一种响应型紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统及制备方法
阅读说明：本技术 一种响应型紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统及制备方法 (Response type taxol dimer and photosensitizer co-assembled nano targeting drug delivery system and preparation method thereof ) 是由 王占峰 韩海玲 谢志刚 柳时 于 2021-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种响应型紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统,载体为具有生物相容性的聚合物,载体担载有前药和光敏剂形成的共组装体,前药为利用偶氮苯键将紫杉醇偶联形成的乏氧响应型紫杉醇二聚体。可以在乏氧的肿瘤微环境中特异性响应释放化疗药物紫杉醇,精准杀伤肿瘤细胞,具有更高的紫杉醇含量,减少了相关辅料的毒副作用,并且可在特定波长的辐照下消耗氧气并发挥光动力治疗效果,促进乏氧响应型紫杉醇二聚体的更多释放,实现化疗和光动力治疗的联合治疗,稳定性良好具有较大的临床转化应用潜能。(The invention provides a response type taxol dimer and photosensitizer co-assembled nano-targeting drug delivery system, wherein a carrier is a polymer with biocompatibility, the carrier carries a co-assembly formed by a prodrug and a photosensitizer, and the prodrug is an oxygen-deficient response type taxol dimer formed by coupling taxol by utilizing an azobenzene bond. The paclitaxel laser-induced hypoxia tumor cell specifically responds and releases chemotherapeutic drug paclitaxel in hypoxic tumor microenvironment, accurately kills tumor cells, has higher paclitaxel content, reduces toxic and side effects of related auxiliary materials, can consume oxygen under irradiation of specific wavelength and exert photodynamic treatment effect, promotes more release of hypoxic response type paclitaxel dimers, realizes combined treatment of chemotherapy and photodynamic treatment, has good stability and has larger clinical transformation application potential.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种响应型紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统及其制备方法，并将其应用于抗肿瘤治疗。
背景技术
癌症一直以来都是困扰人类生命健康的难题。紫杉醇(paclitaxel,PTX)作为代表性的化疗药物，在临床上已被广泛用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及部分头颈癌的治疗。但是PTX的水溶性差，其商业注射剂型(Taxol)是通过将PTX溶解在乙醇和聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)中来制备，后者为一种非离子表面活性剂，具有严重的副作用，给病人带来痛苦。因此，迫切需要开发新型药物递送系统，以达到更好的化疗效果。
近年来，二聚体前药的自组装纳米技术成为一种新兴的高效的化疗药物递送平台。二聚体前药是通过桥连分子将两个药物分子连接在一起，在体内条件下，二聚体解聚，释放出药物分子，发挥治疗作用。PTX分子本身非常容易形成针状晶体，而引入具有柔性链结构的桥连分子，相当于给分子提供了一个“结构缺陷”，使分子旋转更加自如，促进了二聚体的自组装，即使在无助剂的条件下，也可在水中自组装为纳米聚集体。与PTX相比，二聚体分子本身的自组装性能使其与载体具有更好的相容性，从而实现了药物的超高担载，降低了载体相关的副作用。
此外，单一化疗容易造成耐药，多种不同治疗手段的联合治疗的方式可以显著改善这一情况。光动力治疗(PDT)由于较低的侵入性以及对周围正常组织较少的损伤，已经吸引了很多研究者的注意。通常，在光照条件下，某些具有高的单线态氧(1O2)产率的光敏剂会生成活性氧自由基(ROS)，尤其是1O2，这种ROS可以直接杀伤肿瘤细胞。
吲哚菁绿(Indocyanine green，ICG)是FDA批准的近红外有机染料，常被用于临床中的术中成像。目前，ICG的长波长吸收性和在没有光照射的情况下的安全性使其作为PDT中的光敏剂被广泛研究，发现它在808nm辐射下展现出优异的ROS产生性能。但是，基于ICG的PDT也存在一些挑战，包括快速的体内清除，水溶液的不稳定性以及光漂白特性。将ICG组装为纳米粒可以在一定程度上克服这些问题。
在肿瘤组织中，氧气供应和消耗之间的平衡被打破。一方面，异常的新生血管和不良的血液流动会导致氧气在肿瘤区域中不适当地扩散，另一方面，肿瘤细胞比正常细胞增殖更快，需要消耗更多的能量和氧气，也会导致肿瘤缺氧，形成了乏氧的肿瘤微环境。乏氧的肿瘤微环境对肿瘤的增殖和药物的治疗都有很大的影响。例如，通过调节多个基因，乏氧会促进肿瘤的增殖和侵袭性转移；此外，在光动力疗法中，ROS的产生与氧气密切相关，乏氧的肿瘤微环境也会限制光动力的治疗效果。
然而，乏氧的肿瘤微环境，既是挑战，也是机遇，可以根据肿瘤的乏氧特性，构建乏氧响应型前药。
发明内容
鉴于目前临床上对紫杉醇新剂型的迫切需求，本发明的目的是提供一种响应型紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统，实现化学疗法和光动力疗法联合运用，达到更好的抗肿瘤效果。其中，乏氧响应型紫杉醇二聚体前药在乏氧的肿瘤微环境中发生还原，释放出活性的紫杉醇，发挥化疗效果；同时，光敏剂ICG产生1O2进一步杀伤肿瘤细胞，此过程需要消耗氧气，导致肿瘤微环境的乏氧程度进一步加重，促进了二聚体前药释放。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种响应型紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统，所述靶向给药系统的载体为具有生物相容性的聚合物，所述载体中担载有前药和光敏剂,形成的共组装体，所述前药为利用偶氮苯键将紫杉醇偶联形成的乏氧响应型紫杉醇二聚体。
作为本发明的更优的技术方案，所述乏氧响应型紫杉醇二聚体的结构式如下：
作为本发明的更优的技术方案，所述光敏剂为ICG，所述ICG可以和PTX组装成稳定的纳米材料。
作为本发明的更优的技术方案，所述生物相容性聚合物载体选自聚合物泊洛沙姆(例如F-127)、聚(乙二醇)-聚乳酸，聚(乙二醇)-聚己内酯中的任意一种。
作为本发明的更优的技术方案，所述乏氧响应型紫杉醇二聚体的制备方法如下：
(1)有偶氮苯键连接分子的制备；
将对硝基苄醇添加到氢氧化钠水溶液中，并缓慢添加锌粉末，在搅拌下回流10小时，过滤后得到橙色固体，为化合物1；
将化合物1溶于无水二氯甲烷(CH2Cl2)中，并将溶液冷却至0℃，添加过量的4-二甲氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine,DMAP)和三乙胺，滴加对硝基苯基氯甲酸酯的无水CH2Cl2溶液，在室温下搅拌2小时，反应完成后将混合物用饱和氯化铵溶液洗涤，分离有机层，用无水硫酸镁干燥，通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到呈橙色固体，为化合物2；
(2)PTX2-Azo的制备；
将化合物2溶于无水CH2Cl2中，并将溶液冷却至0℃，加入2当量的PTX和DMAP，并将混合物搅拌过夜，用饱和碳酸氢钠洗涤后用无水硫酸镁干燥，得到的产物通过硅胶柱色谱法纯化后为乏氧响应型紫杉醇二聚体PTX2-Azo。
本发明所述一种紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统的制备方法如下：
将聚合物载体(M)、化合物PTX2-Azo、ICG以质量比7:1.5:1.5溶解在四氢呋喃中得到混合物，然后将混合物在搅拌下逐滴滴加到去离子水中，室温下避光搅拌过夜，挥发有机溶剂后，将混合物离心以除去未组装的杂质，并将上清液用去离子水透析两天，得到抗肿瘤纳米粒子[email protected](PTX2-Azo/ICG)。
本发明还有一个目的是所述一种响应型紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统的给药方式可以是注射给药、口服给药或局部给药。
本发明还有一个目的是所述一种响应型紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统应用于抗肿瘤治疗,特别是人宫颈癌的化疗/光动力联合治疗。
有益效果如下：
本发明提供的[email protected](PTX2-Azo/ICG)纳米粒粒径约在110nm左右，可以在肿瘤组织处大量富集，并在肿瘤微环境中特异性响应释放药物，精准杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长，并降低对正常组织器官的损伤；药物的质量含量在50-80％，载药量高，降低了载体的使用量，减少了载体相关的毒副作用；担载ICG，在特定波长的辐照下消耗氧气并产生大量的ROS，发挥光动力治疗效果，氧气的消耗导致肿瘤微环境乏氧情况进一步加重，促进了乏氧响应型紫杉醇二聚体前药释放更多的活性紫杉醇，增强了化疗的效果，从而实现化疗和光动力治疗的联合治疗。
综上：本发明所述抗肿瘤纳米粒子稳定性良好，载药量高，血液循环时间较长，具有较大的临床转化应用潜能。
附图说明
图1为所述乏氧响应型紫杉醇二聚体PTX2-Azo的合成路线图；
图2为以聚合物F-127为载体得到的抗肿瘤纳米粒[email protected](PTX2-Azo/ICG)的粒径图；
图3为所述抗肿瘤纳米粒[email protected](PTX2-Azo/ICG)的透射电镜照片；
图4为在常氧条件并且不加光照的情况下，所述纳米粒子对肿瘤细胞的杀伤效果；
图5为在常氧条件、808nm激光辐照(0.8W/cm2,5分钟)的情况下，所述纳米粒子对肿瘤细胞的杀伤效果；
图6为在乏氧条件并且不加光照的情况下，所述纳米粒子对肿瘤细胞的杀伤效果；
图7为在乏氧条件、808nm激光辐照(0.8W/cm2,5分钟)的情况下，所述纳米粒子对肿瘤细胞的杀伤效果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
需要指出的是，以下实施例都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明,而非限制本发明的权利要求范围。除非另有指明，本文使用的所有技术和技术用语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所理解的相同含义。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明的提供一种响应型紫杉醇二聚体和光敏剂共组装纳米靶向给药系统，所述靶向给药系统的载体为具有生物相容性的聚合物，所述载体中担载有前药和光敏剂,形成的共组装体，所述前药为利用偶氮苯键将紫杉醇偶联形成的乏氧响应型紫杉醇二聚体。
实施例1
如图1所示，本发明中所述乏氧响应型紫杉醇二聚体制备方法包括以下步骤：
(1)将6.0g对硝基苄醇(39mmol)添加到70mL氢氧化钠水溶液(5.7M)中，并缓慢添加5.0g锌粉末(75mmol)得到混合物。再将混合物在搅拌下回流10小时，然后过滤收集固体。再将固体悬浮在热甲醇中，直至各组分完全溶解得到甲醇溶液。最后将得到的甲醇溶液缓慢冷却，干燥后得到橙色固体，为化合物1，产率为50％。
(2)将24.2mg(0.1mmol)的化合物1溶于无水CH2Cl2中，并将溶液冷却至0℃并添加过量的DMAP和34.7μL三乙胺(0.24mmol)。然后滴加34.7μL(0.24mmol)的对硝基苯基氯甲酸酯的无水CH2Cl2溶液，在室温下搅拌2小时得到混合物，并通过薄层色谱监控反应程度。再将混合物用饱和氯化铵溶液洗涤并分离有机层。最后用无水硫酸镁干燥，并在减压下蒸发，通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，得到橙色固体化合物2。
(3)将40mg(0.07mmol)的化合物2溶于10mL的无水二氯甲烷中，并将溶液冷却至0℃。加入66.8mg的PTX(2当量)和9.6mg的DMAP，并将混合物搅拌过夜。然后用饱和碳酸氢钠洗涤，并用无水硫酸镁干燥。产物通过硅胶柱色谱法纯化，得到45.8mg的乏氧响应型紫杉醇二聚体PTX2-Azo，产率为80％。
实施例2、所述抗肿瘤纳米粒子[email protected](PTX2-Azo/ICG)制备方法如下：
将7mg的F-127、1.5mg的PTX2-Azo、1.5mg的ICG溶解在4mL四氢呋喃中，然后在搅拌下，将混合物逐滴滴加到10mL去离子水中，并在室温下避光搅拌过夜。挥发有机溶剂后，以3500r/min的速度将混合物离心5分钟，以除去未组装的物质。最后，将上清液用去离子水透析两天(MWCO：3.5kDa)，得到抗肿瘤[email protected](PTX2-Azo/ICG)纳米粒。
如图2所示，通过动态光散射仪得到[email protected](PTX2-Azo/ICG)纳米粒粒径约在110nm左右，ζ-电位为负电位(-18.3±2.1mV)。
通过透射电镜测定[email protected](PTX2-Azo/ICG)的表观形态如图3所示，所述[email protected](PTX2-Azo/ICG)抗肿瘤纳米粒具有完整的球形形貌，且尺寸比较均一。
实施例3、[email protected](PTX2-Azo/ICG)纳米粒体外杀伤肿瘤细胞能力考察。
通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)分析评估了[email protected](PTX2-Azo/ICG)纳米粒对人宫颈癌细胞HeLa的细胞毒性。将肿瘤细胞重悬后，接种在96孔板中并孵育过夜。然后，用100μL不同浓度的[email protected](PTX2-Azo/ICG)的新鲜培养基代替原培养基。在常氧(21％O2)或低氧(1％O2)的条件下孵育6小时后，将细胞置于黑暗中或用808nm激光辐照1分钟(0.8W/cm2)。在常氧或低氧条件下再孵育48小时后，使用BioTek ELx808酶标仪来评估肿瘤细胞的活力。
在常氧条件并且不加光照的情况下，所述纳米粒子对肿瘤细胞的杀伤效果如图4所示；在常氧条件并且808nm激光辐照(0.8W/cm2,5分钟)的情况下，所述纳米粒子对肿瘤细胞的杀伤效果如图5所示；在乏氧条件并且不加光照的情况下，所述纳米粒子对肿瘤细胞的杀伤效果如图6所示；在乏氧条件并且808nm激光辐照(0.8W/cm2,5分钟)的情况下，所述纳米粒子对肿瘤细胞的杀伤效果如图7所示。
根据上述可知：在乏氧条件下和特定波长对肿瘤细胞杀伤效果最优，说明了氧气的消耗导致肿瘤微环境乏氧情况进一步加重，促进了乏氧响应型紫杉醇二聚体前药释放更多的活性紫杉醇，增强了化疗的效果，实现了化疗和光动力治疗的联合治疗。
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