具体实施方式

以下对本发明进行详细说明。以下实施方式为用于说明本发明的例示，并非将本发明仅限定于该实施方式。本发明只要不脱离该主旨，可以任意方式进行实施。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物含有选自乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐中的至少1种的化合物作为有效成分。

本说明书中，还将选自乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐中的至少1种的化合物称作本发明的有效成分的化合物。在本发明中，可将上述化合物的1种或2种以上用作有效成分。

作为乌苏烷型三萜，可列举乌索酸、科罗索酸、2A,19A-二羟基熊果酸。作为乌苏烷型三萜的衍生物，可列举乌苏烷型三萜糖苷、具有乙酰基的乌苏烷型三萜。

乌苏烷型三萜糖苷为以乌苏烷型三萜为配基的糖苷。例如乌索酸糖苷为以乌索酸为配基的糖苷。

作为具有乙酰基的乌苏烷型三萜，可列举乙酰乌索酸、乙酰科罗索酸、乙酰2A,19A-二羟基熊果酸。作为本发明中的乌苏烷型三萜或其衍生物，优选乙酰乌索酸、乌索酸、乌索酸糖苷。作为构成乌苏烷型三萜糖苷的糖，优选单糖、二糖等。作为单糖，可列举葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖等。作为二糖，可列举麦芽糖、蔗糖、乳糖等。

作为乌苏烷型三萜及其衍生物的盐，并无特别限定，优选可口服摄取的物质。作为这样的盐，例如可列举钠、钾等碱金属盐；钙等碱土金属盐；铵盐等。

作为本发明的有效成分的化合物，优选选自乙酰乌索酸、乌索酸、乌索酸糖苷及它们的盐中的至少1种的化合物。其中，从肠道屏障功能改善作用高的观点出发，更优选含有乙酰乌索酸及/或其盐作为有效成分。

作为乙酰乌索酸，优选在乌索酸的3位的羟基上键合乙酰基的3-乙酰乌索酸。本发明的肠道屏障功能改善用组合物更优选含有3-乙酰乌索酸及/或其盐作为有效成分。

3-乙酰乌索酸为以下式(1)所示化合物。

[化学式1]

本发明的肠道屏障功能改善用组合物中所含的乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐并不因其来源或制造方法而特别限定。例如可使用从植物中萃取的植物来源物，可也为通过合成所得的物质。此外，还可使用市售品。例如，来自植物的乙酰乌索酸、乌索酸、乌索酸糖苷及它们的盐的来源，优选为选自蔷薇科Aronia属、蔷薇科悬钩子属(Rubus)、蔷薇科木瓜属(Chaenomeles)、蔷薇科苹果属(Malus)、蔷薇科梨属(Pyrus)、杜鹃花科熊果属(Arctostaphylos)、杜鹃花科越橘属(Vaccinium)、桃金娘科蒲桃属(Syzygium)、龙胆科獐牙菜属(Swertia)、山茶科厚皮香属(Ternstroemia)、冬青科冬青属(Ilex)、桑科榕属(Ficus)、木犀科木樨榄属(Olea)及杜仲科杜仲属(Eucommia)中的至少1种的植物。

此外在本发明中，3-乙酰乌索酸及其盐的来源优选为选自蔷薇科Aronia属、蔷薇科悬钩子属(Rubus)、蔷薇科木瓜属(Chaenomeles)、山茶科厚皮香属(Ternstroemia)、冬青科冬青属(Ilex)、桑科榕属(Ficus)及杜仲科杜仲属(Eucommia)中的至少1种的植物。

进一步，3-乙酰乌索酸及其盐的来源为蔷薇科Aronia属的植物时，蔷薇科Aronia属的植物优选为选自红苦味果(Aronia arbutifolia)、黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)及Aronia x prunifolia中的至少1种。

另外，黑果腺肋花楸(Aronia melanocarpa)别名还称作野樱桃(Chokeberry)或黑野樱莓(Black Chokeberry)。从植物中萃取时，例如通过含水乙醇对含有本发明的有效成分的化合物的原料进行萃取，对萃取液进行浓缩后，通过实施管柱提纯，可获得本发明的有效成分的化合物。

本发明的有效成分的化合物为上述植物所含成分，即使长期摄取副作用也少、安全性高。根据本发明，可提供含有即使长期摄取副作用也少、安全性高的物质作为有效成分的肠道屏障功能改善用组合物。

在本发明中，所谓肠道屏障功能，是指防止从肠道上皮细胞外(肠道内)至体内的异物(例如内毒素等毒素、致炎物质、未消化物等)的侵入(透过)的功能。肠道包括大肠及小肠。将与正常状态相比从肠道上皮细胞外至体内的异物侵入得到促进的状态，称为肠道上皮细胞中的异物的透过性上升(亢进)的状态。抑制肠道上皮细胞中的异物的透过性上升，以及使肠道上皮细胞中的异物的透过性降低均为肠道屏障功能改善所指的意思。此外，在本发明中，肠道屏障功能改善，以包含抑制肠道屏障功能的降低、提高已降低的肠道屏障功能的意思而使用。例如，通过使将肠道上皮细胞相互粘结的紧密连接正常化或强化，可改善肠道屏障功能。在一种方式中，本发明的肠道屏障功能改善用组合物，可用于通过对使肠道上皮细胞中的紧密连接进行正常化或强化而改善肠道屏障功能。

肠道屏障功能改善效果，例如可通过肠道上皮细胞的电阻值(跨上皮膜电阻值(transepithelial electric resistance:TEER))上升，或抑制TEER的降低来体现。使上述TEER上升或抑制其降低的物质，具有使肠道上皮细胞中的紧密连接正常化或强化的作用。此外，肠道屏障功能改善效果，还可通过从肠道上皮细胞的肠道侧透过至体内侧的物质的量的减少来体现。

本领域技术人员，可根据目的选择肠道屏障功能改善效果的具体评价方法。例如，如后述实施例所示，可使用采用人肠道上皮细胞(Caco-2细胞)的肠道透过模型来测定TEER的方法。具体而言，向Caco-2单层培养细胞中添加促炎细胞因子(TNFα、IL-1β、IFNγ等)，做出可在人类中使肠道屏障功能破坏的状态，若通过被验物质的添加，与未添加该物质的情况相比TEER的降低得到抑制，则可评价为该被验物质具有肠道屏障功能改善效果。

如实施例所示，乙酰乌索酸及乌索酸在采用Caco-2细胞的肠道透过模型中，抑制因促炎细胞因子的添加所导致的TEER的降低，具有优异的肠道屏障功能改善效果。此外，如实施例所示，乙酰乌索酸与不具有乙酰基的乌索酸相比表现出更优异的肠道屏障功能改善效果。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物通过含有选自乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐中的至少1种的化合物作为有效成分发挥肠道屏障功能改善效果。因此，本发明的肠道屏障功能改善用组合物，对于肠道屏障功能的改善对其预防或改善有效的状态或疾病，例如与肠道屏障功能异常相关的状态或疾病的预防或改善有用。肠道屏障功能异常包括肠道屏障功能的降低。作为与肠道屏障功能异常相关的状态或疾病，可列举起因于肠道屏障功能异常的状态或疾病，或伴随着肠道屏障功能异常的状态或疾病。作为此种与肠道屏障功能异常相关的状态或疾病，例如可列举炎性肠疾病、过敏性肠症候群、全身性自身免疫性疾病(类风湿性关节炎、红斑狼疮等)、过敏(食物过敏、花粉症等)、生活习惯病(肥胖、1型或2型糖尿病、高血压、高血脂症、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、动脉硬化等)等(例如Camilleri et al.,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 303:G775-G785,2012；Mu et al.,Front.Immunol.,Vol.8,Article 598,2017；Bischoff et al.,BMCGastroenterology 2014 14:189)。

作为与肠道屏障功能异常相关的状态或疾病的更具体的症状的一例，可列举腹泻、便秘、肚子(腹部)的不快感(膨胀感、咕噜咕噜感、腹痛等)等症状。本发明的肠道屏障功能改善用组合物，具有通过改善肠道屏障功能而改善肠道状态的作用。从而，本发明的肠道屏障功能改善用组合物，可通过肠道屏障功能改善来调节肠的状况，有用于如上所述的肠道症状的预防或改善。在一种方式中，本发明的肠道屏障功能改善用组合物可用于肠道调节(例如用于预防或改善腹泻、便秘、腹部的不快感等)。此外，肠道屏障功能异常也与生活习惯病等相关(例如上述Bischoff et al.,BMC Gastroenterology 2014 14:189)。改善肠道屏障功能，对生活习惯病的预防或改善也有效。作为生活习惯病的症状，可列举糖代谢异常、脂质代谢异常、体脂肪增加、内脏脂肪增加、腹围脂肪增加、较高的血压等。从而，本发明的肠道屏障功能改善用组合物，也可通过改善肠道屏障功能而有助于糖代谢的改善、脂质代谢的改善、体脂肪、内脏脂肪、腹围脂肪等脂肪减少或增加抑制、较高的血压的改善等。

本说明书中提及“状态或疾病的预防”时，是指提高对象对状态或疾病的抵抗性、延迟或防止状态或疾病的发病等。此外，本说明书中提及“状态或疾病的改善”时，是指使对象从状态或疾病中恢复、减轻状态或疾病的症状、延迟或防止状态或疾病的发展。恢复包括至少部分恢复。

本发明的组合物，适用于治疗用途(医疗用途)或非治疗用途(非医疗用途)均可。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物，例如能够以饮食品、医药品、医药部外品、饲料等形态提供，但并不限定于此。就本发明的肠道屏障功能改善用组合物而言，其自身为饮食品、医药品、医药部外品、饲料等也可，也可为在这些产品中所使用的添加剂等制剂、材料。作为一例，本发明的肠道屏障功能改善用组合物，能够以药剂的形态提供，但并不限定于本形态。也可将该药剂直接作为组合物或作为含有该药剂的组合物来提供。在一种方式中，本发明的肠道屏障功能改善用组合物也可称作肠道屏障功能改善剂。

在一种方式中，本发明的肠道屏障功能改善用组合物优选为口服用组合物。根据本发明，可提供具有优异的肠道屏障功能改善作用的口服用组合物。作为口服用组合物，可列举饮食品、医药品、医药部外品，优选为饮食品。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物只要不损害本发明的效果，也可含有1种或2种以上上述本发明的有效成分的化合物以外的成分(其他成分)。

在一种方式中，作为其他成分，例如也可含有乳酸菌、双歧杆菌、食物纤维、多糖类等。乳酸菌及双歧杆菌优选可口服摄取的菌。

上述食物纤维，为非水溶性的食物纤维、水溶性的食物纤维均可。作为非水溶性的食物纤维，可例示纤维素、木质素、半纤维素、小麦麦麸、苹果纤维、甘薯纤维、甲壳素等。水溶性食物纤维，大致区分为高粘性物和低粘性物，作为高粘性物，可列举果胶、蒟蒻甘露聚糖、海藻酸、海藻酸钠、瓜尔胶、琼脂等。在日本国内一般所知的食物纤维中，所谓低粘性物的水溶性食物纤维，是指称含有50重量％以上食物纤维且溶解于常温水而成为低粘性溶液并且在大约5重量％水溶液中显示20mPa·s以下的粘度的溶液的食物纤维材料。作为水溶性食物纤维的低粘性物，可列举难消化性糊精、聚葡萄糖、瓜尔胶分解物、Litesse(聚葡萄糖)等。除此之外，满足低粘性、水溶性条件的食物纤维材料皆可包含在内。食物纤维可使用1种，也可使用2种以上。

作为上述多糖类，可列举半乳寡糖、木寡糖、甘露寡糖、琼脂寡糖、果寡糖、异麦芽寡糖、棉子糖等寡糖。这些可使用1种，也可使用2种以上。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物，除上述以外，还可含有任意的添加剂、任意的成分。这些添加剂及成分，可根据肠道屏障功能改善用组合物的形态进行选择，一般可使用可用于饮食品、医药品、医药部外品、饲料等中的添加剂及成分。例如，作为口服投用剂，可例示在饮食品中或药学上允许的各种添加剂，例如赋形剂、润滑剂、稳定剂、分散剂、粘合剂、稀释剂、香味剂、甜味剂、风味剂、着色剂等。例如，将本发明的肠道屏障功能改善用组合物制成口服用组合物时，在不损害本发明效果的范围内，除上述以外，还可适当含有维生素、维生素样物质、蛋白质、氨基酸、油脂、有机酸、碳水化合物、植物来源原料、动物来源原料、微生物、饮食品用添加剂、医药品用添加剂等可口服摄取的成分。

除上述以外，还可根据其用途而适当调配在饮食品、医药品、医药部外品、饲料等中所使用的材料等成分。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物的形态只要具有本发明的效果则无特别限制。

在一种方式中，在将本发明的肠道屏障功能改善用组合物制成饮食品时，可在本发明的有效成分的化合物中调配可用于饮食品的成分(例如饮食品材料、根据需要所使用的添加剂等)，从而制成各种饮食品(饮食品组合物)。饮食品并无特别限定，例如可列举一般的饮食品、健康食品、功能性标示食品、特定保健用食品、患者用食品、食品添加剂、它们的原料等。饮食品的形态也无特别限定，可制成片剂、包衣片剂、细粒剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊剂(包括软胶囊剂、硬胶囊剂)、干糖浆剂、咀嚼剂等口服用固体制剂；内服液剂、糖浆剂等口服用液体制剂的各种制剂形态。

在一种方式中，在将本发明的肠道屏障功能改善用组合物制成医药品或医药部外品时，可在本发明的有效成分的化合物中调配药学上允许的赋形剂等添加剂，从而制成各种剂型的医药品(医药组合物)或医药部外品(医药部外品组合物)。医药品或医药部外品的投用形态，优选为口服投用。医药品或医药部外品的剂型，只要制成适于投用形态的剂型即可。作为口服用医药品或医药部外品的剂型，例如可列举片剂、包衣片剂、细粒剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊剂(包括软胶囊剂、硬胶囊剂)、干糖浆剂、口嚼剂等口服用固体制剂；内服液剂、糖浆剂等口服用液体制剂。

在片剂、丸剂及颗粒剂的情况下，也可根据需要制成施加了惯用的药皮的剂型，例如糖衣片、明胶包封剂、肠溶包封剂、膜衣剂等，此外片剂也可制成双重片等多层片。

将本发明的肠道屏障功能改善用组合物制成饮食品、医药品、医药部外品、饲料等时，其制造方法并无特别限定，可使用本发明的有效成分的化合物，通过一般方法制造。本发明也包括选自乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐中的至少1种的化合物的用于制造肠道屏障功能改善用组合物的应用。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物中，也可在包装、容器或说明书等中标示用途、有效成分的种类、上述效果、使用方法(例如摄取方法、投用方法)等的1种或2种以上。本发明的肠道屏障功能改善用组合物中，也可附有具有以下作用的主旨标示，即肠道屏障功能改善作用或基于肠道屏障功能改善作用。作为此种标示，例如也可附有具肠道调节作用的主旨的标示。

肠道调节作用只要是基于肠道屏障功能的改善的肠道调节作用即可，并无特别限定。作为上述具有肠道调节作用的主旨的标示之一例，可列举“针对稍微便秘或腹泻者”、“针对在意肚子的状况者”、“针对容易感觉到肚子的不快感者”、“改善通便”、“改善便的状态”、“改善排便次数”、“改善排便量”、“使肚子舒畅”、“调整肚子的状况”、“调整肠的状况”、“改善肚子的不快感”、“缓和气体的产生”、“缓和肚子胀”、“缓和肚子的咕噜咕噜感”等。本发明的肠道屏障功能改善用组合物中，也可附有此种标示中的1种或2种以上。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物中的有效成分的化合物的含量可根据该组合物的形态等进行适当设定。在一种方式中，将肠道屏障功能改善用组合物制成饮食品、医药、医药部外品等口服用组合物时，乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐的总含量在该组合物中优选0.0001重量％以上，更优选0.01重量％以上，此外优选80重量％以下，更优选20重量％以下。在一种方式中，乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐的总含量在肠道屏障功能改善用组合物中优选0.0001～80重量％，更优选0.01～20重量％。

乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐的含量可依照公知的方法来测定，例如可使用HPLC法等。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物，能够以对应其形态的适当方法摄取或投用。本发明的肠道屏障功能改善用组合物优选为口服投用或口服摄取。

本发明的肠道屏障功能改善用组合物的摄取量(也可称为投用量)并无特别限定，只要是可获得肠道屏障功能改善效果的量即可，且只要根据投用形态、投用方法等进行适当设定即可。作为一种方式，在以人(成人)为对象，使其口服投用或摄取时，肠道屏障功能改善用组合物的摄取量，以乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐的总摄取量计，每1日可为0.01～5000mg，优选为0.1～3000mg，更优选为1～1500mg，进一步优选为1～1000mg。优选将上述量例如1日1次或分2～3次口服投用或摄取。在一种方式中，在以将人(成人)作为对象获得肠道屏障功能改善效果为目的而摄取肠道屏障功能改善用组合物时，优选以乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐的总摄取量达到上述范围的方式，通过口服使对象摄取或向对象投用肠道屏障功能改善用组合物。上述摄取量可为每60kg体重，每1日的摄取量。在一种方式中，本发明的肠道屏障功能改善用组合物也可为使成人摄取或对其投用每60kg体重，每1日的上述量的本发明的有效成分的化合物的口服用组合物。

在一种方式中，对于本发明的肠道屏障功能改善用组合物，考虑其投用形态、投用方法等，优选含有可获得本发明的期望效果的量，即有效量的本发明的有效成分的化合物。作为一种方式，例如，在肠道屏障功能改善用组合物为饮食品、口服用医药品等口服用组合物时，在该组合物的成人1人每1日的摄取量中，作为乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐的总含量，每1日可为0.01～5000mg，优选为0.1～3000mg，更优选为1～1500mg，进一步优选为1～1000mg。

本发明的有效成分的化合物通过连续摄取(投用)，期待肠道屏障功能改善效果有所提高。在优选方式中，本发明的肠道屏障功能改善用组合物为连续摄取的组合物。在本发明的一种实施方式中，肠道屏障功能改善用组合物优选连续摄取1周以上。

投用或摄取本发明的肠道屏障功能改善用组合物的对象(以下也简称为投用对象)，优选为人、人以外的动物，更优选为人、非人哺乳动物，进一步优选为人。此外，作为本发明中的投用对象，优选为需要或希望肠道屏障功能改善的对象。作为适当的对象，例如可列举肠道屏障功能降低的对象、希望预防或改善上述与肠道屏障功能异常相关的状态或疾病的对象、需要预防或改善该状态或疾病的对象等。

本发明还包含以下肠道屏障功能改善方法等。

一种肠道屏障功能改善方法，其特征在于，向对象投用选自乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐中的至少1种的化合物。

一种选自乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐中的至少1种的化合物的应用，其特征在于，用于改善肠道屏障功能。

上述方法及应用可为治疗性的方法及应用，也可为非治疗性的方法及应用。所谓“非治疗性”，为不包含医疗行为即手术、治疗或诊断的概念。本发明的有效成分的化合物可用于改善对象的肠道屏障功能而向对象投用(或使其摄取)。在一种方式中，上述本发明的有效成分的化合物优选用于通过使肠道上皮细胞的紧密连接正常化或强化而改善肠道屏障功能。

选自乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐中的至少1种的化合物的投用量只要为可获得肠道屏障功能改善效果的量，即有效量即可，并无特别限定，例如优选投用上述量。投用路径优选为口服投用。上述化合物可直接投用，也可投用含有其的组合物。例如，可投用上述本发明的肠道屏障功能改善用组合物。本发明的有效成分的化合物、对象(投用对象)、投用方法、投用量及它们的优选方式等，与上述肠道屏障功能改善用组合物中相同。在一种方式中，例如，以人(成人)为对象口服投用时，乌苏烷型三萜、其衍生物及它们的盐的总投用量，每1日可为0.01～5000mg，优选为0.1～3000mg，更优选为1～1500mg，进一步优选为1～1000mg。在上述方法及应用中，优选连续投用本发明的有效成分的化合物1周以上。

实施例

以下示出更具体地说明本发明的实施例。另外，本发明并不仅限定于这些实施例。

＜实施例1＞

实施肠道屏障功能改善的对比评价。

(肠道屏障功能改善作用的评价方法)

使用DMEM(达尔伯克改良伊格尔培养基)，用转移板(Transwell)(Millicell公司制)于37℃培养Caco-2细胞3周。从培养有Caco-2细胞的培养板中除去培养基，用不含血清的DMEM将微孔各清洗3次，并用该培养基填满微孔。然后，通过Millicell-ERS(Millipore公司制)测定Caco-2单层细胞的跨上皮电阻(TEER)，选出判断为形成充分的紧密连接的细胞(TEER≧1000Ω·cm²)，用于随后的筛选。接下来，在粘膜侧、基底膜侧两者的试验液(培养基)中添加后述样本和TNFα(40ng/mL)、IL-1β(20ng/mL)以及IFNγ(10ng/mL)，培养48小时。另外，样本是溶解于二甲亚砜(DMSO)后再添加于试验液中。此时，将未添加促炎细胞因子(TNFα、IL-1β及IFNγ)及样本的微孔设置为正常。此外，将添加了促炎细胞因子但未添加样本的微孔设置为对照。培养后再次测定TEER，评价样本是否抑制促炎细胞因子所致的TEER的降低(减少)。

由添加样本的微孔、正常及对照的TEER值通过下式求得样本所致的TEER降低抑制率(％)。

(TEER降低抑制率的计算式)

TEER降低抑制率(％)＝100×((添加样本的微孔的TEER)-(对照的TEER))/((正常的TEER)-(对照的TEER))

在该评价系统中，TEER降低抑制率(％)越高肠道屏障功能改善作用越强。

作为样本，使用3-乙酰乌索酸(Ark Pharm公司制)、3-乙酰齐墩果酸(Ark Pharm公司制)、乌索酸(United States Pharmacopeial Convention公司制)、齐墩果酸(ChromaDex公司制)的市售的标准品。以试验液中的样本浓度达到5μg/mL的方式添加各样本。此外，作为阳性对照对槲皮素进行评价。槲皮素使用市售的标准品(Funakoshi株式会社制)。以达到9μg/mL的方式向试验液中添加槲皮素。

结果示于表1。3-乙酰乌索酸及乌索酸具有肠道屏障功能改善作用。明确了3-乙酰乌索酸与不具有乙酰基的乌索酸相比，具有更高肠道屏障功能改善作用。3-乙酰乌索酸以比已知作为肠道屏障保护剂的槲皮素更低的浓度，具有与槲皮素相同程度的肠道屏障功能改善作用。

[表1]

工业实用性

本发明的肠道屏障功能改善用组合物在饮食品领域、医药领域等有用。