肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法
阅读说明：本技术 肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法 (Method for measuring adsorption rate of various combined stock solutions of pneumococcal polysaccharide combined vaccine ) 是由 曹方 王博雅 尹智慧 邵灵燕 朱晓云 张凡 于 2021-08-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法,包括以下步骤：对供试品进行处理,得到目标样A；对酶标板进行包被以及封闭处理；将稀释后的供试品以及目标样A分别加入到被包被以及封闭处理的酶标板中,得到供试品测试样和目标样A测试样；供试品测试样和目标样A测试样中均加入特异性抗血清,得到供试品反应样和目标样A反应样；向供试品反应样和目标样A反应样中分别加入酶标抗体,然后加入底物液进行显色反应,并测出OD值；以及根据供试品反应样和目标样A反应样中得到的OD值计算出对应的多糖含量,从而计算出吸附率,本发明具有计算出疫苗中各个血清型的结合原液的吸附率,并通过吸附率得出各型结合原液免疫原性的优点。(The invention discloses a method for measuring adsorption rates of various types of conjugate stock solutions of pneumococcal polysaccharide conjugate vaccines, which comprises the following steps: processing a sample to be tested to obtain a target sample A; coating and sealing the ELISA plate; respectively adding the diluted test sample and the target sample A into the coated and sealed enzyme label plate to obtain a test sample of the test sample and a test sample of the target sample A; adding specific antiserum into the test sample of the test sample and the test sample of the target sample A to obtain a reaction sample of the test sample and a reaction sample of the target sample A; respectively adding enzyme-labeled antibodies into a test sample reaction sample and a target sample A reaction sample, then adding a substrate solution for color development reaction, and measuring an OD value; and calculating the corresponding polysaccharide content according to the OD values obtained in the test sample reaction sample and the target sample A reaction sample, thereby calculating the adsorption rate.)
技术领域
本发明是关于利用各型多糖与载体蛋白通过化学方式结合形成多糖蛋白结合物，然后通过包被蛋白抗体将多糖蛋白结合物吸附到固相载体上，再通过各型特异性抗体血清与各型多糖反应测定吸附率方法，特别是关于一种肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法。
背景技术
抗原经佐剂吸附后，在佐剂表面和内部高度聚集，该过程不仅不改变抗原的物理和化学特性，还可将抗原物理型地呈递给免疫细胞，促进免疫细胞充分、高水平、长时间地与抗原接触，诱导免疫应答，该过程被称为“储存库效应”。但佐剂的吸附能力与其对抗原的吸附率密切相关，吸附能力越强，对抗原的吸附率越高。而佐剂对抗原的吸附率又与疫苗的免疫效果密切相关，抗原与佐剂的吸附率越高，免疫效果越好；反之免疫效果越差。因此，只有保证佐剂吸附能力强，才能实现对抗原的高吸附率并最终保证疫苗具备良好的免疫效果。
现有的测定疫苗吸附率的方法，仅仅是测量肺炎球菌多糖结合疫苗总的吸附率，无法测量肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液的每个血清型各自的吸附率。
因此，需要一种肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法，来解决上述问题
公开于该
背景技术
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法，其能够分别测得肺炎球菌多糖结合疫苗中各型结合原液的吸附率。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了一种肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
对供试品进行处理，得到目标样A；
对酶标板进行包被以及封闭处理；
将稀释后的供试品以及目标样A分别加入到被包被以及封闭处理的酶标板中，得到供试品测试样和目标样A测试样；
供试品测试样和目标样A测试样中均加入特异性抗血清，得到供试品反应样和目标样A反应样；
向供试品反应样和目标样A反应样中分别加入酶标抗体，孵育，然后加入底物液进行显色反应，并测出OD值；
根据供试品反应样和目标样A反应样中得到的OD值计算出对应的多糖含量，并根据供试品反应样和目标样A反应样的多糖含量计算出吸附率。
在本发明的一个或多个实施方式中，对所述供试品进行离心处理，离心后的上层清液，即为目标样A。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述供试品进行离心处理的条件包括：相对离心率为(5000～6500)×g、温度为4～6℃以及持续时间为5～10min。
在本发明的一个或多个实施方式中，对所述酶标板的包被过程包括：将被包被液稀释过的破伤风抗毒素加入至酶标板中，然后在2～8℃的条件下包被16～18h，再使用洗涤缓冲液洗涤酶标板1～2次。
在本发明的一个或多个实施方式中，对酶标板的封闭处理过程包括：向包被处理过的酶标板中加入封闭液，然后在温度为36.9～37℃条件下放置1～2h，再用洗涤缓冲液洗涤酶标板3～4次。
在本发明的一个或多个实施方式中，将稀释后的供试品以及目标样A分别加入到被包被以及封闭处理后的酶标板中，并在36.9～37℃的温度下孵育1～2h后，得到供试品测试样和目标样A测试样。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述供试品以及目标样A的稀释倍数为400～600倍。
在本发明的一个或多个实施方式中，向供试品测试样和目标样A测试样中分别加入特异性抗血清后，均在36.9～37℃条件下孵育1～1.5h，再用洗涤缓冲液洗涤酶标板3～4次后，得到供试品反应样和目标样A反应样。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述所述酶标抗体为HRP标记羊抗兔IgG或者AP标记羊抗兔IgG。
在本发明的一个或多个实施方式中，将所述酶标抗体按照1：5000～8000稀释后再分别加入至供试品反应样和目标样A反应样中，在温度为36.9～37℃的条件下孵育1～1.5h后，再用洗涤缓冲液洗涤酶标板5～6次。
在本发明的一个或多个实施方式中，所述显色反应的条件包括：在温度为36.9～37℃的条件下放置15～20min，再分别加入硫酸溶液进行终止酶反应，最后用酶标仪读取OD值。
与现有技术相比，根据本发明实施方式的一种肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法，将供试品以及目标样A分别加入至被包被以及封闭处理过的酶标板中，孵育后得到供试品测试样和目标样A测试样，再将特异性抗血清分别加入至供试品测试样和目标样A测试样后，分别得到供试品反应样和目标样A反应样，再将酶标抗体分别加入至供试品反应样和目标样A反应样中，孵育后再加入底物液进行显色反应，然后得到OD值，最后计算得到供试品反应样和目标样A反应样多糖含量，根据多糖含量计算得到各型结合原液吸附率。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
根据本发明优选实施方式的肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法，其包括以下步骤：
对供试品进行处理，得到目标样A。
其中，对供试品的处理过程可以为供试品进行离心处理，离心后的上层清液，即为目标样A。
需要说明的是，供试品与目标样A中均含有在一起的肺炎多糖与破伤风载体蛋白。
具体的，对试品进行离心处理的条件包括：相对离心率为(5000～6500)×g、温度为4～6℃以及持续时间为5～10min。
对酶标板进行包被以及封闭处理。
其中，对酶标板进行包被处理的过程为：将被包被液稀释过的破伤风抗毒素加入至酶标板中，然后在2～8℃的条件下包被16～18h，再使用洗涤缓冲液洗涤酶标板1～2次。即完成包被过程。
需要说明的是，上述过程的目的是将破伤风抗毒素连接在固相载体(酶标板)上。
在上述包被过程中，可以实用碳酸盐缓冲液作为包被液。同时洗涤缓冲液洗涤的每次的使用量为300μl/孔，其中，孔是指酶标板孔。
其中，对酶标板进行封闭处理的过程为：向包被处理过的酶标板中加入封闭液，然后在温度为36.9～37℃条件下放置1～2h，再用洗涤缓冲液洗涤酶标板3～4次，即完成封闭过程。
需要说明的是，上述过程的目的是屏蔽破伤风抗毒素中的其他功能基团，只允许下述操作中的供试品以及目标样A中的破伤风载体蛋白与破伤风抗毒素相结合，从而固定在酶标板上。
在上述封闭过程中，可以使用含5％BSA或10％小牛血清的PBS缓冲液作为封闭液，每个酶标板孔中加入的封闭液的量为200μl。
将稀释后的供试品以及目标样A分别加入到被包被以及封闭处理的酶标板中，然后在36.9～37℃的温度下孵育1～2h后，使供试品测试样和目标样A测试样与已吸附到固相载体上的破伤风抗毒素结合。
其中，供试品以及目标样A的稀释倍数可以为400～600倍。上述步骤的目的是将供试品以及目标样A中的破伤风载体蛋白与破伤风抗毒素相结合，从而固定在酶标板上。
供试品测试样和目标样A测试样所在的酶标板孔中均加入相应型别特异性抗血清，得到供试品反应样和目标样A反应样。
其中，上述过程种的具体步骤为：供试品测试样和目标样A测试样中均加入相应型别特异性抗血清后，在36.9～37℃条件下孵育1～1.5h，再用洗涤缓冲液洗涤酶标板3～4次后，得到供试品反应样和目标样A反应样。
需要说明的是，特异性抗血清是指各个血清型的肺炎抗体。上述过程的目的是供试品以及目标样A中肺炎多糖分别与各个血清型的肺炎抗体相结合，从而固定在酶标板中。为了将本肺炎球菌多糖结合疫苗的各型结合原液分离，酶标板中要准备20种不同的特异性抗血清，即与20种不同血清型的肺炎球菌多糖结合疫苗相匹配的20种抗体。
向供试品反应样和目标样A反应样中分别加入酶标抗体，孵育，然后加入底物液进行显色反应，并测出OD值。
其中，加入酶标抗体以及孵育的具体的过程为：将所述酶标抗体按照1：5000～8000稀释后再分别加入至供试品反应样和目标样A反应样中，在温度为36.9～37℃的条件下孵育1～1.5h后，再用洗涤缓冲液洗涤酶标板5～6次。
其中，酶标抗体为HRP标记羊抗兔IgG或者AP标记羊抗兔IgG。
其中，显色反应的条件包括：在温度为36.9～37℃的条件下放置15～20min，再分别加入硫酸溶液进行终止酶反应，最后用酶标仪读取OD值。
需要说明的是，上述过程中酶标抗体与供试品反应样和目标样A反应样中的抗体相结合，形成抗原抗体复合物，复合物与后续添加的底物液进行显色反应，并测量OD值。
其中，如使用HRP标记羊抗兔IgG作为酶标抗体，底物液可以使用OPD，则对应的酶标仪在490nm处读取OD值；底物液还可以使用TMB，则对应的酶标仪在450nm处读取OD值.
其中，如使用AP标记羊抗兔IgG作为酶标抗体，底物液可以使用pNPP，则对应的酶标仪在405nm处读取OD值.
根据供试品反应样和目标样A反应样中得到的OD值计算出对应的多糖含量，并根据供试品反应样和目标样A反应样的多糖含量计算出吸附率。
需要说明的是，想根据供试品反应样和目标样A反应样中得到的OD值计算出对应的多糖含量，需要先将已知多糖浓度的结合原液分别稀释至1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL以及20 ng/mL。并将五组结合原液按照上述的步骤测得对应的OD值，然后建立回归方程，再将供试品反应样和目标样A反应样中的OD值带入到方程中内，即得到对应的多糖浓度。再代入下述公示中，即得出肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液的吸附率。
吸附率(％)：
其中，注：H：吸附率(％)；YS：目标样A；Y：离心前供试品。
综上所述，本发明肺炎球菌多糖结合疫苗各型结合原液吸附率测定方法的原理为：肺炎球菌结合原液是各型肺炎球菌衍生物与破伤风载体蛋白混合制备而成，本方法主要利用反向间接法先将针对破伤风载体蛋白的第二抗体连接于固相载体，用于结合结合原液中所有的破伤风载体蛋白，因肺炎多糖与破伤风载体蛋白结合，然后再加入特异抗体与样品中肺炎多糖结合，形成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。
实施例1，
称取5ml供试品并稀释400倍后均分成两份，取其中一份供试品在相对离心率为5000×g、温度为4℃的条件下离心5min，离心处理后取上层清液，即为目标样A。再另外取已知多糖浓度的结合原液分别稀释至1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL以及20ng/mL，并记为五个标准样。
另取碳酸盐缓冲液稀释后的破伤风抗毒素加入酶标板中，100μl/孔，共加入160孔，然后再2℃包被16h，然后使用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板1次。将被包被过的酶标板加入含5％BSA的PBS缓冲液，100μl/孔，在36.9℃条件下放置1h。使用洗涤缓冲液(300μl/孔)酶标板3次。
以8孔为一组，分为20组，每组8孔中每孔分别加入100μl的供试品、目标样A、五个标准样以及稀释液(作为对照组)的一种，然后在36.9℃条件下孵育1h，再用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板3次。
取稀释后的20种各型血清分别加入20组酶标板孔中，100μl/孔，每组酶标板孔仅加入一种血清，在36.9℃的条件下孵育1h，再用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板3次。
将HRP标记羊抗兔IgG按照1:5000的比例稀释后加入酶标板中，100μl/孔，在36.9℃的条件下孵育1h，再用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板5次。然后向每个酶标板孔中加入100μlOPD，在36.9℃的条件下放置15min后，用2mol/L硫酸溶液50μl/孔终止酶反应，并于酶标仪490nm处读取OD值。
最后根据每组的酶标板孔中的五个标准样的OD值，计算出每组的OD值与多糖浓度对应的回归方程，将供试品和目标样A对应的OD值带入回归方程得出对应的多糖浓度，带入吸附率公式中，即得出每组酶标板孔对应的血清型结合原液的吸附率。
实施例2，
称取5ml供试品并稀释500倍后均分成两份，取其中一份供试品在相对离心率为6000×g、温度为5℃的条件下离心85min，离心处理后取上层清液，即为目标样A。再另外称取已知浓度的多糖浓度的结合原液分别稀释至1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL以及20ng/mL，并记为五个标准样。
另取碳酸盐缓冲液稀释后的破伤风抗毒素加入酶标板中，100μl/孔，共加入160孔，然后再5℃包被17h，然后使用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板2次。将被包被过的酶标板加入含10％小牛血清的PBS缓冲液，100μl/孔，在36.9℃条件下放置1.5h。使用洗涤缓冲液(300μl/孔)酶标板3次。
以8孔为一组，分为20组，每组8孔中每孔分别加入100μl的供试品、目标样A、五个标准样以及稀释液(作为对照组)的一种，然后在37℃条件下孵育1.5h，再用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板3次。
取稀释后的20种各型血清分别加入20组酶标板孔中，100μl/孔，每组酶标板孔仅加入一种血清，在37℃的条件下孵育1.2h，再用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板3次。
将HRP标记羊抗兔IgG按照1:6500的比例稀释后加入酶标板中，100μl/孔，在36.9℃的条件下孵育1.2h，再用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板5次。然后向每个酶标板孔中加入100μlTMB，在37℃的条件下放置18min后，用2mol/L硫酸溶液50μl/孔终止酶反应，并于酶标仪450nm读取OD值。
最后根据每组的酶标板孔中的五个标准样的OD值，计算出每组的OD值与多糖浓度对应的回归方程，将供试品和目标样A对应的OD值带入回归方程得出对应的多糖浓度，带入吸附率公式中，即得出每组酶标板孔对应的血清型结合原液的吸附率。
实施例3，
称取5ml供试品并稀释600倍后均分成两份，取其中一份供试品在相对离心率为6500×g、温度为6℃的条件下离心10min，离心处理后取上层清液，即为目标样A。再另外称取已知浓度的多糖浓度的结合原液分别稀释至1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL以及20ng/mL，并记为五个标准样。
另取碳酸盐缓冲液稀释后的破伤风抗毒素加入酶标板中，100μl/孔，共加入160孔，然后再8℃包被18h，然后使用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板1次。将被包被过的酶标板加入含5％BSA的PBS缓冲液，100μl/孔，在37℃条件下放置2h。使用洗涤缓冲液(300μl/孔)酶标板4次。
以8孔为一组，分为20组，每组8孔中每孔分别加入100μl的供试品、目标样A、五个标准样以及稀释液(作为对照组)的一种，然后在37℃条件下孵育2h，再用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板4次。
取稀释后的20种各型血清分别加入20组酶标板孔中，100μl/孔，每组酶标板孔仅加入一种血清，在37℃的条件下孵育1.5h，再用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板4次。
将AP标记羊抗兔IgG按照1:8000的比例稀释后加入酶标板中，100μl/孔，在37℃的条件下孵育1.5h，再用洗涤缓冲液(300μl/孔)洗涤酶标板6次。然后向每个酶标板孔中加入100μlpNPP，在37℃的条件下放置20min后，用2mol/L硫酸溶液50μl/孔终止酶反应，并于酶标仪405nm处读取OD值。
最后根据每组的酶标板孔中的五个标准样的OD值，计算出每组的OD值与多糖浓度对应的回归方程，将供试品和目标样A对应的OD值带入会回归方程得出对应的多糖浓度，带入吸附率公式中，即得出每组酶标板孔对应的血清型结合原液的吸附率。
上述三个实施例得到的数据如下表所示：
根据表中数据可以明确得知肺炎球菌多糖结合疫苗中各型结合原液的吸附率。其中，实施例1中的33F型结合原液的数据中目标样A的多糖浓度为负值，导致计算出吸附率数值超过100％，出现误差，但该误差在允许的误差范围内，可忽略不计，并不影响本方法的测量效果。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
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