一种工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统及其应用
阅读说明：本技术 一种工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统及其应用 (Engineered neutrophil sonosensitizer drug delivery system and application thereof ) 是由 闫志强 孙磊 周靖娥 罗腾硕 王镜 骆声根 王哲豪 王烨颖 丁楠津 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种工程化改造的中性粒细胞声敏剂递送系统。所述的递送系统由中性粒细胞,以及通过主动靶向方式载入中性粒细胞内的含氧全氟化合物和声敏剂形成的纳米粒组成。本发明还公开了所述工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统在制备诊断和/或治疗肿瘤的药物和/或试剂中的应用。本发明通过纳米工程化改造中性粒细胞赋予其靶向肿瘤炎症部位和靶向肿瘤细胞的多级靶向能力,缓解肿瘤乏氧,声动力治疗以及超声成像的功能。本发明可以显著提高药物的生物相容性,在超声条件下有效提高其治疗效果,消灭肿瘤组织,延长荷瘤小鼠的生存时间,且在无超声的条件下,该递药系统几乎不产生毒副作用,具有较好的生物安全性。(The invention discloses an engineered neutrophil sonosensitizer delivery system. The delivery system consists of neutrophils, oxygen-containing perfluorinated compounds loaded into the neutrophils in an active targeting mode and nanoparticles formed by a sound-sensitive agent. The invention also discloses application of the engineered neutrophil sound-sensitive agent drug delivery system in preparation of drugs and/or reagents for diagnosing and/or treating tumors. The invention endows the neutrophil with multi-level targeting ability for targeting tumor inflammation parts and tumor cells by nano-engineering modification, and relieves tumor hypoxia, and has the functions of sound power treatment and ultrasonic imaging. The invention can obviously improve the biocompatibility of the medicine, effectively improve the treatment effect of the medicine under the ultrasonic condition, eliminate tumor tissues and prolong the survival time of tumor-bearing mice, and the medicine delivery system hardly generates toxic or side effect under the ultrasonic-free condition and has better biological safety.)
技术领域
本发明属于药剂学技术领域，涉及一种工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统及其应用。
背景技术
声动力疗法是利用低强度超声波激活聚集于肿瘤细胞及肿瘤新生血管内皮细胞的声敏剂，产生单线态氧等强氧化性物质造成肿瘤细胞和肿瘤新生血管内皮细胞死亡，从而达到准确、彻底杀灭肿瘤的目的，而不损伤正常细胞。声动力疗法作为一种非侵入性而精准的新型治疗方法，在肿瘤治疗中受到了广泛关注并得到了快速发展。然而，声动力疗法中的声敏剂存在着生物利用度低，化学/生物稳定性差，靶向效率差以及缺乏有效的新型声敏剂等缺点，此外在肿瘤的乏氧环境中显著限制了声动力的治疗效果和进一步发展。因此，亟需研究者们开发一种新型的声敏剂用于肿瘤的诊断和治疗。
随着细胞药物的出现，细胞作为药物载体在肿瘤治疗中取得了较大的进步。其中，对细胞进行工程化改造是生物科学技术的一个新的重要领域。人体循环系统中的各种细胞具有不同的生理功能，包括长时间的血液循环、内源性物质和代谢物的转运、以及对炎症部位的趋化性等功能。这些功能将成为工程化改造细胞的优良条件。以细胞为对象，应用生命科学理论，运用工程技术和原理，有目的地利用或修改细胞的遗传特征，以获得一种或多种专门的功能，实现细胞药物在体内的长期循环，主动靶向，进入病变组织的深层和杀死肿瘤细胞的能力。因此，在不影响细胞基本功能的前提下，通过工程化改造细胞，添加其他特殊功能在肿瘤的细胞治疗中显得尤为重要。
通过细胞的进化机制，我们可以了解真核细胞是如何实现不同功能的。真核生物是一种含有多达10000个内共生体的宿主细胞，其中的内共生体来自于原核生物并在宿主细胞中形成了具有特殊功能的细胞器。真核细胞中的细胞器，如线粒体和叶绿体，本质上是独立的原核细胞。这些原核细胞被宿主细胞吸收后，获得了宿主细胞的基因和核糖体，并复制自己从而进化成细胞器。例如，宿主细胞向线粒体提供食物和氧气，作为回报，线粒体向宿主细胞提供腺嘌呤核苷三磷酸(Adenosine triphosphate，ATP)，宿主细胞利用ATP维持生命。叶绿体为宿主细胞完成光合作用，而宿主细胞为其提供营养条件。因此，线粒体和叶绿体与宿主细胞之间建立了复杂而协调的相互作用，是一种互利共生的关系。细胞中不同的细胞器具有不同的功能，它们各自履行各自的职责，协同完成细胞的生理功能。因此，我们可以利用纳米技术添加“人工细胞器”来改造细胞的功能，使它们可以共存而不影响细胞固有的生物学功能，同时添加其他特定功能来构建针对不同疾病的细胞药物。
目前对细胞药物的研究较多，如红细胞、免疫细胞(中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞)和干细胞。在炎症、组织修复和肿瘤发生过程中，特定的趋化因子不断表达，不同的细胞特异性地趋化到损伤部位。所有细胞中，中性粒细胞是在炎症趋化因子的介导下最先到达炎症部位的免疫细胞，具有血液含量高、招募速度快的优点。中性粒细胞的工程化改造有望成为一种新的癌症治疗方法。由于肿瘤组织缺氧，化疗药物和细胞药物的治疗效果严重受限。但是，通过纳米工程化改造可以为中性粒细胞提供一种新的携氧细胞器，并赋予了中性粒细胞输送氧气的功能，而且保留其固有的功能，如炎症靶向、肿瘤招募和形成胞外诱捕网等，有望提高对肿瘤的治疗效果。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统。该递送系统具有多级靶向功能，在超声条件下可以缓解肿瘤乏氧，产生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)，诱导细胞凋亡，显著延长荷瘤小鼠的生存时间。该递送系统将为癌症的治疗提供新的方法。
“工程化改造的”具体指通过开发具有不同功能的纳米粒药物，然后与细胞共培养，使细胞成功携带纳米药物，不仅不影响细胞的功能和活性，而且赋予细胞新的功能。
本发明提供了一种工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统，所述的递送系统包括靶向肿瘤炎症的中性粒细胞，通过主动靶向方式载入中性粒细胞内的载氧全氟化合物(Perfluorinated compounds，PFC)和声敏剂形成的纳米粒。
其中，所述的主动靶向方式是指将靶向肽修饰于纳米粒表面，使得纳米粒具有主动靶向中性粒细胞和靶向肿瘤细胞的功能。
所述的靶向肽为RGD，iRGD，c(RGDfC)，c(RGDfK)，NGR，iNGR，STR-R4，Angiopep-2，A54，AN-152，BP9或pPB等中的一种或多种，优选地，为cRGD。
其中，所述的纳米粒为多层脂质体纳米粒，层数为2-10层，优选地，为2层；粒径为1-500nm，优选地，为170nm。
其中，所述的含氧全氟化合物为载有氧气的全氟化合物，包括全氟烷烃、全氟化硫中的一种或多种；优选地，所述全氟烷烃包括四氟甲烷、六氟乙烷、八氟丙烷、十氟丁烷、十二氟戊烷、十四氟己烷、十六氟庚烷、十八氟辛烷、二十氟壬烷、二十二氟癸烷、全氟二十四烷等中的一种或多种；所述全氟化硫为六氟化硫。
其中，所述的声敏剂为卟啉类、卟啉衍生物类、氧杂蒽类、化疗药物类、抗生素类、染料类、色素类或无机纳米材料类等中的一种或多种；优选地，所述的声敏剂为光卟啉、血卟啉、血卟啉单甲醚、原卟啉IX、5-氨基酮戊酸、华卟啉钠、他拉泊芬、荧光素、曙红、罗丹明、多柔比星、顺铂、环丙沙星、酞菁染料、亚甲基蓝、吖啶橙、吲哚箐绿、竹红菌素B、替莫泊芬、海姆泊芬、他拉泊芬、维替泊芬、罗他泊芬、帕度泊芬、帕利泊芬、二氧化钛纳米材料、晶体硅纳米材料或多氢富勒烯等中的一种或多种。
本发明还提供了上述的工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统在制备诊断和/或治疗肿瘤的药物和/或试剂中的应用。
其中，所述的肿瘤为黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、舌癌、胰腺癌、甲状腺癌、宫颈癌、子宫癌、脑癌、食管癌、肠癌、前列腺癌、淋巴癌、膀胱癌等中的一种或多种。
本发明还提供了一种用于诊断肿瘤的药物和/或试剂，所述的诊断肿瘤的药物和/或试剂选自超声造影剂、光声成像造影剂、探针等中的一种或多种。
所述超声造影剂包括但不限于四氟甲烷、六氟乙烷、八氟丙烷、十氟丁烷、十二氟戊烷、十四氟己烷、十六氟庚烷、十八氟辛烷、二十氟壬烷、二十二氟癸烷、全氟二十四烷、六氟化硫等。
所述光声成像造影剂包括但不限于黑磷、碳纳米管、金纳米粒、萘菁、酞菁、普鲁士蓝、黑色素等。
所述探针包括但不限于Gd-DTPA、超顺磁氧化铁、卟啉金属配合物、锰(II)螯合物等。
本发明还提供了一种用于治疗肿瘤的药物和/或试剂，所述治疗肿瘤的药物和/或试剂选自声敏剂中的卟啉类、卟啉衍生物类、氧杂蒽类、化疗药物类、抗生素类、染料类、色素类或无机纳米材料类等中的一种或多种。
优选地，所述声敏剂为光卟啉、血卟啉、血卟啉单甲醚、原卟啉IX、5-氨基酮戊酸、华卟啉钠、他拉泊芬、荧光素、曙红、罗丹明、多柔比星、顺铂、环丙沙星、酞菁染料、亚甲基蓝、吖啶橙、吲哚箐绿、竹红菌素B、替莫泊芬、海姆泊芬、他拉泊芬、维替泊芬、罗他泊芬、帕度泊芬、帕利泊芬、二氧化钛纳米材料、晶体硅纳米材料或多氢富勒烯等中的一种或多种。
本发明还提供了所述的用于诊断肿瘤的药物和/或试剂、或所述的用于治疗肿瘤的药物和/或试剂在诊断肿瘤和/或治疗肿瘤中的应用。
本发明还提供了一种工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：将全氟化合物与人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)进行混合，通过细胞超声破碎充氧获得纳米乳；
本发明步骤(1)中充氧的目的为：由于全氟化合物具有载氧的功能，充氧可以为声敏剂发挥声动力作用提供氧气。
步骤(2)：在所述纳米乳表面包裹一层含有声敏剂的单层阳离子脂质体，然后通过静电吸附和层层挤出法在其表面包裹靶向肽修饰的多层阴离子脂质体，从而得到靶向肽修饰的包载有载氧全氟化合物和声敏剂的多层脂质体纳米粒。
步骤(3)：将多层脂质体纳米粒与中性粒细胞孵育，通过主动靶向进入中性粒细胞内，最终成功制备了工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统。
步骤(1)中，所述全氟化合物与人血清蛋白的人血清蛋白与全氟化合物的质量/体积(m/v)比为(1-10)/(1-30)；优选地，为1/15。
步骤(1)中，所述细胞超声破碎的功率为50-200W，优选地为120W；破碎时间为0.5-5min，优选地为3mim。
步骤(2)中，所述阳离子包括DOTMA、DOTAP、DOSPA、DTAB、DOPE、TTAB、CTAB、DDAB、DORI、DORIE、DOGS、DOSC中的一种或多种，优选地，为DOTAP、DOPE；
步骤(2)中，所述阴离子包括PC、PL、SPC、HSPC、DSPE-PEG2000、EPG、DOPG、DPPG、DPPC中的一种或多种，优选地，为HSPC、DSPE-PEG2000；
步骤(2)中，所述阴离子脂质体的层数为1-10层，优选地，为2层。
本发明中的多层脂质体纳米粒，可以有效防止含氧PFC及光敏剂泄露，显著提高纳米制剂的稳定性。在趋化肽N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-白氨酰-L苯丙氨酸(N-Formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine，fMLP)的作用下可以激活中性粒细胞声敏剂药物递送系统，使得中性粒细胞表面高表达CD11b，并具有较强的趋炎性和迁移能力。而在炎症因子佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)的作用下可以触发中性粒细胞分解，从而释放多层脂质体纳米，并靶向肿瘤细胞。该递药系统经静脉注射后，在血液炎症因子介导下靶向肿瘤组织。然后，经声动力治疗后肿瘤部位的炎症信号被放大，从而招募更多的递药系统富集于肿瘤组织。在肿瘤部位炎症因子的作用下激活中性粒细胞发生分解，释放靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒，并靶向肿瘤细胞，表明该递药系统具有多级靶向功能。在超声的作用下，该递药系统可以改善肿瘤乏氧环境，产生大量的ROS，造成肿瘤细胞凋亡，有效地消灭肿瘤组织，延长荷瘤小鼠的生存时间。此外，该递药系统具有超声成像功能，可以用于肿瘤的诊断和监测。重要的是，在无超声的条件下，该递药系统几乎不产生毒副作用，具有较好的生物安全性。
本发明提供的一种工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统的制备方法具体包括：
(1)2.0mg HSA溶于2mL去离子水中，将30μL PFC加入HSA溶液中，然后在冰水浴中，通过细胞超声破碎仪超声处理100W，3min；将纳米级的HSA/PFC进行充氧，得到HSA/PFC/O2。
(2)将20mg HSPC、6mg胆固醇、0.5mg DOPE、0.5mg DOTAP、1mg DSPE-PEG2000、1mg他拉泊芬溶于3mL氯仿和1mL甲醇的混合有机溶剂中，在40℃水浴中旋转蒸发30min形成均匀的薄膜。在60℃水浴中，向薄膜中加入1mL去离子水水化30min。然后在冰水浴中，通过细胞超声破碎仪超声处理100W，3min，得到SLipT。
(3)将HSA/PFC/O2与SLipT按体积比1:1混合孵育2h，使用Avanti微型挤出器，分别通过孔径为400、200和100nm的聚碳酸酯膜，将上述混合液连续挤压13次，得到SLipOPT溶液。
(4)将20mg HSPC、6mg胆固醇、1mg DSPE-PEG2000-cRGD溶于3mL氯仿和1mL甲醇的混合有机溶剂中，在40℃水浴中旋转蒸发30min形成均匀的薄膜。在60℃水浴中，向薄膜中加入1mL去离子水水化30min。然后在冰水浴中，通过细胞超声破碎仪超声处理100W，3min，得到R-Lip脂质体；在室温下R-Lip与上述SLipOPT混合孵育2h。使用Avanti微型挤出器，分别通过孔径为400、200和100nm的聚碳酸酯膜，将上述混合液连续挤压13次，得到R-MLipOPT溶液。通过G50葡聚糖凝胶柱纯化得到多层脂质体纳米溶液。
(5)中性粒细胞的提取。首先，将小鼠腿骨去除肌肉和肌腱后浸泡在1×PBS溶液中，并用无血清的RPMI 1640培养基冲洗骨髓，1200rpm离心3min，在无血清的RPMI 1640培养基中重悬。加入红细胞裂解液，4℃孵育3min，然后1200rpm离心3min，用1mL无血清的RPMI1640培养基重悬细胞。将单细胞悬浮液加入55％、65％和75％(v:v)Percoll和1×PBS的混合溶液中。成熟的中性粒细胞集中在65％和75％的分界处，取出中性粒细胞，1200rpm离心3min，并用预冷的PBS洗涤三次。
(6)将1×106个/mL中性粒细胞加入到无菌管中，R-MLipOPT脂质体用无血清的RPMI 1640培养基稀释成Talaporfin 100μg/mL，加入上述无菌管中，并在37℃细胞培养箱中孵育60min。1200rpm离心3min，并用预冷的PBS溶液洗涤三次后，获得[email protected]细胞药物用于后续研究。
本发明的有益效果包括：本发明利用avanti微型挤出器先后通过400、200、100nm的聚碳酸酯膜反复挤压，然后用G50葡聚糖凝胶柱进行纯化，从而获得均一的可以同时靶向中性粒细胞和肿瘤细胞的新型多层脂质体纳米粒，形态为多层的纳米球形结构，具有良好的血清稳定性，缓慢的药物释放行为，可以最大程度减少纳米制剂中载氧全氟化合物和光敏剂的泄露。本发明制备的工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统，内源性的中性粒细胞可以提高药物的生物相容性，防止被体内免疫系统清除。该递药系统在血液炎症因子的介导下可以靶向肿瘤组织，在肿瘤炎症因子的介导下发生裂解，释放多层脂质体纳米粒。并在靶向肽的介导下靶向肿瘤细胞增加肿瘤细胞中药物的含量，从而实现了递药系统的多级靶向功能。该递药系统在保留中性粒细胞自身功能的情况下，通过工程化改造赋予其携带氧气和声动力杀伤功能。该递药系统在超声治疗后会不断增强肿瘤部位的炎症信号，从而进一步增加声敏剂药物在肿瘤细胞中的富集。该递药系统不仅具有肿瘤治疗功能还具有肿瘤诊断的功能。在没有超声处理下，该药物系统不产生任何毒副作用，具有较好的生物安全性。
与现有技术相比，本发明具有的优点如下：
1.本发明成功制备的工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统，成功解决了声敏剂生物相容性差，体内靶向性差的问题。
2.本发明所制备的工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统，通过开发不同功能的纳米粒，赋予中性粒细胞新的功能，并且不影响其自身功能。
3.本发明所制备的工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统使用的中性粒细胞，是人体数量最多的免疫细胞，可以靶向并渗透到肿瘤深部，用于肿瘤的精准成像和声动力治疗，这使得本发明具有高时空分辨率。
附图说明
图1为本发明靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的形态表征。
图2为本发明靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的粒径及电位表征。
图3为本发明靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的药物释放表征。
图4为本发明靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的氧气释放表征。
图5为本发明靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的血清稳定性表征。
图6为本发明工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统的形态表征。
图7为本发明工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统的趋炎性表征。
图8为本发明炎症因子诱导的药物释放表征。
图9为本发明药物递送系统的体外超声成像表征。
图10为本发明肿瘤细胞对药物递送系统摄取的表征。
图11为本发明药物递送系统改善肿瘤乏氧的表征。
图12为本发明药物递送系统在声动力作用下提高肿瘤细胞ROS水平的表征。
图13为本发明药物递送系统在声动力作用下的细胞活性表征。
图14为本发明药物递送系统在荷瘤小鼠的体内分布表征。
图15为本发明药物递送系统的体内超声成像表征。
图16为本发明药物递送系统的药代动力学表征。
图17为本发明药物递送系统体内抗肿瘤效应的表征。
图18为本发明药物递送系统对荷瘤小鼠的组织学表征。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的制备
首先，制备由HSA包裹PFC形成的纳米乳。2.0mg HSA溶于2mL去离子水中，将30μLPFC加入HSA溶液中，然后在冰水浴中，通过细胞超声破碎仪超声处理100W，3min；将纳米级的HSA/PFC进行充氧，得到HSA/PFC/O2。
其次，采用薄膜水化法结合连续挤压法制备SLipOPT。将20mg HSPC、6mg胆固醇、0.5mg DOPE、0.5mg DOTAP、1mg DSPE-PEG2000、1mg他拉泊芬溶于3mL氯仿和1mL甲醇的混合有机溶剂中，在40℃水浴中旋转蒸发30min形成均匀的薄膜。在60℃水浴中，向薄膜中加入1mL去离子水水化30min。然后在冰水浴中，通过细胞超声破碎仪超声处理100W，3min，得到SLipT；将HSA/PFC/O2与SLipT按体积比1:1混合孵育2h，使用Avanti微型挤出器，分别通过孔径为400、200和100nm的聚碳酸酯膜，将上述混合液连续挤压13次，得到SLipOPT溶液。最后，制备R-MLipOPT的多层脂质体。将20mg HSPC、6mg胆固醇、1mg DSPE-PEG2000-cRGD溶于3mL氯仿和1mL甲醇的混合有机溶剂中，在40℃水浴中旋转蒸发30min形成均匀的薄膜。在60℃水浴中，向薄膜中加入1mL去离子水水化30min。然后在冰水浴中，通过细胞超声破碎仪超声处理100W，3min，得到R-Lip脂质体；在室温下R-Lip与上述SLipOPT混合孵育2h。使用Avanti微型挤出器，分别通过孔径为400、200和100nm的聚碳酸酯膜，将上述混合液连续挤压13次，得到R-MLipOPT溶液。通过G50葡聚糖凝胶柱纯化得到多层脂质体纳米溶液。
实施例2靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的形态表征
R-MLipOPT的透射电镜(Transmission Electron Microscope，TEM)形态表征：将得到的SLipOPT和R-MLipOPT分别稀释至合适的浓度，滴加至200目普通碳膜的铜网上，静置3min，并用滤纸毛边缘小心将铜网上多余的液体吸干，滴加一滴2％的磷钨酸于铜网上，静置1min，并用滤纸毛边缘将铜网上多余的液体吸干并放置红外烘烤灯下烘干，采用TEM观察形态。
如图1所示，通过TEM表征本发明实施例1制备的SLipOPT具有均匀的球形形貌，并能清晰地看到脂质体单层膜结构。而R-MLipOPT具有均匀的球形形貌和多层膜结构，表明本发明实施例1成功制备了靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒。
实施例3靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的粒径、电位、载药量(DL)和包封率(EE)表征
将HSA、SLipOPT和R-MLipOPT用去离子水稀释至0.5mg/mL，注入样品池，然后采用动态光散射粒径电位测定仪测定其粒径大小及电位。
将纯化得到的R-MLipOPT加入2mL氯仿和1mL甲醇的混合溶液中以完全释放他拉泊芬，并使用酶标仪测量其含量。将纯化得到的R-MLipOPT通过GC-MS检测PFC的含量。
载药量及包封率计算公式如下:
DL(％)＝Md/Ms×100％ (1)
EE(％)＝Md/Mo×100％ (2)
Md代表脂质体中实际包载药物的质量(mg)，Ms代表实际包载药物和脂质体总体质量(mg)，Mo代表用于制备脂质体时初始药物的质量(mg)。
如图2所示，HSA的粒径分布及电位分别为8.56±1.05nm，PDI＝0.06±0.03，-18.45±1.37mV。SLipOPT的粒径分布及电位分别为160.37±2.08nm，PDI＝0.15±0.06，20.83±1.67mV。R-MLipOPT粒径分布及电位分别为176.84±1.52nm，PDI＝0.10±0.04，-28.77±1.23mV。通过粒径增加以及电位变化表明，本发明实施例1成功制备了由cRGD、Talaporfin、HSA和含氧PFC组成的多层脂质体纳米粒R-MLipOPT。如表1所示，R-SLipT、R-MLipT、R-SLipOPT和R-MLipOPT的粒径逐渐增加，表明随着层数的增加，纳米粒的粒径逐渐增加。另外单层脂质体纳米粒为正电荷，而多层的纳米粒为负电荷，表明负电的脂质体成功包载于纳米粒最外层，从而减少纳米粒的电荷毒性。包载全氟化碳后的纳米粒粒径进一步增加，表明全氟化碳被成功包载于纳米粒中。本发明实施例3进一步考察了R-MLipOPT中他拉泊芬Talaporfin和PFC的载药量(DL％)及包封率(EE％)，R-MLipOPT中他拉泊芬Talaporfin的EE％和DL％分别为99.22％和2.06％，其中的PFC的EE％和DL％分别为78.04％和33.41％。表明本发明的多层脂质体有效的包载了声敏剂他拉泊芬Talaporfin和PFC。
表1不同纳米粒的理化性质表征
实施例4靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的药物释放表征
采用透析法在PBS中研究R-SLipOPT和R-MLipOPT的体外释放行为。首先，1mL的R-SLipOPT和R-MLipOPT分别进行非超声或超声处理(0.35W/cm2,1MHz,3min)，然后置入透析袋(10kDa的MWCO)，两端夹紧，然后将透析袋立即浸入50mL PBS溶液中，37℃，250rpm磁力搅拌。在0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、20.0和24.0h分别取出1mL新鲜释放的介质并补充1mL的PBS溶液。用酶标仪测定透析液中他拉泊芬的吸光度，并计算其浓度。
如图3所示，在无超声(US-)的条件下，24h后R-MLipOPT中的他拉泊芬释放含量仅为8％明显低于R-SLipOPT，并表现出缓慢的释放行为，表明多层声动力纳米药物R-MLipOPT可以有效地防止声敏剂药物泄露，并具有较高的稳定性。而在超声(US+)处理下，R-MLipOPT能够快速并大量的释放声敏剂药物，表明R-MLipOPT具有超声响应性。
实施例5靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的氧气释放表征
R-MLipOPT加入到乏氧的PBS(1％O2)溶液中，溶液浓度为10mg/mL，在37℃超声(0.35W/cm2,1MHz)处理或不处理后，使用雷磁JPBJ-608型便携式溶解氧测定仪检测5min，表征多层脂质体纳米粒氧气的释放情况。
如图4所示，R-MLipOPT具有较高的载氧能力，在超声处理下能够持续的释放氧气，表明其具有较好的携氧能力。
实施例6靶向肽修饰的多层脂质体纳米粒的血清稳定性表征
将0.5mL 2.0mg/mL的R-MLipOPT水溶液和0.5mL的FBS溶液混合加入1.5mL EP管中，于37℃恒温摇床中50rpm震摇，分别在第0、2、4、6、8、12、24h取出制剂，通过动态光散射粒径电位测定仪测定其粒径大小和电位，并分析是否发生显著性变化。
如图5所示，R-MLipOPT在50％胎牛血清中37℃培养24h，其粒径大小没有发生变化，表明R-MLipOPT具有良好的生物稳定性，适用于体外和体内应用。然而，R-SLipOPT的粒径随时间增加，表明多层脂质体比单层脂质体具有更好的稳定性。
实施例7工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统的制备
中性粒细胞的提取。首先，将小鼠腿骨去除肌肉和肌腱后浸泡在1×PBS溶液中，并用无血清的RPMI 1640培养基冲洗骨髓，1200rpm离心3min，在无血清的RPMI 1640培养基中重悬。加入红细胞裂解液，4℃孵育3min，然后1200rpm离心3min，用1mL无血清的RPMI 1640培养基重悬细胞。将单细胞悬浮液加入55％、65％和75％(v:v)Percoll和1×PBS的混合溶液中。成熟的中性粒细胞集中在65％和75％的分界处，取出中性粒细胞，1200rpm离心3min，并用预冷的PBS洗涤三次。
[email protected]的制备，将1×106个/mL中性粒细胞加入到无菌管中，R-MLipOPT脂质体用无血清的RPMI 1640培养基稀释成Talaporfin 100μg/mL，加入上述无菌管中，并在37℃细胞培养箱中孵育60min。1200rpm离心3min，并用预冷的PBS溶液洗涤三次后，获得[email protected]细胞药物用于后续研究。
实施例8工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统的形态表征
[email protected]中细胞器及C6标记的R-MLipOPT形态表征。首先，将1×105个/mL的[email protected]加入共聚焦皿中，分别与100nM线粒体染料MitoRed、5μM高尔基体染料GolgiRed、300nM内质网染料ER-Red、250nM溶酶体染料Lyso-Tracker Red和1μM细胞核染料Heochst33342，在37℃孵育30min，1000rpm离心3min，并用PBS溶液洗涤三次，通过激光共聚焦成像仪(Confocal laser scanning microscope，CLSM)进行成像。
如图6所示，C6标记的R-MLipOPT和红色荧光标记的线粒体、内质网、溶酶体及高尔基体均匀分布在中性粒细胞的细胞质中，相互独立并较少发生重叠。表明本发明实施例7中成功制备了[email protected]，并工程化改造了中性粒细胞。
实施例9工程化改造的中性粒细胞声敏剂药物递送系统的趋炎性表征
考察中性粒细胞和[email protected]表面特异性蛋白CD11b的表达情况。将空白的NEs或[email protected]与不同浓度的趋化肽fMLP在37℃孵育30min。用预冷的PBS洗涤三次后，用20ng/mLPE结合的CD11b抗体孵育30min。然后用预冷的PBS洗涤三次。采用流式细胞术测定荧光强度。使用Transwell细胞迁移实验考察[email protected]的趋炎性。采用3μm孔径和0.33cm2聚碳酸酯膜的Transwell，将2×105个中性粒细胞或[email protected]添加到Transwell的上腔室中，在Transwell的下腔室中加入无血清的RPMI 1640培养基，其中含有不同浓度的fMLP。孵育1h后，收集下腔室中的细胞，并用血细胞计数器计数。并计算趋化指数，计算公式如下：趋化指数＝(NfMLP-Ncontrol)/Ncontrol。
NfMLP：在fMLP存在的情况下，下室中中性粒细胞或[email protected]的数量。Ncontrol：在无fMLP的情况下，下室中中性粒细胞或[email protected]的数量。
如图7所示，中性粒细胞和[email protected]在transwell下室的明场图像中表现出了相同的趋势。这些数据表明，[email protected]维持了中性粒细胞的生理功能和形态，能够积极响应炎症刺激并向炎症部位定向迁移。
实施例10炎症因子诱导药物释放的表征
在正常生理环境、炎症或细胞凋亡等条件下，考察[email protected]中他拉泊芬的体外释放特性。fMLP和PMA分别用于模拟血液循环和肿瘤炎症部位的趋化性细胞因子。将[email protected]以1×106个每孔接种到24孔板中，然后与包含10nM fMLP或100nM PMA的RPMI1640完全培养基孵育不同的时间，分别为0、2、4、6和8h。使用HPLC测定中性粒细胞中和上清液中释放的他拉泊芬的含量。
如图8(a)所示，在无PMA和fMLP的生理条件下，[email protected]中的他拉泊芬在8h内释放非常少。如图8(b)所示，[email protected]经10nM fMLP处理后他拉泊芬在8h内释放非常少，可以忽略不计。然而，如图8(c)所示，经100nM PMA孵育4h后，[email protected]中的他拉泊芬几乎完全释放。表明[email protected]在肿瘤炎症因子作用下可以有效的释放声敏剂纳米药物。
实施例11药物递送系统的体外超声成像表征
[email protected]体外超声成像评价采用琼脂体模，由3％琼脂、86％脱气蒸馏水和11％甘油组成。在凝胶假体中嵌入硅胶管，模拟血管结构并加入待测样品。使用Versonics128STD系统和L11-5V换能器对测试样品进行成像。频率设置为8MHz，采集对比度增益为30dB。在整个成像采集过程中，所有参数保持不变。在取样前，注入脱气蒸馏水并扫描以确定清晰的背景信号。然后将[email protected](5×106个细胞)注射到硅胶管中，检测不同时间管道中的超声灰度值变化。
如图9所示，[email protected]具有时间依赖性超声信号，在2.0min达到最高水平，表明该递药系统具有超声成像的能力，以及体内超声诊断的应用潜力。
实施例12肿瘤细胞对药物递送系统摄取的表征
将Cal-27口腔癌细胞和L02正常肝细胞分别以每孔1×104个细胞种于12孔板中，于37℃、5％CO2恒温培养箱，当细胞密度达到70～80％时，然后与100nM PMA和C6标记的[email protected]共同孵育。在第4、8、12和24h收集细胞。然后用含有0.25％EDTA的胰酶消化细胞，800rpm离心3min，用0.5mLPBS重悬细胞。并通过流式细胞仪进行荧光定量，分析细胞对[email protected]的摄取情况。C6的激发波长和发射波长分别为466nm，504nm。
通过CLSM成像可以更加直观地观察细胞对药物的摄取情况，本实施例将Cal-27细胞和L02细胞分别以每孔1×105个细胞接种于共聚焦皿中，于37℃、5％CO2恒温培养箱中生长过夜。然后与C6标记的[email protected]共同孵育。在第4、8、12和24h收集细胞，并用PBS洗涤3次，除去游离未被摄取的脂质体。用4％多聚甲醛固定15min，PBS洗涤3次，在室温下用Hoechst 33342染色15min，再用PBS洗涤3次，除去多余的细胞核染料，然后用CLSM进行成像。
如图10(a)所示，Cal-27细胞对C6标记的R-MLipOPT的摄取明显高于L02细胞。如图10(b)所示，Cal-27细胞和L02细胞对R-MLipOPT的摄取分别在12h和16h到达平台期。表明炎症因子可以激活[email protected]中的中性粒细胞发生分解，然后释放出R-MLipOPT，然后在cRGD靶向肽的介导下，肿瘤细胞可以摄取大量的R-MLipOPT，从而实现了[email protected]的多级靶向功能。
实施例13药物递送系统改善肿瘤乏氧的表征
将乏氧容器维持在低氧水平(1％O2,5％CO2和94％N2)，将生长有Cal-27细胞的12孔板置于乏氧容器中。用氧指示剂监测乏氧室和介质中的氧气浓度。当细胞达到80％～90％融合时，然后与100nM PMA处理的NEs、R-MLipOPT、[email protected]和[email protected]一起孵育12h。在培养基中加入乏氧试剂Image-iTTM Green，然后在37℃下孵育30min。使用CLSM进行荧光成像，并通过流式细胞仪定量荧光强度。Image-iTTM Green的激发波长和发射波长分别为488nm和520nm。
如图11所示，Cal-27细胞经R-MLipOPT和[email protected]超声处理后绿色荧光消失，而NEs和[email protected]组具有较强的绿色荧光，表明[email protected]和R-MLipOPT具有相同改善肿瘤细胞乏氧的行为。这主要归因于纳米制剂中的PFC具有较高的载氧能力。
实施例14药物递送系统在声动力作用下提高肿瘤细胞ROS水平的表征
将Cal-27细胞以每孔1×104个细胞接种于12孔板中，于37℃、5％CO2恒温培养箱中生长过夜。当细胞密度达到80～90％时，NEs、R-MLipOPT、[email protected]或[email protected]和100nM PMA一起加入细胞并在乏氧容器中孵育12h。然后向细胞中加入1mL培养基和1μL 1mM的CM-H2DCFDA孵育10min，用PBS洗涤3次，加入无血清培养基，并在0.35W/cm2，1MHz条件下超声处理3min。用PBS洗涤3次，在室温下用Hoechst 33342染色15min，再用PBS洗涤3次，除去多余的细胞核染料，然后用CLSM进行成像，并通过流式细胞仪定量荧光强度。
如图12(a)所示，相比于其他各组R-MLipOPT和[email protected]经超声处理后在肿瘤细胞中产生更多的绿色荧光，而含有他拉泊芬没有载氧的纳米制剂绿色荧光很弱。如图12(b)通过流式进行荧光定量，也显示出了相同的趋势。表明高载氧的全氟化合物在超声刺激下可以有效提高他拉泊芬产生更多的ROS。综上所述，[email protected]中载氧PFC与他拉泊芬联用在超声处理下具有协同增强肿瘤细胞内氧化应激水平的作用。
实施例15药物递送系统载在声动力作用下的细胞毒性研究
MTT实验：通过MTT实验考查不同浓度的[email protected]对L02细胞和Cal-27细胞活性的影响。首先分别将两种细胞以5×103个每孔接种于96孔板中，分别加入200μL RPMI1640完全培养基，于37℃、5％CO2恒温培养箱中生长过夜。当细胞密度达到90％左右时，向96孔板中分别加入100nM的PMA，再加入不同浓度的[email protected]孵育12h。在乏氧条件下，然后进行超声和不超声处理细胞，再培养24h。考察不同药物在超声处理后对Cal-27细胞活性的影响，则向96孔板中分别加入100nM的PMA，再加入NEs、R-MLipOPT、[email protected]和[email protected]孵育12h。在乏氧条件下，进行超声处理细胞，再培养24h。
考察不同药物在无超声处理时对L02和Cal-27细胞活性的影响，则向96孔板中分别加入100nM的PMA，再加入NEs、R-MLipOPT、[email protected]和[email protected]孵育12h，再培养24h。24h后移除96孔板中的培养基和药物，并向孔中加入200μL新鲜的完全培养基，20μL5mg/mLMTT溶液，在37℃孵育4h，使MTT还原为甲臜，然后小心吸去孔内MTT溶液，每孔中加入150μLDMSO溶液使甲臜溶解，用平板摇床震摇均匀，然后使用酶标仪在570nm波长处测量每个孔的吸光度。通过计算制图得到药物对细胞活性的影响。
MTT计算公式如下：
细胞存活率％＝(加药细胞OD/对照细胞OD)×100％
如图13(a)所示，超声处理下[email protected]可明显诱导癌细胞死亡，其IC50值为2.5μg/mL，而超声处理，[email protected]几乎无细胞毒性。如图13(b)所示，在超声和相同浓度他拉泊芬的条件下，R-MLipOPT和[email protected]能够显著的降低Cal-27的细胞活性，并且优于其他对照组。如图13(c)所示，在无超声处理下，[email protected]与其他对照组对Cal-27和L02的细胞活性几乎不产生影响。实验结果表明在没有外界超声刺激下，[email protected]具有较好的生物安全性，当给予超声处理后，可以有效触发[email protected]的声动力治疗效果，显著降低肿瘤细胞的活性。
实施例16药物递送系统在荷瘤小鼠体内分布的表征
研究[email protected]在PDX模型鼠体内的分布情况。当PDX模型小鼠的肿瘤体积达到～100mm3时。将小鼠随机分为两组，每组6只。将DiR标记的NEs和[email protected]，通过尾静脉注入小鼠体内，考察从给药到接受声动力治疗后的60h内的体内药物分布。在24h时，进行声动力治疗(2W/cm2，1MHz，3min)，治疗1天后进行第二次尾静脉注射，并在不同时间点对肿瘤区域进行活体成像和荧光定量。此外，在活体成像60h后，处死荷瘤小鼠，获得主要器官和肿瘤组织进行成像并荧光定量。
如图14(a)和(b)所示，在60h时，DiR标记的[email protected]的累积量明显高于DiR标记的NEs对照组。主要因为中性粒细胞具有靶向炎症的作用，超声治疗后肿瘤部位的ROS含量增加，从而放大炎症信号，促进更多的[email protected]靶向肿瘤，并长时间大量富集于肿瘤组织中。
实施例17药物递送系统体内超声成像表征
在体内成像实验中，当荷瘤小鼠肿瘤体积达到～100mm3时，将小鼠随机分为两组(n＝6)。通过小鼠尾静脉注射生理盐水和[email protected]，并在不同时间点拍摄荷瘤小鼠的超声图像。使用LOGIQ E9(GE医疗系统，美国)超声诊断仪进行体内成像。频率设置为2.5MHz，机械指数(MI)为0.16，动态范围为60dB。
如图15所示，肿瘤内的[email protected]在8h时超声成像达到最大值，并为对照组的5倍，表明该递药系统具有肿瘤诊断和检测的功能。
实施例18药物递送系统的药代动力学表征
采用健康雌性Balb/c裸鼠对DiR标记的NEs和[email protected]进行药物代动力学研究。通过尾静脉注射200μL含有0.5mg/kg DiR标记的NEs和[email protected]，并按预定的时间间隔采集血样。采血后，以10000rpm离心10min获得血浆。200μL乙腈和100μL血浆涡旋混合2min，然后12000rpm离心10min。吸取20μL上层清液注入高效液相色谱系统检测DiR的浓度。最后使用Kinetica 4.4获得药代动力学参数。
如图16所示，DiR标记的NEs在荷瘤小鼠血液中的T1/2、血浆清除率和AUC0-inf分别为6.06±2.03h、0.22±0.12mL/h和45.86±2.65μg h/mL。DiR标记的[email protected]在荷瘤小鼠血液中的T1/2、血浆清除率和AUC0-inf分别为6.45±1.06h、0.21±0.19mL/h和48.50±1.87μg h/mL。数据表明[email protected]和NEs具有相似的血液循环特性，可以用于体内抗肿瘤研究。
实施例19药物递送系统的体内抗肿瘤效应的表征
PDX模型小鼠随机分成4组，每组6只。尾静脉注射NEs和含有2mg/kg他拉泊芬剂量的R-MLipOPT、[email protected]及[email protected]，每2天注射一次，共8次。每次给药24h后，进行声动力治疗(2W/cm2，1MHz，3min)。每天测量肿瘤体积和体重，共21天。实验结束时，处死小鼠，收集肿瘤，称重并拍照。
此外，本发明实施例还监测了PDX小鼠的存活率，小鼠随机分为4组，每组10只。静脉注射NEs及含有2mg/kg他拉泊芬剂量的R-MLipOPT、[email protected]和[email protected]，每2天注射一次，共8次。每次给药24h后，进行声动力治疗(2W/cm2，1MHz，3min)。观察小鼠生命状态共60天。
如图17(a)所示，[email protected]声动力治疗组的肿瘤基本消失，肿瘤抑制明显高于其他对照组。表明[email protected]对PDX口腔癌小鼠具有优异的声动力治疗效果。如图17(b)所示，通过小鼠肿瘤体积监测发现，[email protected]对肿瘤的抑制显著优于R-MLipOPT，表明多级靶向功能的[email protected]不仅可以大量的在肿瘤组织中蓄积，而且在声动力治疗下可以产生更多的ROS诱导肿瘤凋亡。在治疗21天后对小鼠实施安乐死，收集肿瘤，称重并成像。如图17(c)所示，与其他治疗组相比，[email protected]治疗的小鼠肿瘤基本全部消失。[email protected]治疗组的肿瘤重量显著低于其他组，表明该制剂对PDX模型鼠具有优异的治疗效果。如图17(d)所示，[email protected]治疗组的体重未发生明显变化以及与毒性作用相关的症状等，表明该制剂不仅具有较好的协同抗肿瘤作用，还具有良好的生物相容性和安全性。此外，如图17(e)所示，NEs、R-MLipOPT、[email protected]分别在29、38、48天小鼠死亡50％，而[email protected]组的小鼠全部存活，并未产生死亡，表明[email protected]不仅具有优异的抗肿瘤效果而且显著延长了PDX模型小鼠的生存时间。
实施例20药物递送系统对荷瘤小鼠的组织学表征
肿瘤药效实验结束后，通过手术采集实验组和对照组的主要器官及肿瘤，包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏。通过ROS、caspase-3和H&E染色分别对各组肿瘤组织的ROS水平、凋亡和炎症情况进行分析。并通过H&E染色对各组的主要器官进行炎症及凋亡情况进行分析。
如图18(a)所示，通过ROS、H&E和caspase-3染色显示，超声处理的[email protected]可显著增加肿瘤组织中ROS含量，从而诱导肿瘤细胞坏死和凋亡。表明超声处理的[email protected]具有协同增强肿瘤细胞氧化应激水平并诱导肿瘤细胞凋亡的作用。在治疗结束后，本实施例进一步对NEs和[email protected]治疗组的主要器官进行组织学分析。如图18(b)所示，荷瘤裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织并未发生损伤和坏死，表明[email protected]的声动力治疗具有肿瘤特异性并对正常组织器官不产生毒性。
综上所述，超声介导的[email protected]具有良好的生物相容性、协同增强肿瘤细胞氧化应激水平的作用和较高的生物安全性。因此，[email protected]作为声动力治疗的新方法和试剂，对提高恶性肿瘤的治疗效果具有重要意义。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
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