一种蓝莓花青素的应用
阅读说明：本技术 一种蓝莓花青素的应用 (Application of blueberry anthocyanin ) 是由 宋冬妍 温继龙 王宁 李殿俊 于航 于 2021-08-27 设计创作，主要内容包括：一种蓝莓花青素的应用,它涉及一种蓝莓花青素的应用。本发明提供一种蓝莓花青素的用途。一种蓝莓花青素的应用,莓花青素提取物在制备抗肿瘤药物中的用途。优点：由于GADD45A、GADD45B、DDIT4、CDKN1A、CHAC1ATF-4和EPHA2的表达在经蓝莓花青素处理后在HepG-2细胞中被更高地转录,因此蓝莓花青素能够通过相关途径诱导细胞凋亡；所以蓝莓花青素能够作为癌症预防的辅助成分用于制备抗肿瘤药物,尤其是对于舌鳞癌细胞系、非小细胞肺癌细胞系、肝癌细胞系和前列腺癌细胞系。(An application of blueberry anthocyanin relates to an application of blueberry anthocyanin. The invention provides application of blueberry anthocyanin. An application of blueberry anthocyanin, namely an application of a blueberry anthocyanin extract in preparation of antitumor drugs. The advantages are that: since the expression of GADD45A, GADD45B, DDIT4, CDKN1A, CHAC1ATF-4 and EPHA2 is more highly transcribed in HepG-2 cells after blueberry anthocyanin treatment, blueberry anthocyanin can induce apoptosis through related pathways; therefore, the blueberry anthocyanin can be used as an auxiliary component for preventing cancers and is used for preparing anti-tumor drugs, particularly for tongue squamous cancer cell lines, non-small cell lung cancer cell lines, liver cancer cell lines and prostate cancer cell lines.)
技术领域
本发明涉及一种蓝莓花青素的应用。
背景技术
蓝莓是杜鹃花科和越桔属的成员，以其高含量的类黄酮(花青素，黄酮醇，原花青素)和其他酚类化合物而闻名。类黄酮是一类三元环化合物，具有保护心脏的功效，已知低密度脂蛋白对人体有害易导致冠心病，而类黄酮可以抑制有害的低密度脂蛋白的产生，还有降低血栓形成的作用。调查证实，类黄酮摄入量高者，冠心病死亡率较低。花青素属于酚类化合物中的类黄酮类，而且花青素是一种强有力的抗氧化剂，它能够保护人体免受一种叫做自由基的有害物质的损伤。花青素还能够增强血管弹性，改善循环系统和增进皮肤的光滑度，抑制炎症和过敏，改善关节的柔韧性。
发明内容
本发明提供一种蓝莓花青素的用途。
一种蓝莓花青素的应用，蓝莓花青素提取物在制备抗肿瘤药物中的用途；所述蓝莓花青素提取物中蓝莓花青素的质量分数达到95％以上。
本发明优点及原理：
细胞凋亡原因有以下几个方面：
①、活性氧是细胞的凋亡诱导剂。一些引发细胞凋亡模式的物质是细胞氧化代谢的刺激物。据报道，蟾蜍灵(Bufalin)通过在人结肠癌细胞中产生活性氧诱导癌细胞自噬。因此，活性氧被认为是监测癌细胞调亡的必要介质。在该机制中细胞色素c是细胞凋亡过程中的一个关键因子。当一些因素诱导线粒体外膜破裂时，一些线粒体凋亡因子，如细胞色素c，会释放到胞质中。胞质中存在的细胞色素c可能诱导半胱天冬酶的激活，从而导致细胞凋亡。已有研究证明，胞质细胞色素c参与半胱天冬酶-9依赖性激活半胱天冬酶-3，启动凋亡程序。此外，据报道，基质金属蛋白酶的降低可以触发线粒体孔的打开，这反过来可能将细胞色素c从线粒体释放到胞质中。
②、Bax/Bcl-2比值被认为是线粒体介导的细胞凋亡的标志，细胞的凋亡与Bax和Bcl-2蛋白是否平衡表达有关。Bax可以增加线粒体膜的通透性，导致线粒体膜间空间(细胞色素c)中的蛋白质进入到胞质中。细胞色素c可以启动半胱天冬酶的激活和细胞凋亡。Bcl-2属于抗凋亡蛋白，能抑制Bax介导的线粒体膜通透性。
③、MAPK通路对p38、JNK、NFKB和p53调节细胞增殖和凋亡至关重要。众所周知，p53蛋白在细胞应激后的生长停滞和凋亡中起重要作用，包括脱氧核糖核酸损伤、氧化应激和激活癌基因。p53蛋白被用作p53调节基因的转录激活因子，可以诱导细胞周期停滞、细胞衰老或凋亡。
④、DNA损伤诱导转录物4(DDIT4)以及生长停滞和DNA损伤诱导物α和β(分别为GADD45A和GADD45B)都参与细胞的生长和凋亡调节。GADD45A和GADD45B在负生长控制中起重要作用，包括细胞死亡和抑制细胞生长。据报道，由GADD45A和GADD45B编码的蛋白质受p53肿瘤抑制因子的调节。这两种蛋白还可以通过应激反应性MTK1/MEKK4激酶激活p38/JNK激酶途径和细胞凋亡。
现有已知CHAC1和ATF-4参与响应内质网(ER)应激的内在凋亡信号通路。ER应激依赖的凋亡是由人胱天蛋白酶和Bcl-2家族促凋亡成员的激活介导的。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(CDKN1A)参与活性氧代谢过程的正向调节。CDKN1A(p21)可通过GADD45-MAPK14(p38 MAPK)-grb 2-TGFBR2-TGFbeta的系列信号传导诱导线粒体功能障碍和活性氧的产生。EPHA2是一种必需的p53非依赖性、caspase-8依赖性促凋亡因子。GADD45A、GADD45B、DDIT4、CDKN1A、CHAC1 ATF-4和EPHA2的表达在经蓝莓花青素处理后在HepG-2细胞中被更高地转录，因此蓝莓花青素能够通过相关途径诱导细胞凋亡；所以蓝莓花青素能够作为癌症预防的辅助成分用于制备抗肿瘤药物，尤其是对于舌鳞癌细胞系、非小细胞肺癌细胞系、肝癌细胞系和前列腺癌细胞系。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式是一种蓝莓花青素的应用，蓝莓花青素提取物在制备抗肿瘤药物中的用途；所述蓝莓花青素提取物中蓝莓花青素的质量分数达到95％以上。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述蓝莓花青素提取物在制备抗头颈鳞癌细胞系药物中的用途。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同点是：所述头颈鳞癌细胞系为舌鳞癌细胞SCC15。其他与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述蓝莓花青素提取物在制备抗肝癌细胞系药物中的用途。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同点是：所述肝癌细胞系为肝癌细胞HuH-7或肝癌细胞HLF。其他与具体实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述蓝莓花青素提取物在制备抗前列腺癌细胞系药物中的用途。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式六不同点是：所述前列腺癌细胞系为前列腺癌细胞C4-2B。其他与具体实施方式六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同点是：所述蓝莓花青素提取物在制备抗非小细胞癌细胞系药物中的用途。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同点是：所述非小细胞癌细胞系为非小细胞肺癌细胞H460。其他与具体实施方式八相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
采用下述实验验证本发明效果：
实施例1：一种蓝莓花青素的应用，蓝莓花青素提取物在制备抗肿瘤药物中的用途；所述蓝莓花青素提取物中蓝莓花青素的质量分数为99.3％；具体为，所述蓝莓花青素提取物在制备抗舌鳞癌细胞SCC15、肝癌细胞HuH-7、肝癌细胞HLF、前列腺癌细胞C4-2B和非小细胞肺癌细胞H460药物中的用途。
细胞活力检测：
试剂：Cell counting Kit CCK8试剂盒(日本同仁)、DMEM高糖液体培养基，RPMIMedium 1640basic，、生理盐水、胰酶细胞消化液、特级胎牛血清、青霉素-链霉素溶液。
耗材：巴氏吸管、25cm斜口正方培养瓶、15mL无菌离心管、96孔细胞培养板。
药品：蓝莓花青素提取物，纯度为99.3％。
实验方法：
(1)癌细胞和培养基选择：①、按照表1所示选择实验用癌细胞和液体培养基；②、向液体培养基中加入牛血清和青霉素/链霉素溶液制成完全培养基，所述液体培养基与牛血清的体积比9:1；所述液体培养基与青霉素/链霉素溶液的体积比为99:1，且所述青霉素/链霉素溶液中青霉素G钠盐的浓度为10KU/mL，硫酸链霉素的浓度为10mg/mL。
表1
(2)细胞培养方法：将冻存管从-80℃冰箱取出，迅速置于37℃水浴锅中，温育1min～2min，取出，将实验用癌细胞(如表1所示)吸出至15mL离心管中，加10mL的完全培养基，混匀，离心(1500rpm，5min)，离心后，弃上清，用4mL的完全培养基使其悬浮，转移至斜口细胞培养瓶中并置于37℃，5％CO2培养箱中静止培养；
(3)细胞增殖、毒性检测：首先将瓶中培养基弃掉，加入1mL的生理盐水清洗细胞(注：加入生理盐水时，将移液器置于瓶底，不宜直接用枪清洗，应轻轻摇晃培养瓶)，将生理盐水吸出，加入1mL的胰蛋白酶消化液，消化至细胞悬浮(或半悬浮)状态，加入4mL的完全培养基，用巴氏管将未悬浮的细胞重新悬浮，离心(1500rpm，5min)弃上清，加入4mL的完全培养基使其悬浮，得到细胞悬液；
(4)在96孔板中配制100μL的细胞悬液；将培养板放在培养箱预培养24小时(37℃，5％CO2)。
(5)按照蓝莓花青素浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL、12mg/mL、16mg/mL、20mg/mL和24mg/mL将蓝莓花青素提取物用完全培养基溶解，制成含蓝莓花青素培养基，并用0.22μm的滤膜过滤；
(6)按照加药组、0加药组(即不加药组)和空白组进行分组，加药组：向加药组的培养板每个孔中加入100μL不同蓝莓花青素浓度的含蓝莓花青素培养基，加药组培养板；0加药组：向0加药组的培养板每个孔中加入100μL培养基，得到0加药组培养板；空白组：空白组的培养板中每个孔为空孔，得到空白组培养板；
(7)将步骤(6)中得到的加药组培养板、0加药组培养板和空白组培养板在培养箱孵育24h。
(8)将Cell counting Kit CCK8试剂盒用液体培养基按1:10稀释，得到稀释CCK-8溶液。
(9)向步骤(7)中加药组培养板每个孔中加入100μL稀释CCK-8溶液，得到加药组CCK-8培养板；步骤(7)中0加药组培养板每个孔中加入100μL稀释CCK-8溶液，得到0加药组CCK-8培养板；向步骤(7)中空白组培养板每个孔中加入100μL液体培养基，得到空白对照培养板；(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。
(10)将加药组CCK-8培养板、0加药组CCK-8培养板和空白对照培养板在培养箱内孵育4h。
(11)用酶标仪测定在450nm处检测加药组CCK-8培养板、0加药组CCK-8培养板和空白对照培养板每个孔的吸光度。
利用Cell Counting Kit-8检测头颈鳞癌细胞系的细胞增殖-毒性，CellCounting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。
活力计算，计算结果如表2所示：
细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100
A(加药)：加药组孔的吸光度；A(空白)：空白组孔的吸光度；A(0加药)：0加药组孔的吸光度。
表2
通过表2可以看出，随着蓝莓花青素的浓度提高，舌鳞癌细胞系、非小细胞肺癌细胞系和肝癌细胞系的存活率逐渐下降，细胞生长所受的抑制效果逐渐明显，说明舌鳞癌细胞系、非小细胞肺癌细胞系和肝癌细胞系的生长明显受到了蓝莓花青素的影响，并且抑制作用与蓝莓花青素的浓度成剂量依赖型关系。相比之下前列腺癌细胞系对蓝莓花青素提取物更加敏感，前列腺癌细胞在低剂量的蓝莓花青素纯提取物中呈现高抑制率，并且不随花青素剂量的变化而变化。
结论：依据HepG-2细胞的凋亡机理来看，蓝莓花青素提取物对舌鳞癌细胞系、非小细胞肺癌细胞系、肝癌细胞系和前列腺癌细胞系具有明显的诱导癌细胞凋亡的作用。
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