西番莲提取物在制备防治乳腺癌药物中的应用
阅读说明：本技术 西番莲提取物在制备防治乳腺癌药物中的应用 (Application of passion flower extract in preparation of medicine for preventing and treating breast cancer ) 是由 马伏宁 宋顺 黄东梅 许奕 吴斌 邢文婷 徐兵强 郭刚 王达新 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种西番莲藤叶提取物在制备防治乳腺癌药物中的应用,所述西番莲藤叶提取物中的活性成分包含异荭草素、牡荆素和异牡荆素黄酮。本发明还公开了所述西番莲藤叶提取物的提取方法。本申请所述西番莲藤叶提取物能抑制乳腺癌细胞的增殖,能抑制乳腺癌细胞的迁移,能抑制乳腺癌细胞周期；可以用于制备乳腺癌预防、治疗的药物,以及用于其他抗癌药物。(The invention discloses an application of passion flower vine leaf extract in preparing a medicine for preventing and treating breast cancer. The invention also discloses an extraction method of the passion flower vine leaf extract. The passion flower vine leaf extract can inhibit proliferation of breast cancer cells, migration of the breast cancer cells and the breast cancer cell cycle; can be used for preparing medicine for preventing and treating breast cancer and other anticancer medicines.)
技术领域
本申请涉及植物提取物应用领域，特别涉及西番莲提取物在制备防治乳腺癌药物中的应用。
背景技术
西番莲(Passiflora edulis)也被称为“百香果”，属金虎尾目(Malpighiales)西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora)植物。西番莲原产于南美洲和巴西的热带亚热带地区，因花色美丽，藤叶兼具遮荫及药用功能被世界各地引种栽培。全球西番莲属植物约500多种，可食用的约50种。我国西番莲属植物有20余种，主要分布于广东、广西、福建、贵州、云南和海南等地。西番莲(P.edulis)的果实可以用于制造果酱、果汁和红酒等，在巴西、厄瓜多尔等国是重要的经济作物，其嫩叶还可代茶冲泡饮用或作为蔬菜食用。我国医药记载西番莲的根、果、叶均可入药，《常用中草药彩色图谱》记载西番莲具有“收敛，止泻，止渴生津，行气活血。治津液少，消化不良，跌打损伤。”的药用活性。国内外研究显示，西番莲属植物中含有黄酮、酚酸、环肽和三萜类成分，在抗氧化、抗病毒、抗抑郁等方面具有较好药理活性。
乳腺癌是当今世界女性发病率最高的癌症，全世界每年约有50万妇女死于乳腺癌。MDA-MB-231为三阴性乳腺癌，是一种恶性乳腺癌细胞，约占乳腺癌患者15％但具有转移快、侵袭性高、局部复发早、预后差等特点。化疗是该类患者目前唯一有效药物治疗手段，急需寻找新的治疗药物及治疗方法。从植物中发掘治疗肿瘤的活性药物一直是全球医药科研工作者研究的方向，来自植物的紫杉醇(paclitaxel)是治疗乳腺癌和卵巢癌广泛使用的药物，但存在水溶性低、不良反应大等缺点。
本申请通过对紫果西番莲(P.edulis)的藤叶乙醇提取物的活性筛选发现：紫果西番莲(P.edulis)的藤叶提取物具有抑制乳腺癌细胞增殖的活性，进一步研究发现紫果西番莲(P.edulis)的藤叶提取物能有效抑制肿瘤细胞迁移和侵袭；其成分分析表明含有异荭草素、牡荆素等黄酮类活性成分。
发明内容
鉴以此，本申请提出一种西番莲提取物在制备防治乳腺癌药物中的应用，以开发新的具有抑制乳腺癌增殖活性的天然产物。
本申请的技术方案是这样实现的：
一种西番莲藤叶提取物在制备防治乳腺癌药物中的应用。
进一步的技术方案是，所述西番莲藤叶提取物在制备抑制乳腺癌细胞增殖药物中的应用。
进一步的技术方案是，所述西番莲藤叶提取物在制备抑制乳腺癌细胞迁移药物中的应用。
进一步的技术方案是，所述西番莲藤叶提取物在制备抑制乳腺癌细胞周期进程药物中的应用。
进一步的技术方案是，所述西番莲为紫果西番莲。
进一步的技术方案是，所述西番莲藤叶提取物中的活性成分包含异荭草素、牡荆素和异牡荆素黄酮。
更进一步的技术方案是，所述西番莲藤叶提取物抑制乳腺癌细胞增殖的IC50为222.47μg/mL。
更进一步的技术方案是，所述西番莲藤叶提取物抑制乳腺癌细胞迁移的浓度为100-2000μg/mL。
上述应用于防治乳腺癌药物的西番莲藤叶提取物的提取方法，依次包括以下步骤：
(1)采集西番莲藤叶自然干燥或35-45℃烘箱干燥，粉碎，过30-60目筛，制得西番莲藤叶粉；
(2)先用质量浓度70％-80％的乙醇室温(20-35℃)浸泡西番莲藤叶粉2-5天后，再超声波辅助提取，过滤提取液，然后进行减压蒸发获得浓缩的提取物浸膏，将所述提取物浸膏冷冻干燥获得提取物干粉；
(3)所述提取物干粉用水溶解成提取物干粉溶液，再加入萃取剂石油醚或乙酸乙酯进行萃取，萃取液进行减压蒸发获得西番莲藤叶提取物；所述萃取剂的体积为提取物干粉溶液的2-5倍。
进一步的技术方案是，步骤(2)中所述乙醇与西番莲藤叶粉的体积比为5:1；所述超声波辅助提取的条件是超声功率50-200W，超声温度20-30℃，超声波提取3次，每次30min；所述冷冻干燥的温度为-50℃至-30℃；所述步骤(2)和(3)中所述的减压蒸发条件为真空度30-50kPa，温度35-45℃。
与现有技术相比，本申请的有益效果是：
(1)本申请所述西番莲藤叶提取物能抑制乳腺癌细胞的增殖，能抑制乳腺癌细胞的迁移，能抑制乳腺癌细胞周期。
(2)本申请所述西番莲藤叶提取物提取物具备较好的抗乳腺癌活性，在乳腺癌的治疗方面具备潜在的应用价值。
(3)本申请所述西番莲的藤叶提取物可以用于乳腺癌预防、治疗的药物，以及用于其他抗癌药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的优选实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明西番莲(P.edulis)藤叶乙醇提取物对MDA-MB-231(人乳腺癌细胞，以下同)细胞增殖活力的影响。
图2为本发明西番莲(P.edulis)藤叶乙醇提取物不同萃取相对MDA-MB-231细胞增殖活力的影响。
图3为本发明西番莲(P.edulis)藤叶提取物对MDA-MB-231细胞迁移的影响。
图4为本发明西番莲(P.edulis)藤叶提取物对MDA-MB-231细胞周期的影响。
图5为本发明西番莲(P.edulis)藤叶提取物UHPLC-MS/MS分析总离子流图。
图6为本发明西番莲(P.edulis)藤叶提取物活性成分异荭草素、牡荆素、异牡荆素的质谱图。
具体实施方式
为对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，发明人结合实施例进行说明，但以下实施例所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1西番莲藤叶的活性成分提取
实验材料：紫果西番莲(P.edulis)的藤叶采自海南省海口市澄迈。
采集的藤叶40℃烘箱干燥后粉碎，过40目筛，按1：5体积比加入80％乙醇浸泡，超声波提取3次，每次30min。提取液经过减压旋转蒸发浓缩成提取物浸膏，所述提取物浸膏冷冻干燥获得提取物干粉；所述提取物干粉用水溶解成提取物干粉溶液，再加入萃取剂石油醚进行萃取，萃取液进行减压蒸发获得西番莲藤叶提取物。
所述萃取剂的体积为提取物干粉溶液的2倍。所述乙醇与西番莲藤叶粉的体积比为5:1；所述超声波辅助提取的条件是超声功率100W，超声温度5℃，超声波提取3次，每次30min；所述冷冻干燥的温度为-30℃；所述所述的减压蒸发条件为真空度30kPa，温度40℃。
实施例2 CCK-8方法测定抑制乳腺癌细胞增殖活性
用DMSO溶剂溶解实施例1的西番莲藤叶提取物配制成不同浓度(31、62.5、125、250、500μg/mL)的西番莲藤叶提取物溶液进行细胞活性测试，并使培养基中DMSO含量小于0.1％。
96孔板，按每孔接种约4000个MDA-MB-231细胞，待细胞贴壁后加入上述不同浓度的西番莲藤叶提取物的DMEM培养液(含0.25％HEPES)，以0.1％DMSO培养基为阴性对照。在处理72h后加入CCK-8，放入CO2培养箱1h后用酶标仪读取405nm吸光度，细胞活力＝(A空白组-A处理组)/A空白组×100％。
实验结果表明，西番莲藤叶的乙醇提取物均具有抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的活性，对乳腺癌细胞增殖的抑制IC50为222.47μg/mL(MDA-MB-231)(图1)。
西番莲藤叶乙醇提取物经过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取后，对乳腺癌细胞抑制增殖活性表明，在200μg/mL浓度下处理细胞72h，以乙酸乙酯萃取相的活性较好，其次为石油醚萃取相(图2)。
实施例3划痕方法测定抑制乳腺癌细胞迁移活性
24孔板按每孔2×105个细胞量接种对数生长期MDA-MB-231细胞，24h待细胞贴壁后用枪头划痕，PBS洗去漂浮细胞，用DMSO溶剂溶解实施例1所述西番莲藤叶提取物配成不同浓度的西番莲藤叶提取物提取物(25、50、100、200、400μg/mL)，24h后用结晶紫染色细胞，在显微镜下拍照，统计处理前后划痕面积变化，计算抑制迁移率。
实验结果表明：不同浓度的西番莲藤叶提取物均具有抑制MDA-MB-231细胞迁移的活性，其中400μg/mL处理与对照相比平均抑制率为96.14％(图3)。
实施例4流式细胞测定对细胞周期影响
用6孔板每孔接种5×105对数生长期MDA-MB-231细胞，培养24h至细胞贴壁，分别设置空白对照组和提取物处理组，空白组加入0.1％DMSO，提取物组加入200μg/mL西番莲提取物，DMEM培养基培养细胞24h后以不含EDTA的胰蛋白酶使细胞脱壁，1500rpm离心5min，弃上清并用预冷的PBS洗2遍，用预冷70％乙醇固定，-20℃冰箱过夜。检测前用预冷的PBS洗2遍，离心弃上清，加入2μL浓度为1mg/mL的核糖核酸酶(RNaseA)，加入400μl PI(e.g.,Cat#537059,Calbiochem,San Diego,CA)暗处反应30min后，用流式细胞仪检测提取物对细胞周期的影响。
实验结果表明：200μg/mL西番莲藤叶提取物能使G1周期细胞数量由对照的66.37％增加到72.62％，S期细胞数量由22.50％减少到17.46％。表明西番莲提取物将细胞周期阻滞在G1期，从而抑制其增殖(图4)。
实施例5、UHPLC-MS/MS检测西番莲藤叶提取物活性成分
UHPLC-MS/MS分析，DAD检测器，流动相为A(甲醇)，B(0.5％甲酸水溶液)，程序为0min-40％A，10min-60％A，15min-80％A，保持10min，25min-40％A。流速0.4mL/min，柱温28℃，进样体积10μL。质谱检测条件：电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式，扫描范围m/z100～500。
根据PLC-MS/MS质谱信息分析西番莲藤叶提取物活性组分组成，在13.0，13.8和14.7min出峰的成分经质谱鉴定分别为A：异荭草素(C21H20O11)、B：牡荆素(C21H20O10)、C：异牡荆素(C21H20O10)(图5)。质谱检测其分子离子峰m/z为449.1127[M+H]+，433.1175[M+H]+和433.1176[M+H]+(图6)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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