柏子活性部位二萜的含量
实施例3：柏子/柏子仁提取物系列促智活性测定
柏子/柏子仁提取物系列和上市保健品鱼油对东莨菪碱(scopolamine)致小鼠记忆障碍模型的改善作用的比较
3.1实验动物
KM小鼠、24-30g雌雄兼用。
3.2样品信息
柏子SFC提取物(BZ-1-SFC)、柏子仁SFC提取物(BZR-SFC)、柏子仁石油醚提取物(BZR-PE)及柏子仁乙醇提取物(BZR-E)均按实施例1中的方法从柏子仁中提取而得；鱼油购自美国General Nutrition Corporation,GNC。
3.3实验器材
通道式小鼠水迷宫(80cm×50cm×20cm)
3.4样品处理
1)化合物采用20wt％甘油水溶液进行溶解，除BZR-E测定浓度为20mg/kg外，其余5个化合物测定浓度均为2mg/kg，按0.1ml/10g体积体重口服给药。(溶解方法和测定浓度均参考以往的实验方案，BZR-E测定浓度参考文献后降低一个数量级进行预实验。)
2)Scopolamine(东莨菪碱-损伤剂)：4.5mg/kg，按0.1ml/10g体积体重腹腔注射给药。
3)HupA(石杉碱甲-阳性对照)：0.1mg/kg，按0.1ml/10g体积体重口服给药。
3.5实验方法
水迷宫训练4天，上下午各一次。第四天训练结束后选出训练成绩达标小鼠，第五天进行药物测试。测试：口服给予不同剂量化合物40min后，腹腔注射4.5mg/kg的东莨菪碱scopolamine(对照组给生理盐水Saline)，20min后测试小鼠在1min中内到达平台的时间和进入盲端的次数。
3.6实验结果
在水迷宫模型上活性部位BZR-SFC、BZ-1-SFC对东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍的影响见表2和图1。
表2 BZR-SFC、BZ-1-SFC、BZR-E对东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍的影响
*P<0.01,**P<0.005vs 20wt％甘油水溶液；#P<0.01,##P<0.005vs scop
3.7实验结论
柏子经不同提取方法得到的活性部位以及市售鱼油对东莨菪碱致小鼠记忆障碍均有不同程度记忆改善作用，其中，带壳柏子的提取物BZ-1-SFC的效果优于其他方法获得的提取物，与其效果相当的为乙醇柏子仁提取物BZR-E，但BZR-E的剂量为BZ-1-SFC的10倍。
实施例4.柏子提取物BZ-1-SFC促智疗效最优剂量的确定
根据实施例3的结果，进一步对柏子提取物BZ-1-SFC的促智最优剂量进行确定。
4.1实验动物
KM小鼠、24-30g雌雄兼用。
4.2样品信息
柏子提取物BZ-1-SFC按实施例1中的方法由柏子提取而得；Flaxseed oil为市售药物。
4.3实验器材
通道式小鼠水迷宫(80cm×50cm×20cm)
4.4样品处理
1)BZ-1-SFC采用20wt％甘油水溶液进行溶解，BZ-1-SFC测定浓度为1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、6mg/kg和8mg/kg，按0.1ml/10g体积体重口服给药。
2)Scopolamine(东莨菪碱-损伤剂)：4.5mg/kg，按0.1ml/10g体积体重腹腔注射给药。
3)HupA(石杉碱甲-阳性对照)：0.1mg/kg，按0.1ml/10g体积体重口服给药。
4.5实验方法
水迷宫训练4天，上下午各一次。第四天训练结束后选出训练成绩达标小鼠，第五天进行药物测试。测试：口服给予不同剂量化合物40min后，腹腔注射4.5mg/kg的东莨菪碱scopolamine(对照组给生理盐水Saline)，20min后测试小鼠在1min中内到达平台的时间和进入盲端的次数。
4.6实验结果
在水迷宫模型上不同剂量的BZ-1-SFC对东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍的影响见表3和图2：
表3:不同剂量的活性部位BZ-1-SFC对东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍的影响
**P<0.005vs 20wt％甘油溶液；#P<0.01,##P<0.005vs scop
由表3和图2可见，柏子提取物BZ-1-SFC多个剂量下均能不同程度的缩短小鼠到达逃脱平台的时间，而6mg/kg表现出最佳改善作用；此外，BZ-1-SFC多个剂量下均能减少小鼠进入盲端的错误次数，在6mg/kg时作用也最明显。其作用强度与阳性对照石杉碱甲相当。
4.7实验结论
由上述结果可知，柏子提取物BZ-1-SFC在1-8mg/kg的剂量范围内均对东莨菪碱导致的学习记忆障碍有改善作用，其中，当剂量为6mg/kg时，效果最佳。
总结上述实验结果发现，在小鼠模型上，本发明提供的带壳柏子提取物在低剂量下(0.01-50mg/kg，较佳地2-10mg/kg(小鼠)，0.02-11mg/kg(人)；更佳地4-6mg/kg(小鼠)，0.04-6.6mg/kg(人))即有提高认知能力、改善认知功能障碍的作用，活性较传统柏子仁提取物大幅上升(250、500mg/kg体重(小鼠))，更易于施用，从而有助于改善施用对象的服用依从性。
实施例5：柏子仁活性部位抗疲劳活性测定
测试化合物在小鼠跑步力竭模型上，能否对体力疲劳有改善作用；同时和Flaxseeds oil进行比较。
5.1实验动物
C57/BL6小鼠、18-25g雌雄兼用。
5.2实验器材
小鼠平面道跑步机(6通道)
5.3样品处理
BZ-1-SFC、亚麻籽油(购自美国Nature Made Nutritional Products)，采用20wt％甘油水溶液进行溶解。测定浓度：BZ-1-SFC选用36mg/kg、6mg/kg和1mg/kg，按0.1ml/10g体积体重口服给药。
5.4实验方法
小鼠力竭实验周期为10天。第1天适应性跑步(15m/min，10min、不伴有电击)；第2天小鼠以15m/min，5min；20m/min，5min；25m/min，5min；30m/min，45min缓慢递增的速度(伴有电击：0.4mA)进行体能筛选，记录30m/min，45min内小鼠力竭时间和电击次数；第3天-第9天连续口服给予测试化合物；第10天以20m/min速度进行体能测试，测试前1小时进行最后一次口服给药(最长时间限定为120分钟)，记录小鼠的力竭时间和被电击次数。
5.5实验结果
柏子仁活性部位BZ-1-SFC对小鼠体力疲劳的改善作用结果见表4和图3。
表4:不同剂量的活性部位BZ-1-SFC对小鼠体力疲劳的改善作用
5.6实验结论
根据小鼠力竭时间(图3)，发现BZ-1-SFC随着测试浓度的增加，抗疲劳作用效果也随之增强。其中36mg/kg能明显改善小鼠体力疲劳现象，有显著性统计意义。
实施例6.柏子提取物BZ-1-SFC抗疲劳疗效最优剂量范围的确定
根据实施例6的结果，进一步对柏子提取物BZ-1-SFC的抗疲劳最优剂量范围进行确定。
6.1实验动物
C57/BL6小鼠、18-25g雌雄兼用。
6.2实验器材
国产小鼠跑步机(6通道)
6.3样品处理
BZ-1-SFC和Flaxseeds oil均采用20wt％甘油水溶液进行溶解。测定浓度：BZ-1-SFC选用54mg/kg、36mg/kg、18mg/kg、6mg/kg、2mg/kg和1mg/kg；Flaxseeds oil选用2mg/kg，按0.1ml/10g体积体重口服给药。
6.4实验方法
小鼠力竭实验周期为10天。第1天适应性跑步(15m/min，10min、不伴有电击)；第2天小鼠以15m/min，5min；20m/min，5min；25m/min，5min；30m/min，45min缓慢递增的速度(伴有电击：0.4mA)进行体能筛选，记录30m/min，45min内小鼠力竭时间和电击次数；第3天-第9天连续口服给予测试化合物；第10天以20m/min速度进行体能测试，测试前1小时进行最后一次口服给药(最长时间限定为120分钟)，记录小鼠的力竭时间和被电击次数。
6.5实验结论
发现BZ-1-SFC随着测试浓度的增加，抗疲劳作用效果也随之增强。其中18-36mg/kg剂量范围能明显改善小鼠体力疲劳现象，有显著性统计意义。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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