一种薤白药材提取物、提取方法及制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种薤白药材提取物、提取方法及制备方法和应用 (Allium macrostemon medicinal material extract, extraction method, preparation method and application ) 是由 马贤鹏 肖雪 金慧子 郁华军 钟慧丽 严诗楷 李晓青 李莎莎 屠国丽 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种薤白药材提取物、提取方法及制备方法和应用,对薤白药材进行了系统深入的化学成分研究,本发明首次从中分离得到2个酰胺类成分薤白酰胺A和B,均为新化合物,并明确了提取物的提取方法、制备方法及在心肌细胞保护活性方面的应用。解决了国内外尚无薤白药材中等极性化学成分系统研究的文献报道、也未见与本发明中的薤白药材中分离得到的两个结构新颖的单体化合物制备方法以及用途有关报道的问题。(The invention relates to an allium macrostemon medicinal material extract, an extraction method, a preparation method and application, and systematically and deeply researches chemical components of an allium macrostemon medicinal material. Solves the problems that no literature report on the systematic research of the medium-polarity chemical components in the allium macrostemon medicinal material exists at home and abroad, and no report related to the preparation method and the application of two monomer compounds with novel structures separated from the allium macrostemon medicinal material is found.)
技术领域
本发明涉及天然药物发明领域，具体涉及一种薤白药材提取物、提取方法及制备方法和应用。
背景技术
薤白是百合科(Liliaceae)樟属(Allium)植物薤(Allium chinense G.Don)或小根蒜(Allium macrostemon Bunge)的鳞茎。(国家药典委员会.中华人民共和国药典2020年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2020:392.)作为一味传统的药食两用植物，始载于《神农本草经》，列为中品，《本草纲目》中记载薤白用于治疗“少阴病厥逆泄痢及胸痹刺痛，下气散血”。主要分布于我国东北、华北，朝鲜和日本也有分布。前人对薤白化学成分研究主要集中在大极性的甾体皂苷研究以及挥发油部位的定性分析，在药理活性研究方面，薤白挥发油被发现具有抑制血小板聚集、抗动脉粥样硬化等药理活性(盛艳华,李萌萌,郭云龙,黄鑫,越皓,陈长宝,王中喜,刘侗,杨德辉.薤白化学成分及其提取分离研究进展[J].特产研究,2020,42(05):61-70)。
目前，国内外尚无薤白药材中等极性化学成分系统研究的文献报道，也未见与本发明中的薤白药材中分离得到的两个结构新颖的单体化合物制备方法、用途有关的报道。
为了克服上述技术问题，本发明人对薤白进行了系统深入的化学成分研究，从中分离得2个酰胺类成分,均为新化合物，并明确了提取物的提取方法、制备方法及在体外心肌细胞保护活性方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种薤白药材提取物。
本发明另一个目的是提供一种薤白药材提取方法。
本发明另一个目的是提供一种薤白药材制备方法。
本发明另一个目的是提供的一种薤白酰胺A、B在制备治疗冠心病制剂中的应用。
本发明所述薤白药材的提取物为薤白酰胺A和薤白酰胺B，它们的结构分别如下：1)薤白酰胺A：
2)薤白酰胺B：
本发明的述薤白药材提取物的提取方法包括以下步骤：
1)将薤白药材干燥，粉碎，以5～10倍量95％乙醇在60～90℃下加热回流提取2～6次，每次2～4小时，合并得提取液，回收溶剂，浓缩得薤白药材总浓缩液；
2)总浓缩液浸膏混悬于2～7倍水中稀释，依次用2～7倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2～5次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100～200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1，4:1，100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分；
4)取其中4：1洗脱部分，用石油醚和乙酸乙酯各1～3倍体积溶解之后，加入200-300目浸膏1.5倍质量的硅胶拌样，上硅胶柱色谱以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯开始洗脱，使用薄层色谱TLC实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱，经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂，得薤白酰胺A，薤白酰胺B洗脱流分。
优选的，本发明的述薤白药材提取物的提取方法包括以下步骤：
1)将薤白药材干燥，粉碎，以6～9倍量95％乙醇在65～85℃下加热回流提取2～5次，每次2～4小时，合并得提取液，回收溶剂，浓缩得薤白药材总浓缩液；
2)总浓缩液浸膏混悬于2～6倍水中稀释，依次用2～6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2～4次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100～200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1，4:1，100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分；
4)取其中4：1洗脱部分，用石油醚和乙酸乙酯各1～3倍体积溶解之后，加入200-300目浸膏1.5倍质量的硅胶拌样，上硅胶柱色谱以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯开始洗脱，使用薄层色谱TLC实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱，经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂，得薤白酰胺A，薤白酰胺B洗脱流分。
进一步优选的，本发明的述薤白药材提取物的提取方法包括以下步骤：
1)将薤白药材干燥，粉碎，以8倍量95％乙醇在80℃下加热回流提取3～4次，每次2～4小时，合并得提取液，回收溶剂，浓缩得薤白药材总浓缩液；
2)总浓缩液浸膏混悬于3～5倍水中稀释，依次用3～5倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100～200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1，4:1，100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分；
4)取其中4：1洗脱部分，用石油醚和乙酸乙酯各1～3倍体积溶解之后，加入200-300目浸膏1.5倍质量的硅胶拌样，上硅胶柱色谱以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯开始洗脱，使用薄层色谱TLC实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱，经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂，得薤白酰胺A，薤白酰胺B洗脱流分。
前述所述提取方法中的步骤4)所得的薤白酰胺A，B洗脱流分经高效液相色谱制备，分别以20～40％甲醇5～15L洗脱薤白酰胺A，B流分，得到化合物薤白酰胺A，薤白酰胺B。
本发明所述提取物的制备方法是将薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以30％甲醇10L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
本发明所述提取物的制备方法是将薤白酰胺B洗脱流分经高效液相色谱制备，以25％甲醇10L洗脱，得到化合物薤白酰胺B。
本发明所述薤白酰胺A、B在制备治疗冠心病制剂中的应用。
本发明所述制剂为加入药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的制剂。
本发明所述制剂为固体制剂或液体制剂。
本发明所述制剂为加入药学上可接受的辅料制备成药学上可接受的制剂，所述固体制剂为颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、丸剂等，所述液体制剂为口服液、注射剂等。
本发明所述的药学上可接受的辅料没有限定，药学上能接受即可。
现有技术的问题及本发明具有以下有益效果：
一、现有技术的问题
目前，国内外尚无薤白药材中等极性化学成分系统研究的文献报道，也未见与本发明中的薤白药材中分离得到的两个结构新颖的单体化合物制备方法、用途有关的报道。
二、本发明的有益效果
1、本发明首次公开了薤白药材提取物，薤白酰胺A，B；并提供了它们的提取分离方法和结构确证的过程，完善了薤白化学成分研究，丰富了酰胺类化合物的多样性。
2、本发明人对薤白药材进行了系统深入的化学成分研究，从中分离得2个酰胺类成分,均为酰胺类新化合物，并明确了提取物的提取方法、制备方法及在体外心肌细胞保护活性方面的应用。
3、本发明通过提取物对H2O2诱导的H9c2细胞存活率的影响试验结果显示：与正常对照组相比，H2O2诱导的H9c2细胞损伤模型组(CH)细胞存活率降低至49.68％(P<0.0001)，与模型组相比，乙酸乙酯部位(XB-EA)样品干预，H9c2细胞存活率显著提高至63.44％(P<0.01)，对过氧化氢诱导的大鼠心肌细胞损伤具有显著的保护作用，说明其具有一定心肌细胞保护活性。
4、本发明通过提取物对H2O2诱导的H9c2细胞存活率的影响试验结果显示：与正常对照组相比，H2O2诱导的H9c2细胞损伤模型组(CH)细胞存活率降低至49.68％(P<0.0001)，与模型组相比，薤白酰胺A干预，H9c2心肌细胞存活率提高至52.29％，薤白酰胺B干预，H9c2心肌细胞存活率提高至55.64％，说明其具有心肌细胞保护活性。
附图说明
图1薤白酰胺A的1H-NMR图谱。
图2薤白酰胺A的13C-NMR和DEPT图谱。
图3薤白酰胺A的1H-1H COSY图谱。
图4薤白酰胺A的HSQC图谱。
图5薤白酰胺A的HMBC图谱。
图6薤白酰胺A的NOESY图谱。
图7薤白酰胺A的HR-ESI-MS高分辨质谱图谱。
图8薤白酰胺B的1H-NMR图谱。
图9薤白酰胺B的13C-NMR和DEPT图谱。
图10薤白酰胺B的1H-1H COSY图谱。
图11薤白酰胺B的HSQC图谱。
图12薤白酰胺B的HMBC图谱。
图13薤白酰胺B的NOESY图谱。
图14薤白酰胺B的HR-ESI-MS高分辨质谱图谱。
图15薤白药材总提取物(ZT)、石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(Bu-OH)、水萃取(H2O)、薤白酰胺A和薤白酰胺B抑制过氧化氢诱导的大鼠H9c2心肌细胞损伤活性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1薤白酰胺A、B，它们的结构分别如下：
1)薤白酰胺A：
2)薤白酰胺B：
实施例2薤白酰胺A、B的提取方法
1)将薤白药材干燥，粉碎，以8倍量95％乙醇在80℃下加热回流提取3～4次，每次2～4小时，合并得提取液，回收溶剂，浓缩得薤白药材总浓缩液；
2)总浓缩液浸膏混悬于3～5倍水中稀释，依次用3～5倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100～200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1，4:1，100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分；
4)取其中4：1洗脱部分，用石油醚和乙酸乙酯各1～3倍体积溶解之后，加入200-300目浸膏1.5倍质量的硅胶拌样，上硅胶柱色谱以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯开始洗脱，使用薄层色谱TLC实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱，经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂，得薤白酰胺A，薤白酰胺B洗脱流分。
实施例3薤白酰胺A、B的提取方法
1)将薤白药材干燥，粉碎，以6倍量95％乙醇在65℃下加热回流提取2次，每次2小时，合并得提取液，回收溶剂，浓缩得薤白药材总浓缩液；
2)总浓缩液浸膏混悬于2倍水中稀释，依次用2倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100～200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1，4:1，100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分；
4)取其中4：1洗脱部分，用石油醚和乙酸乙酯各1～3倍体积溶解之后，加入200-300目浸膏1.5倍质量的硅胶拌样，上硅胶柱色谱以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯开始洗脱，使用薄层色谱TLC实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱，经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂，得薤白酰胺A，薤白酰胺B洗脱流分。
实施例4薤白酰胺A、B的提取方法
1)将薤白药材干燥，粉碎，以9倍量95％乙醇在85℃下加热回流提取5次，每次4小时，合并得提取液，回收溶剂，浓缩得薤白药材总浓缩液；
2)总浓缩液浸膏混悬于6倍水中稀释，依次用6倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取4次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100～200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1，4:1，100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分；
4)取其中4：1洗脱部分，用石油醚和乙酸乙酯各1～3倍体积溶解之后，加入200-300目浸膏1.5倍质量的硅胶拌样，上硅胶柱色谱以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯开始洗脱，使用薄层色谱TLC实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱，经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂，得薤白酰胺A，薤白酰胺B洗脱流分。
实施例5薤白酰胺A、B的提取方法
1)将薤白药材干燥，粉碎，以5倍量95％乙醇在60℃下加热回流提取2次，每次2小时，合并得提取液，回收溶剂，浓缩得薤白药材总浓缩液；
2)总浓缩液浸膏混悬于2倍水中稀释，依次用2倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100～200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1，4:1，100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分；
4)取其中4：1洗脱部分，用石油醚和乙酸乙酯各1～3倍体积溶解之后，加入200-300目浸膏1.5倍质量的硅胶拌样，上硅胶柱色谱以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯开始洗脱，使用薄层色谱TLC实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱，经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂，得薤白酰胺A，薤白酰胺B洗脱流分。
实施例6薤白酰胺A、B的提取方法
1)将薤白药材干燥，粉碎，以10倍量95％乙醇在90℃下加热回流提取6次，每次4小时，合并得提取液，回收溶剂，浓缩得薤白药材总浓缩液；
2)总浓缩液浸膏混悬于7倍水中稀释，依次用7倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取5次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
3)将上述乙酸乙酯部位上100～200目正相硅胶柱色谱，依次用石油醚：乙酸乙酯进行梯度洗脱，具体比例以体积比为：100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1，4:1，100％乙酸乙酯，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分；
4)取其中4：1洗脱部分，用石油醚和乙酸乙酯各1～3倍体积溶解之后，加入200-300目浸膏1.5倍质量的硅胶拌样，上硅胶柱色谱以体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯开始洗脱，使用薄层色谱TLC实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱，经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂，得薤白酰胺A，薤白酰胺B洗脱流分。
实施例7薤白酰胺A、B的制备方法
将实施例1-6任一薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以30％甲醇10L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
实施例8薤白酰胺A、B的制备方法
将实施例1-6任一薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以30％甲醇5L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
实施例9薤白酰胺A、B的制备方法
将实施例1-6任一薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以30％甲醇15L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
实施例10薤白酰胺A、B的制备方法
将实施例1-6薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以20％甲醇10L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
实施例11薤白酰胺A、B的制备方法
将实施例1-6薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以20％甲醇5L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
实施例12薤白酰胺A、B的制备方法
将实施例1-6薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以20％甲醇15L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
实施例13薤白酰胺A、B的制备方法
将实施例1-6薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以40％甲醇10L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
实施例14薤白酰胺A、B的制备方法
将实施例1-6薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以40％甲醇5L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
实施例15薤白酰胺A、B的制备方法
将实施例1-6薤白酰胺A洗脱流分经高效液相色谱制备，以40％甲醇15L洗脱，得到化合物薤白酰胺A。
实施例16薤白酰胺A，B提取及制备方法
薤白药材(46.9kg)干燥粉碎后，80℃下用95％乙醇(料液比1：8)回流提取3次(4,2,2h),回收溶剂，浓缩得薤白药材浓缩液约(2.2kg)；总浓缩液浸膏混悬于3～5倍水中依次用3～5倍石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，减压回收溶剂，分别得到石油醚部位(180g)、乙酸乙酯部位(320g)和正丁醇部位(500g)。
将薤白的乙酸乙酯部位320g上正相硅胶柱(100-200目)，依次用石油醚-乙酸乙酯(100％石油醚,100:1,50:1,20:1,10:1,5:1,4:1及100％乙酸乙酯)梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得8个洗脱部分。
接下来继续细分，取其中4：1洗脱部分(27.2g)，用石油醚和乙酸乙酯溶解之后，加入约浸膏1.5倍质量的硅胶(200-300目)拌样。上硅胶柱色谱从石油醚-乙酸乙酯(10:1)开始洗脱，使用薄层色谱(TLC)实时监测，逐渐加大洗脱剂的极性，至石油醚-乙酸乙酯(1：1)的时候，检测发现化合物基本全部流出，停止过柱。经薄层色谱检测合并相似组成的洗脱液，减压回收溶剂得5个洗脱流分。
接下来是制备过程，第1个洗脱流分(305mg)使用色谱纯甲醇溶解，另取极少量溶解，稀释至约10mg/ml，使用高效液相色谱(HPLC)进样检测，方法为10％-100％MEOH-20min，可以观察到在17min有一较大的吸收峰(检测波长为210nm)，发现在15min处有一较大的吸收峰(检测波长为210nm)，后经过制备高效液相色谱方法，以30％甲醇(10L)洗脱，得到化合物薤白酰胺A(25.0mg)。
第2个洗脱流分(203mg)使用色谱纯甲醇溶解，另取极少量溶解，稀释至约10mg/ml，使用高效液相色谱(HPLC)进样检测，方法为10％-100％MEOH-20min，可以观察到在15min有一较大的吸收峰(检测波长为210nm)，后经过制备高效液相色谱方法，以25％甲醇(10L)洗脱，得到化合物薤白酰胺B(20.7mg)。
薤白酰胺A、B的1H-NMR和13C-NMR数据分别见表1和表2。
表1薤白酰胺A的1H-NMR,13C-NMR数据
表1薤白酰胺B的1H-NMR,13C-NMR数据
化合物原子编号见化合物结构式图；核磁化学位移单位为ppm。
薤白酰胺A：淡黄色油状物，溶于氯仿，先由ESI-MS：m/z 625[M+H]+，推测分子量为624，结合一维图谱确定分子式为C36H36N2O8，由HR-ESI-MS：m/z 647.2513[M+Na]+(calcd.for 647.2499)确认，Ω＝20，推测结构中存在多苯环结构。
一维氢谱中，在低场区存在两组反式双键次甲基质子信号[δH 7.43(1H,d,J＝15.7Hz),6.40(1H,d,J＝15.7Hz)]，[δH 6.61(1H,d,J＝12.6Hz),5.81(1H,d,J＝12.6Hz)]，以及两组苯环1，3，4-三取代特征芳基质子信号[δH 7.35(1H,d,J＝1.9Hz),6.92(1H,dd,J＝8.2,1.9Hz),6.73(1H,d,J＝8.2Hz)]，[δH 7.11(1H,d,J＝1.8H),7.02(1H,dd,J＝8.2,1.8Hz),6.79(1H,d,J＝8.2Hz)]，同时还存在两组苯环对位取代特征芳基质子信号[δH7.05(2H,d,J＝8.4Hz),6.71(2H,J＝8.4Hz)]，[δH 6.99(2H,d,J＝8.3Hz),6.68(2H,J＝8.3Hz)]，除此之外还存在两组甲氧基质子信号[δH 3.88(3H,s)]，[δH 3.82(3H,s)]，在高场区还存在两组分别相连的亚甲基质子信号[δH 3.46(2H,t,J＝7.4Hz),2.75(2H,t,J＝7.4Hz)]，[δH 3.39(2H,t,J＝7.4Hz),2.69(2H,t,J＝7.4Hz)]，还剩下6个未归属质子，推测该结构中存在胺基或羟基。
一维碳谱和DEPT谱显示该化合物，在低场区存在2个酰胺羰基碳信号[δC 168.8,167.7]，结合二维HSQC图谱，存在两组双键次甲基碳信号[δC 140.5,117.3]，[δC 136.9,120.2]，两组苯环对位取代双键次甲基碳信号[δC 129.3,114.8]，[δC 129.2,114.8]，两组苯环1，3，4-三取代特征次甲基碳信号[δC 123.4,114.4,112.5]，[δC 121.7,115.0,110.1]，以及苯环季碳信号[δC 155.5,155.4,148.4,147.8,147.1,147.0,129.8,129.7,127.1,126.8]，其中苯环季碳信号[δC 155.5,155.4,148.4,147.8,147.1,147.0]处于较低场，推测与羟基或甲氧基相连。同时还存在2个甲氧基碳信号[δC 54.9,54.9]，以及两组亚甲基碳信号[δC 41.1,34.3]，[δC 40.92,34.1]。
二维图谱中，通过1H-1H COSY图谱[H-3/H-4]，[H-3'/H-4']，[H-6/H-9,H-9/H-10]，[H-6'/H-9',H-9'/H-10']，[H-11/H-12]，[H-11'/H-12']之间存在1H-1H COSY信号。
在HMBC图谱中，存在双键次甲基氢(H-3)对双键次甲基碳(C-4)、苯环次甲基(C-6)和(C-10)、以及苯环季碳(C-5)和酰胺羰基(C-2)有响应信号，双键次甲基氢(H-4)对苯环季碳(C-5)和酰胺羰基(C-2)有相关信号，苯环次甲基氢(H-6)对苯环季碳(C-8)、双键次甲基碳(C-3)苯环次甲基碳(C-10)有相关信号，苯环次甲基氢(H-9)对苯环季碳(C-7)以及苯环季碳(C-5)有相关信号，苯环次甲基氢(H-10)对苯环季碳(C-8)、苯环次甲基碳(C-6)以及双键次甲基碳(C-3)有相关信号，甲氧基氢信号与(C-7)有相关信号，说明(C-7)与甲氧基相连，(C-8)与羟基相连，因此我们可以得到片段1可能为[-CO(2)-CH(3)＝CH(4)-(7-methoxy-8-hydroxyphenyl)]。
在另一侧，苯环次甲基氢(H-15,H-17)对苯环次甲基碳(C-14,C-18)以及苯环季碳(C-16)有相关信号，苯环次甲基氢(H-14,H-18)对苯环次甲基碳(C-15,C-17)以及苯环季碳(C-16)和苯环季碳(C-13)有相关信号，亚甲基氢(H-11)对亚甲基碳(C-12)、酰胺羰基碳(C-2)以及苯环季碳(C-13)存在相关信号，亚甲基氢(H-12)对亚甲基碳(C-11)以及苯环季碳(C-13)存在相关信号，可以得到片段2为[-CO(2)-CH2(11)-CH2(12)-(16-hydroxyphenyl)]。
同时苯环次甲基氢(H-6')对苯环季碳(C-8')、双键次甲基碳(C-3')苯环次甲基碳(C-10')有相关信号，苯环次甲基氢(H-9')对苯环季碳(C-5')以及苯环季碳(C-7')有相关信号，苯环次甲基氢(H-10')对苯环季碳(C-8')、苯环次甲基碳(C-6')以及双键次甲基碳(C-3')有相关信号，甲氧基氢信号与(C-7')有相关信号，双键次甲基氢(H-3')对双键次甲基碳(C-4')、苯环次甲基(C-6')和(C-10')、以及酰胺羰基(C-2')有响应信号，双键次甲基氢(H-4')对苯环季碳(C-5')、双键次甲基碳(C-3')有相关信号，以及和酰胺羰基(C-2')存在一个极弱的相关信号，因此我们可以得到片段3为[-CO(2')-CH(3')＝CH(4')-(7'-methoxy-8'-h ydroxyphenyl)]。
在另一侧，苯环次甲基氢(H-15',H-17')对苯环次甲基碳(C-14',C-18')以及苯环季碳(C-16')有相关信号，苯环次甲基氢(H-14',H-18')对苯环次甲基碳(C-15',C-17')以及苯环季碳(C-16')和苯环季碳(C-13')有相关信号，亚甲基氢(H-11')对亚甲基碳(C-12')、酰胺羰基碳(C-2')以及苯环季碳(C-13')存在相关信号，亚甲基氢(H-12')对亚甲基碳(C-11')以及苯环季碳(C-13')存在相关信号，可以得到片段4为[-CO(2')-CH2(11')-CH2(12')-(16'-hydroxyphenyl)]。
由于在HMBC图谱中，(H-4)、(H-3)以及(H-11)均对酰胺羰基(C-2)存在HMBC相关信号，说明N原子对HMBC干扰较小，推测为季胺结构，同理(H-4')以及(H-11')均对酰胺羰基(C-2)存在HMBC相关信号，且(H-3')对酰胺羰基(C-2)存在一个极弱的HMBC相关信号，推测均为季胺结构。故片段(1+2)和(3+4)以氮氮键相连。且根据(C-11,C-12)(C-11',C-12')的化学位移可知，(C-11)和(C-11')分别与氮原子相连，由于氮原子构型的原因，造成化学环境的不等价，使得碳原子呈现不同的化学位移值。得到的最终结构为：(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N'-((E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acryloyl)-N,N'-bis(4-hydroxyphenethyl)acrylohydrazide，并命名为薤白酰胺A。
薤白酰胺B：淡黄色油状物，溶于氯仿，先由ESI-MS：m/z 336[M+Na]+，推测分子量为313，结合一维谱确定分子式为C18H19NO4，后由HR-ESI-MS：m/z 314.1419[M+H]+(calcd.for 314.1392)确认，Ω＝10，推测结构中存在多苯环结构。
一维氢谱中，低场区存在一组反式双键质子信号[δH 7.45(1H,d,J＝15.6Hz),6.38(1H,d,J＝15.6Hz)]，以及一组苯环1，2，3-三取代特征芳基质子信号[δH 7.32(1H,d,J＝8.3Hz),7.09(1H,m),6.80(1H,d,J＝8.4Hz)]，同时还存在一组苯环对位取代特征芳基质子信号[δH 7.06(2H,d,J＝8.5Hz),6.73(2H,J＝8.5Hz)]，除此之外还存在一组甲氧基质子信号[δH 3.83(3H,s)]，在高场区还存在一组相连的亚甲基质子信号[δH 3.48(2H,t,J＝7.3Hz),2.77(2H,t,J＝7.3Hz)]，除去以
上16个质子信号外，推测该结构中存在胺基或羟基。
在13C-NMR和DEPT谱中在低场区存在1个酰胺羰基碳信号[δC 168.9]，结合二维HSQC图谱，存在一组双键次甲基碳信号[δC 140.7,117.3]，一组苯环对位取代双键次甲基碳信号[δC 129.3,114.9]，一组苯环1，2，3-三取代特征次甲基碳信号[δC 121.9,115.1,110.1]，以及苯环季碳信号[δC 155.2,148.3,147.7,129.8,115.0]，其中苯环季碳信号[δC55.2,148.3,147.7]处于较低场，推测与羟基或甲氧基相连。同时还存在1个甲氧基碳信号[δC54.9]，以及两组亚甲基碳信号[δC41.0,34.3]。
在二维图谱中先通过1H-1H COSY图谱[H-3/H-4]，[H-8/H-9,H-9/H-10]，[H-11/H-12]之间有1H-1H COSY信号。同时在HMBC图谱中，双键次甲基氢(H-3)对苯环次甲基(C-10)以及酰胺羰基(C-2)有响应信号，双键次甲基氢(H-4)对苯环季碳(C-5)和酰胺羰基(C-2)有相关信号，苯环次甲基氢(H-8)对苯环季碳(C-7)、苯环次甲基碳(C-10)有相关信号，苯环次甲基氢(H-9)对苯环季碳(C-6)以及苯环季碳(C-5)有相关信号，苯环次甲基氢(H-10)对苯环次甲基碳(C-9)、苯环季碳(C-6)以及双键次甲基碳(C-3)有相关信号，甲氧基氢信号与(C-7)有相关信号，说明(C-7)与甲氧基相连，(C-6)与羟基相连，因此我们可以得到片段1可能为[-CO(2)-CH(3)＝CH(4)-(6-hydroxy-7-methoxyphenyl)]。
在另一侧，苯环次甲基氢(H-15,H-17)对苯环次甲基碳(C-14,C-18)以及苯环季碳(C-16)有相关信号，苯环次甲基氢(H-14,H-18)对苯环次甲基碳(C-15,C-17)以及苯环季碳(C-16)和苯环季碳(C-13)有相关信号，亚甲基氢(H-11)对亚甲基碳(C-12)、酰胺羰基碳(C-2)以及苯环季碳(C-13)存在相关信号，亚甲基氢(H-12)对亚甲基碳(C-11)以及苯环季碳(C-13)存在相关信号，可以得到片段2为[-CO(2)-CH2(11)-CH2(12)-(16-hydroxyphenyl)]。
根据以上数据以及与薤白酰胺A的数据比对，可以得到该化合物为：(E)-3-(2-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-(4-hydroxyphenethyl)acrylamide，并命名为薤白酰胺B。
综上所述，可以确定上述制备得到的薤白酰胺A，B化合物结构为：(E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N'-((E)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)acryloyl)-N,N'-bis(4-hydroxyphenethyl)acrylohydrazide，和(E)-3-(2-hydroxy-3-methoxyphenyl)-N-(4-hydroxyphenethyl)acrylamide。
实施例17
取薤白酰胺A或B作为原料药，加入1/8的淀粉，制粒，得颗粒剂。
实施例18取薤白酰胺A或B作为原料药，加入1/10的淀粉，混匀，装入胶囊，得胶囊剂。
实施例19取薤白酰胺A或B作为原料药，加入及1/10的糊精混合均匀，干燥，制成丸剂。
实施例20取薤白酰胺A或B作为原料药，加入1/8的淀粉，制粒，压片，制成片剂。
实施例21取薤白酰胺A或B作为原料药，加入20倍量注射用水，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例22取薤白酰胺A或B作为原料药，加入5倍量水，过滤，灭菌，得口服液。
实施例23薤白药材总提取物、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位抑制过氧化氢诱导的大鼠H9c2心肌细胞损伤活性。
(1)样品配置
实施例16制得的薤白药材总提取物、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水萃取部位用DMSO(二甲亚砜)(Merck)溶解后，加入PBS(磷酸盐缓冲液)配成10mg/mL的溶液，进一步稀释为不同梯度浓度的样品。以200μM的过氧化氢为诱导剂。
(2)实验方法
H9c2细胞(北京中医药大学赠予)为贴壁生长细胞，常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。实验时，弃去原培养基，按每孔100μL体积加入终浓度为50μg/mL的已溶解待测化合物的完全培养基，放回培养箱中。1h后按每孔5μL体积加入终浓度为200μM的H2O2，放回培养箱培养24h。24h后，避光加入MTT试剂，使得终浓度为500μg/mL。继续培养4h后，吸去上清液，每孔加入100μL DMSO，避光溶解10min后，测定吸光度值。
(3)评价标准及统计方法
570nm波长处测吸收度，所得数据均采用GraphPad 8.0分析处理，数值以平均数±标准差表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组间数据使用t检验。
(4)实验结果
提取物对H2O2诱导的H9c2细胞存活率的影响：与正常对照组相比，H2O2诱导的H9c2细胞损伤模型组(CH)细胞存活率降低至49.68％(P<0.0001)，与模型组相比，乙酸乙酯部位(XB-EA)样品干预，H9c2细胞存活率显著提高至63.44％(P<0.01)，对过氧化氢诱导的大鼠心肌细胞损伤具有显著的保护作用(结果见图15)。
实施例24薤白酰胺A，B抑制过氧化氢诱导的大鼠H9c2心肌细胞损伤活性。
(1)样品配置
实施例2-10制得的薤白酰胺A和B(二甲亚砜)(Merck)溶解后，加入PBS(磷酸盐缓冲液)配成10mg/mL的溶液，进一步稀释为不同梯度浓度的样品。以200μM的过氧化氢为诱导剂。
(2)实验方法
H9c2细胞(北京中医药大学赠予)为贴壁生长细胞，常规培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。实验时，弃去原培养基，按每孔100μL体积加入终浓度为50μM的已溶解待测化合物的完全培养基，放回培养箱中。1h后按每孔5μL体积加入终浓度为200μM的H2O2，放回培养箱培养24h。24h后，避光加入MTT试剂，使得终浓度为500μg/mL。继续培养4h后，吸去上清液，每孔加入100μL DMSO，避光溶解10min后，测定吸光度值。
(3)评价标准及统计方法
570nm波长处测吸收度，所得数据均采用GraphPad 8.0分析处理，数值以平均数±标准差表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，两组间数据使用t检验。
(4)实验结果
提取物对H2O2诱导的H9c2细胞存活率的影响：与正常对照组相比，H2O2诱导的H9c2细胞损伤模型组(CH)细胞存活率降低至49.68％(P<0.0001)，与模型组相比，薤白酰胺A干预，H9c2心肌细胞存活率提高至52.29％，薤白酰胺B干预，H9c2心肌细胞存活率提高至55.64％，具有一定的心肌细胞保护活性(结果见图15)。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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