具体实施方式

以下的详细描述包括对附图的介绍，其形成详细描述的一部分。附图通过举例说明的方式示出了其中可实施本发明的一些具体实施方案。这些实施方案，在本文中也被称为“实施例”，被足够详细地描述，以使本领域技术人员能够实施本发明。在不脱离本发明的范围的情况下，可将示例性实施方案组合，可使用另外的实施方案，或者可进行结构和逻辑改变。尽管将结合所列举的权利要求描述所公开的主题，但是应理解，例示的主题并不旨在将权利要求限制于所公开的主题。因此，以下的详细描述不应被视为限制意义的，并且本发明的范围由所附权利要求书及其等同物限定。

在本文件中，除非另有说明，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种；术语“或/或者”用于指代非排他性的“或/或者”。另外，本文中所用并且未以其他方式限定的措词或术语是用于仅描述而非限制的目的。此外，本文件中提及的所有出版物、专利和专利文献均通过引用整体并入本文，如同通过引用单独并入一样。如果本文件与通过引用并入的那些文件之间的用法不一致，则所并入的参考文献中的用法应被视为对本文件的用法的补充；对于不可调和的不一致性，以本文件中的用法为准。

说明书中对“一个实施方案”、“实施方案”、“示例性实施方案”等的引用指示所描述的实施方案可包括特定特征、结构或特性，但是可能并非每个实施方案都一定包括所述特定特征、结构或特性。此外，这样的短语不一定是指同一实施方案。此外，当结合实施方案描述特定特征、结构或特性时，认为结合无论是否明确描述的另外的实施方案来影响这样的特征、结构或特性在本领域技术人员的知识范围内。

以范围形式表示的值应以灵活的方式解释，以不仅包含明确列举作为范围的限制的数值，而且还包含涵盖在该范围内的所有单独的数值或子范围，如同每个数值和子范围都被明确列举一样。例如，“约0.1％至约5％”的浓度范围应解释为不仅包含明确列举的约0.1wt.％至约5wt.％的浓度，而且还包含指定范围内的单独的浓度(例如，1％、2％、3％和4％)和子范围(例如，0.1％至0.5％、1.1％至2.2％和3.3％至4.4％)。

本文中使用的术语“约”可允许值或范围有一定程度的可变性——例如，在指定的值或指定的范围限制的10％内、5％内、1％内、0.5％内、0.1％内、0.05％内、0.01％内、0.005％内或0.001％内——并包括所述确切的指定值或范围。

本文中使用的“对象”是动物。动物包括哺乳动物，包括伴侣动物，例如狗或猫；农场动物，例如马、牛或猪；实验室动物，例如小鼠或大鼠；以及非人灵长类和人。所述对象还包括鸟。

术语“不育(infertility)”或“不育(sterility)”是指无法生育或不能够孕育后代的状态。不育可发生在雄性或雌性或两者中。

本文中使用的“有效量”意指足以诱导不育(即，使动物不育)的量。有效量可以以一次或更多次施用来施用。在一些实施方案中，EB的有效量可与另外的药物、化合物或药物组合物组合实现。在另一些实施方案中，EB的有效量可以独立于另外的药物、化合物或药物组合物的使用来实现。

本文中使用的词语“eSpay”是指使用如本文中所述的EB的组合物和/或方法的任何实施方案。

本文中使用的术语“载体”、“可药用载体”或“生理上可接受的载体”是指适用于实现或增强作为组合物(即，药物组合物)的EB的递送的一种或更多种制剂材料。

组合物和方法

本文中描述了包含苯甲酸雌二醇(EB)的组合物以及使用苯甲酸雌二醇作为动物不育的不育剂/诱导剂的方法。可用于所述方法的其他化合物包括但不限于雌二醇、二丙酸雌二醇、戊酸雌二醇、环戊丙酸雌二醇(例如，可使用释放雌二醇或在功能上类似于体内雌二醇发挥作用的任何形式的化学化合物)。EB具有以下结构：

EB的浓度/量

不育剂(诱导不育)组合物包含诱导不育的量的EB。诱导不育的EB的有效量可取决于例如施用途径、动物年龄及其尺寸(体重)。因此，技术人员可滴定剂量并修改EB的施用途径以获得对特定动物的最佳效果。EB的典型剂量可以是约0.01mg/kg至多至约100mg/kg或更多。在另一些实施方案中，EB的剂量可以是0.1mg/kg多至约100mg/kg；或1mg/kg多至约100mg/kg；或5mg/kg多至约100mg/kg。例如，在大鼠和仓鼠中，可施用300、100或30μg以诱导不育。在较大的动物中，类似的剂量将是有效的。

施用时间

在初情期之前(在达到性成熟/能够繁殖之前)施用包含EB的组合物以诱导不育。组合物可在出生之后数天、数周、数月或甚至数年施用，只要在动物达到初情期之前施用组合物即可。EB的施用有效地抑制/阻断性器官/性腺的成熟。

施用途径

本文中提供的组合物的施用途径是根据已知方法例如注射(腹膜内、肌内、皮下)和经鼻(吸入)的。在一个实施方案中，EB以一次性单剂量施用以使动物绝育。在另一些实施方案中，可进行多次EB施用以产生绝育。

组合物

在一个实施方案中，用于可注射施用的EB组合物可以是油性混悬剂的形式，包括油，例如植物油(例如，玉米油)、棉籽油、花生油和/或芝麻油。作为油的替代或除油之外，可使用其他载体或填充剂。载体/填充剂可包括乳糖、蔗糖、淀粉粉末、链烷酸纤维素酯、纤维素烷基酯、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、明胶、阿拉伯胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或聚乙烯醇。这些混悬剂可根据本领域可用的用于分散和助悬成分的方法配制。

在另一个实施方案中，上述组合物可进行包封以施用。在一个实施方案中，胶囊剂可由每端具有塞的硅酮管形成以包含例如EB和油的混合物。胶囊剂可放置在对象体内，例如通过注射(在下文进一步描述)。本文中所述的EB组合物可被配制成用于立即释放或在延释制剂(例如，缓释)中。例如，EB可与保护EB免于迅速释放的载体一起制备，例如控释制剂。

许多用于制备控释/缓释制剂的方法是本领域技术人员已知的。例如，用于配制多种持续或受控递送方式的技术也是本领域技术人员已知的，例如脂质体载体、聚合物(例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、硅酮、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG))、微粒、纳米粒或多孔珠、和积存注射(depot injection)。例如，参见PCT/US93/00829，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的受控释放。持续释放(sustained-release)制剂的另外的实例包括成型制品形式的半透性聚合物基质，例如膜或微胶囊剂。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(美国专利No.3,773,919、EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman et al.，Biopolymers，22：547-556，1983)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.，15；167-277，1981；Langer et al.，Chem.Tech.12：98-105，1982)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer etal.，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。持续释放组合物还包括脂质体，其可通过本领域已知的数种方法中的任一种制备。参见例如Eppstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688-3692，1985；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949。

在一些实施方案中，组合物具有不同的释放速率(例如，受控释放或立即释放)。立即释放是指EB在施用之后立即释放。在另一个实施方案中，立即释放在当施用之后1至20分钟内存在EB溶出时发生。溶出可以是所有EB或少于所有EB(例如，约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、99.9％或99.99％)。在另一个实施方案中，立即释放导致在施用之后约一小时内完全溶出或少于完全溶出。

受控释放、缓慢释放或持续释放是指活性成分(例如EB)从组合物或剂型中释放，其中活性成分在延长的时间段内释放。在一个实施方案中，受控释放导致EB在施用之后20至180分钟内溶出。在另一个实施方案中，受控释放导致在数小时至数天或数周内溶出。在另一个实施方案中，EB在数周的时间(包括约15至20天)内释放。

在另一个实施方案中，组合物被配制用于吸入；例如，EB可配制成干粉。吸入溶液也可与用于气雾剂递送的抛射剂一起配制。在另一个实施例中，吸入溶液可被雾化。

一个实施方案提供了用于产生单剂量施用单元的试剂盒。试剂盒可包含含有EB和使用(使动物不育)说明书的单腔和多腔预填充注射器。

递送系统实施方案

本公开内容还描述了用于将化学不育剂组合物(也被称为“化学不育剂递送系统”)递送到动物中以开始对所述动物进行化学绝育的系统和方法。在一个实施方案中，不育剂是EB。

图27示出了示例性化学不育剂递送系统10(在下文中称为“不育剂系统10”或简称为“系统10”)的概念视图。该系统10实例包括注入器装置12(在下文中也称为“注入器12”)，其被配置为将不育剂容器主体14(例如，胶囊剂)递送到动物2(以图27中的幼犬/新生犬2示出，其可以是雄性或雌性幼犬/新生犬)之上或之中。本领域技术人员将理解，动物2可以是雄性或雌性并且可以是另一种类型的家畜，例如仔猪或羔羊，或者可以是伴侣动物，例如狗或猫。不育剂容器主体14包含特定剂量的化学不育剂(例如，EB)并且被配置为在不育剂容器主体14已通过注入器12递送至动物2之后将化学不育剂释放到动物2中或其上。在一个实例中，不育剂容器主体14通常是胶囊剂的形状，例如圆柱形或基本上圆柱形的主体，使得其可通过注入器12并到动物2中或其上，如下文更详细地描述的。为此，不育剂容器主体14也将被称为“不育剂递送胶囊剂14”、“递送胶囊剂14”或简称为“胶囊剂14”。本领域技术人员将理解，不育剂递送主体14不需要具有通常可被认为是“胶囊剂”的圆柱形或基本上圆柱形的形状。

在一个实例中，注入器12包括主体16、力构件20(例如，柱塞)，以及在一些实例中，包括插入结构18和/或一个或更多个抓持构件22。在图27所示的实例中，注入器12构造类似于医用注射器，使得在一些实例中注入器12将被称为“注射器12”，主体16将被称为“筒16”，并且力构件20将被称为“活塞20”。在一个实例中，主体16至少部分地包围室24，力构件20的一部分位于室24中。在一个实例中，力构件20可沿室24滑动以改变室24中的气体或流体所经历的内部体积，从而改变室24中的气体或流体的压力，并因此改变由室24中的气体或流体施加的驱动力。

在一个实例中，插入结构18(任选地)包括这样的结构：递送胶囊剂14将通过其以提供递送胶囊剂14在动物2中或其上的特定位置处的放置。在一个实例中，插入结构18包括具有小横截面面积的窄结构，其允许插入结构18用于刺穿动物2的一个或更多个表皮层，使得递送胶囊剂14可被注射到其中。为此，插入结构18在下文中也可被称为“皮下注射针18”或简称为“针18”。例如，针18可包括套管26，其从连接至筒16的近端和被配置用于插入到动物2中的远端延伸。套管26的远端可包括相对尖锐的尖端，其可刺穿目标动物2的一个或更多个表皮层。腔30从近端到远端穿过套管26。在一个实例中，递送胶囊剂14可定位在腔30中，在那里递送胶囊剂14可被驱动出套管26。在一个实例中，腔30与注射器室24流体连通，使得力构件20当向前移动时可驱动递送胶囊剂14穿过腔30并以足够的力从远侧尖端出来以注射到目标动物2中。

力构件20包括可移动结构，其当从第一位置移动到第二位置时可导致递送胶囊剂14移出注入器12，使得递送胶囊剂14可被递送到动物2中或其上。在其中注入器12是注射器状装置的实例中，主体16可成形为圆柱形管状构型，使得主体16在本文中也可被称为“筒16。”力构件20可包括在圆柱形筒16内紧密配合的活塞(例如，具有与筒16的横截面基本相同的横截面形状和尺寸的结构)，使得当力构件20沿筒16轴向移动时，压缩位于室24内的气体(例如空气)，并且提高的压力充当驱动力以驱动递送胶囊剂14通过插入结构18。在另一个实例中，力构件20包括连接至活塞20或作为活塞20的一部分的推动结构28，其中推动结构28接合递送胶囊剂14并将递送胶囊剂14从注入器12推出。例如，如果注入器12包括插入结构18，那么推动结构28推动递送胶囊剂14穿过插入结构的腔30并离开套管26的远侧尖端以插入到目标动物中。在一个实例中，一个或更多个抓持构件22设置在注入器12的主体16上并允许使用者在致动力构件20以将递送胶囊剂14驱动到目标动物2中的同时持有并稳定注入器12。

在一个实例中，确定递送胶囊剂14的尺寸和形状使其在插入结构18的腔30内合适。在一个实例中，确定递送胶囊剂14的尺寸和形状以用于肌内、腹膜内或皮下注射到动物2中。

已发现图27中所示的不育剂系统10有效地为哺乳动物提供基于化学的绝育。例如，在将包含含有苯甲酸雌二醇的不育剂组合物34的不育剂递送胶囊剂14皮下注射至未成熟的雄性大鼠的实验中(在以下实施例中更详细地描述并且如上所述)，发现不育剂组合物34有效抑制脑的下丘脑、睾丸(例如，睾酮和精子产生的部位)以及精囊和前列腺(例如，产生精液成分的辅助雄性生殖腺)中神经元亲吻促动素的产生。注射了包含EB的递送胶囊剂14的雄性大鼠被阻止经历初情期并变得永久不育。具体地，雄性大鼠的睾丸不产生睾酮或精子。当将具有苯甲酸雌二醇不育剂组合物34的不育剂递送胶囊剂14注射到未成熟的雌性大鼠中时，发现苯甲酸雌二醇抑制了雌性的生殖系统，阻止雌性经历月经周期并阻止产生卵子。

对象大鼠也没有作为通过不育剂递送胶囊剂14注射苯甲酸雌二醇的结果的任何明显的负面健康作用。在雄性或雌性对象大鼠中，对动物免疫系统、肝和肾功能的检查未发现临床病理状况。此外，在用包含苯甲酸雌二醇的递送胶囊剂14对多于200个动物进行测试之后，在六个月的测试时间期间，没有对象动物死亡或表现出疾病。

生殖系统的发育和功能在所有哺乳动物物种中是一致的。所有哺乳动物都使用相同的生殖激素，其在物种之间的差异很小。例如，从一个物种中提取的生殖激素，例如雌激素、孕酮、亲吻促动素、黄体生成素(LH)和促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)在所有或几乎所有其他哺乳动物物种中具有相同或基本相似的生物学作用。由于高水平的保守性，苯甲酸雌二醇不育剂组合物34(和其他雌二醇类型的组合物)将有效地使所有哺乳动物和鸟不育。

实施例

通过参考以举例说明的方式提供的以下实施例可更好地理解多种实施方案。本公开内容不限于本文中给出的实施例。

实施例1

eSpay植入剂诱导雄性和雌性永久不育。

引言

在哺乳动物中，亲吻促动素通过直接刺激促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)(也称为促性腺素释放素(gonadoliberin))的释放来开始初情期。因此，亲吻促动素促进初情期和正常性腺发育的正确时机。已发现敲除负责编码亲吻促动素或其受体GPR54的Kiss1基因会导致雄性和雌性小鼠(其中小鼠被用作模型生物)二者的不育。亲吻促动素主要在下丘脑的两个区域，视前区(POA)和弓状核(ARC)中表达。尽管认为POA中的亲吻促动素神经元在雌性的黄体生成素激增(surge)中起关键作用，但弓状核亲吻促动素神经元在雄性和雌性成年二者中介导了类固醇对GnRH释放的负反馈作用。尽管初情期前哺乳动物中的亲吻促动素是开始初情期所必需的，但特定群的贡献，无论是来源于弓状核还是视前区，仍是不清楚的。

亲吻促动素神经元的发育和亲吻促动素的表达在POA和ARC之间可能不同。在视前区，Kiss1表达细胞在两种性别的实验室动物(小鼠和大鼠)中均在出生后天数(postnatalday，PND)8至10天之间出现。性二态性(sexual dimorphism)在出生后第10至12天显现，其中雌性在视前区呈现出比雄性更多的亲吻促动素细胞。相比之下，弓状核中的亲吻促动素在胚胎发育期间表达。在两种性别中，信使RNA和蛋白质表达均在约14.5天胎龄时出现，至18.5天胎龄时提高，并在恰好出生之前下降。在出生之后第0天(快至0至4小时)检测到弓状Kiss1信使RNA。与视前区不同，弓状Kiss1通常在啮齿动物生命的前十天表达。然后在出生后第三周期间表达降低，但在初情期时开始显示出提高。

与视前区中的表达进一步相比，弓状亲吻促动素表达在成年中不是高度性二态性的，与介导在两种性别中均发生的负反馈的功能相容。已发现弓状亲吻促动素表达似乎在两种性别中均在约早期初情期开始时提高。例如，在雌性大鼠中，Kiss1信使RNA和神经元纤维密度二者在初情期开始之前均提高，其中提高首先出现在弓状核中，并之后出现在视前区中。这表明弓状核中的亲吻促动素可能是初情期开始的原因。

性类固醇似乎是亲吻促动素神经元的正确发育和组织以及Kiss1表达所必需的。在亲吻促动素细胞特异性雌激素受体α敲除小鼠中，下丘脑中的亲吻促动素纤维数量降低。当在发育的啮齿动物中通过性腺切除术耗尽激素时也是如此。雌激素和睾酮抑制弓状核中的Kiss1表达，但提高视前区中的Kiss1表达。已发现亲吻促动素神经元可与雌激素受体共区域化(colocalize)；此外，在初情期之前，雌激素信号传导可抑制弓状核中的亲吻促动素，这可中断下丘脑-垂体-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG)轴的激活，从而防止初情期的提前开始。

此外，雌性在出生后第0至10天期间暴露于雌激素可导致弓状核中亲吻促动素表达的永久抑制。据报道这些大鼠未表现出黄体生成素分泌或发情周期。尽管产生了GnRH，但其释放似乎受到了干扰。观察到的Kiss1表达细胞和亲吻促动素免疫反应性细胞的数量显著降低。然而，尚不清楚雌激素暴露是否影响亲吻促动素神经元增殖和分化或者Kiss1基因的转录和表达。

材料和方法

动物。3月龄的Sprague-Dawley雄性和雌性大鼠购自Charles River实验室并用作繁殖者(breeder)。如果不用于实验目的，新生儿被指定为连续繁殖者。当繁殖者达到繁殖龄(雌性6周龄而雄性10周龄)时，将繁殖对设置在单独的笼中进行连续繁殖，直到产生期望数量的幼仔或者繁殖者达到一岁龄。怀孕通过雌性繁殖者的体重和腹部隆起的变化来表示。在出生时(出生后当天或PND 0)，区分幼仔性别并将其分配至特定的实验。当幼仔达到21日龄时使其断奶。

植入苯甲酸雌二醇胶囊剂。将EB粉末(17β-雌二醇3-苯甲酸酯，Sigma E8515)溶解于芝麻油(Sigma S3547)中，以制成浓度为300μg/5μl的溶液。EB-300μg的胶囊剂(EB300)是使用包含5μl EB溶液的硅酮管(Dow Corning 508-005)然后将其用硅酮密封剂(FactorII，Inc.医用黏合剂A-100)密封而制成的。将胶囊剂(在本文中称为EB300或eSpay)在室温下放置一小时以使密封剂干燥，并随后浸入芝麻油中。胶囊剂的尺寸为长8mm，且直径为2.16mm。通过施加聚维酮碘溶液对植入部位的皮肤(肩之间的背上)进行消毒。在靠近肩的背上用无菌手术剪在皮肤上切出2mm长的横向切口。通过插入钝头钳的尖端在皮肤和肌肉层之间形成包(packet)。将胶囊剂插入到袋(pocket)中并向侧面推，使得胶囊剂远离切口朝向。通过施加手术黏合剂密封切口。

激素测量。从尾静脉或通过心脏穿刺收集血液。将血液以2000×g离心10分钟；然后收集血清并保存在-20℃下直至进一步分析。通过使用ELISA试剂盒(DRG EIA4399)测量血清雌二醇浓度，其中可报告范围为1.4至200pg/ml。使用ELISA试剂盒(DRG EIA1559)测量循环睾酮的浓度，其中可报告范围为0.083至16ng/ml。如先前所述(PMID：8462469)，在弗吉尼亚大学生殖配体测定和分析核心研究中心(University of Virginia Center forResearch in Reproduction Ligand Assay and Analysis Core)使用针对牛LH(no.581B7)和人LH-β亚基(no.5303：Medix Biochemica，Kauniainen，Finland)二者的单克隆抗体通过夹心免疫测定测量血清黄体生成素(LH)浓度，其中可报告范围为0.04至37.4ng/mL。

测试雄性交配行为。为了研究性行为，将4月龄的雄性大鼠与发情诱导的去卵巢雌性配对。通过用外源性雌二醇(50μg/kg s.c.，测试之前54小时)和孕酮(2.0mg/kg s.c.，测试之前6小时)进行处理来诱导发情。在带有红色滤光片的40W灯照明的新鲜透明笼(56×35×31cm)中观察雄性性行为。将每只未经处理的雄性大鼠单独放置在测试笼中五分钟。然后引入一个接受型雌性，并观察性行为30分钟。如先前所述(PMID：17016704)，记录每只动物到首次交配的时间(潜伏期)和交配次数。

精子分析。切除附睾尾并用细剪刀在温热(37℃)的磷酸盐缓冲盐水中切碎。将精子悬液在37℃下孵育10分钟，以使精子游出切碎的附睾。然后通过计算机辅助精子分析仪(CASA；Sperm Vision II，Minitube of America，Vernon，WI，USA)分析精子活力。检查了覆盖了精液分析室的整个可视区域且没有重叠的连续视野的至少十个显微镜视野。精子活力通过活动精子、进行性活动精子和不动精子的百分比来测量。对于总精子计数，从每只小鼠中收集两个等分试样的精液样品，并将其在1∶200的福尔马林中稀释以进行固定。使用血细胞计数器对精子数进行计数，并计算每毫升的精子平均数浓度并将其报告为百万精子/毫升。

KISS-10注射之后的下丘脑-垂体反应性。从60至70日龄的成年雄性和雌性大鼠的腹侧尾静脉收集外周血(50μL)。血液收集之后立即向大鼠腹膜内注射50纳摩/动物的亲吻促动素-10(Metastin 45-54，Millipore-Sigma，San Diego，CA)，并在注射之后30分钟收集另外的血液样品。样品以2000×g离心10分钟，并收集血清并储存在-20℃下直至进一步分析。如先前所述(PMID：8462469)，在弗吉尼亚大学生殖配体测定和分析核心研究中心使用针对牛LH(no.581B7)和人LH-β亚基(no.5303：Medix Biochemica，Kauniainen，Finland)二者的单克隆抗体通过夹心免疫测定测量血清黄体生成素(LH)浓度，其中可报告范围为0.04至37.4ng/mL。

生育力测试。为了评估雄性大鼠的生育力，使每只雄性大鼠在4月龄时与繁殖者雌性一起居住两周。记录雄性生育力百分比(产生胎仔的雄性数量/雄性总数×100)和胎仔数(每窝幼仔数)。为了评估雌性大鼠的生育力，使每只雌性大鼠在3月龄时与繁殖者雄性一起居住两周。记录雌性生育力百分比(产生胎仔的雌性数量/雌性总数×100)和胎仔数(每窝幼仔数)。

组织病理学。在大鼠各自的采样龄时，通过CO₂窒息随后是双侧开胸术使大鼠安乐死。解剖出全部或部分器官(脑、垂体、性腺、生殖道、心脏、肝、肾、脾、乳腺和股骨)并立即在刚制备的4％多聚甲醛中固定24小时，随后在PBS(磷酸盐缓冲盐水pH 7.4)中清洗，并然后在4℃下在70％乙醇中储存直至使用。将经固定的组织通过自动组织处理器(MilesScientific Tissue Tek VIP 2000)处理并嵌入到石蜡块中。使用切片机(Leica BiocutModel 3011)将嵌入的组织切成7μm厚的切片，并安装在带正电荷的玻璃载片(类型)上。脱蜡之后，对组织进行针对多种生物标志物的苏木精和伊红染色或免疫组织化学(IHC)处理。对于IHC的抗原修复使用柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)完成，并以10％功率微波处理15分钟。内源性过氧化物酶活性使用3％H₂O₂封闭20分钟，并将载片用5％宿主血清封闭1小时，之后与一抗在4℃下孵育过夜。使用了以下一抗：亲吻促动素(兔-抗亲吻促动素1∶250，AB9754-Millipore-Sigma)、DDX4/MVH(兔-抗DDX4/MVH 1∶2,000，AB13840 Abcam)、LHβ(兔-抗LHβ 1∶100，国家激素和肽计划(National Hormone&Peptide Program))、StAR(兔-抗StAR 1∶2,000，SC-25806 Santa Cruz)、GH(兔-抗GH 1∶100，国家激素和肽计划)、Cypl7A1(兔-抗牛Cyp17A1 1∶5,000，由UC Davis的Dr.Alan Conley惠赠)。过氧化物酶偶联的驴或山羊抗兔二抗以1∶200的浓度使用，并使用DAB试剂盒(VectorLabs)进行检测。如先前所述(10.21769/BioProtoc.2915)地完成整体乳腺制备和分析。使用用DAB色原(二氨基联苯胺)染色并用苏木精复染的原位凋亡检测试剂盒S7100(Millipore)根据制造商的说明进行凋亡测定。

血液生物化学。通过心脏穿刺收集血液并立即分成两个样品：(a)对于全血细胞计数(complete blood count，CBC)，将血液与EDTA在血液管(hematological tube)(BDMicrotainer 365967)中混合，并在4℃下储存，之后在24小时内分析。(b)对于血清生化谱，将血液以2000×g离心10分钟；然后收集分离的血清并保存在-20℃下直至分析。样品分析由伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校(University of Illinois at Urbana-Champaign)的兽医诊断实验室进行。

单细胞RNA测序。为了研究载剂和EB300之间下丘脑区域中的差异基因表达，从各组的两只大鼠中获得下丘脑，并将来自同一组的单细胞悬液合并以进行单细胞RNA测序(scRNAseq)。在安乐死之后使用M199培养基通过灌注去除血液。大脑被快速解剖并转移至含有10％FBS的冰冷M199培养基中。使用弯的细钳解剖下丘脑区域。使用神经组织分离试剂盒-产后神经元(Miltenyi Biotec Inc.，Auburn，CA)根据制造商的说明将下丘脑组织分离成单细胞。台盼蓝排除法确定了所有样品中的存活率＞85％。使用40μm过滤器过滤细胞悬液，并使分离的细胞沉淀并重悬于含有1％牛血清白蛋白(bovine serum albumin)(BSA；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的PBS中。根据制造商的方案，将每种样品的细胞悬液(约3000个细胞)加载到10×Chromium仪器(10X Genomics，Pleasanton，CA)上。使用Chromium单细胞3′v2试剂盒(10X Genomics)根据制造商的方案制备单细胞RNA-Seq文库。初始步骤执行乳化，其中独立的细胞与包被有带有10×细胞条码的独特引物、独特分子标识符(unique molecular identifier，UMI)和聚(dT)序列的凝胶珠一起被分离成液滴。进行逆转录反应以产生条码化的全长cDNA，随后使用恢复剂破坏乳液，并用DynaBeads MyOne硅烷珠(Thermo Fisher Scientific)清洗cDNA。使用带有96孔金样品块模块(Gold SampleBlock Module)的GeneAmp PCR系统9700(Applied Biosystems)扩增大量cDNA。扩增的cDNA产物用SPRI选择试剂盒(Beckman Coulter)清洗。使用来自Chromium单细胞3′v2试剂盒中的试剂按这些步骤构建索引测序文库：(1)片段化、末端修复和加A尾；(2)用SPRI选择进行尺寸选择；(3)衔接子连接；(4)用SPRI选择进行连接后清理；(5)样品索引PCR和用SPRI选择珠进行清理。使用用dsDNA HS(高灵敏度)测定试剂盒进行的Qubit荧光测定(Invitrogen)以及使用高灵敏度DNA芯片(Agilent Genomics)的Bioanalyzer Agilent2100，进行文库定量和质量评估。将索引文库等摩尔地合并并在Illumina HiSeq4000上进行测序。

scRNA-seq数据的分析。首先，使用Cell Ranger单细胞软件套件(v2.1.1)分析单细胞表达以进行质量控制、样品多路分解、条码处理和单细胞3’基因计数。使用具有默认参数的Cell Ranger套件将测序读段与UCSC rn6大鼠转录组比对。使用具有默认参数的cell-ranger聚合功能合并样品。分析了分别来自对照组和EB300组的总共3,634和3,339个单细胞。平均原始读段/细胞分别为45,201和48,751。中位数基因/细胞分别为1,496和1,429。使用cellrangerR试剂盒(v2.2.0)、Seurat(v2.0)和Monocle包(v2.8.0)在R(v3.5)中进行进一步分析。样品的基因-细胞-条码矩阵基于所检测到的基因数量/细胞进行对数转换和过滤(具有少于300个基因或多于5,000个基因/细胞的任何细胞都被过滤掉)，具有多于6％的线粒体UMI计数和多于50％的核糖体UMI计数的细胞也是如此。基于UMI计数的数量和线粒体基因的百分比进行基因表达的回归。仅包括在至少三个细胞中检测到的基因。然后将细胞进行比例调整至总共1e4个分子。总共保留了6,964个细胞用于统计分析。为了降低数据维度，基于基因表达和离差(表达截止值＝0，且离差截止值＝0.5)选择了2,505个可变基因。PCA在归一化的基因条码矩阵上运行。然后对前12个主成分进行对t-SNE的Barnes-hut近似，以在二维空间中使细胞可视化。前11个主成分用于使用肘图(Elbow Plot)方法进行的t-SNE投影和聚类分析。使用Seurat中的“FindClusters”功能以0.6的分辨率参数鉴定簇。这种基于图的聚类方法依赖于基于共享最近邻(shared nearest neighbor，SNN)模块化优化的聚类算法。通过使用MAST框架运行Seurat“FindAllMarkers”功能来鉴定独特的簇特异性基因。从tSNE中鉴定出总共17个簇，并且使用“FindMarkers”功能鉴定出每个簇中的五个标志物基因。tSNE图、直方图、散点图和小提琴图使用Seurat绘制。

统计学

使用统计软件(SPSS 22)进行总体数据分析。通过Shapiro-Wilk检验测试连续数据的正态分布。在确认方差齐性之后，用参数检验和Tukey’s HSD事后检验分析所有正态分布的连续数据。通过非参数检验(Kruskal Wallis ANOVA)分析所有非正态分布的连续数据。对有序数据进行了类似的分析。数据以图形表示为均值和均值的标准误差。对于所有分析，α值设置为0.05。为了从scRNAseq得出结论，通过使用MAST框架运行Seurat“FindAllMarkers”功能来鉴定独特的簇特异性基因。从tSNE中鉴定出总共17个簇；使用“FindMarkers”功能鉴定出每个簇中的前五个标志物基因。对照和EB300之间的差异基因表达通过Seurat中的默认“bimod”似然比检验进行测试(截止，p_val_adj＜0.05)。tSNE图、直方图、散点图和小提琴图使用Seurat绘制。

结果

通过eSpay向新生大鼠受控递送17β-雌二醇3-苯甲酸酯不可逆地抑制雄性和雌性二者中的下丘脑亲吻促动素表达和生殖细胞发育。

eSpay(或作为替代地称为EB300)的制造。

包含17β-雌二醇3-苯甲酸酯(EB，Sigma E8515)的硅酮胶囊剂用作将血液17β-雌二醇(E2)浓度提高至超生理水平的装置。一旦皮下植入，具有EB的硅酮胶囊剂(称为eSpay)释放EB持续延长的时间段。选择EB而不是E2是因为E2被肝代谢迅速去除，而EB缓慢水解为E2，提供持续的高血液E2水平，持续约三周的延长时间段。大量研究之后，确定了皮下植入300μg的EB将有效诱导不育。因此，包含300μgEB的EB(在本文中为EB300)通过将300μg EB溶解于5μl芝麻油(Sigma S3547)中来制备，并将其插入硅酮管(Dow Corning 508-005)中，其随后用硅酮密封剂(Factor II，Inc.医用黏合剂A-100)密封。将胶囊剂保持在室温下直至使用。EB300胶囊剂长约8mm且直径为约2.16mm。通过施加聚维酮碘溶液对植入部位的皮肤(肩之间的背上)进行消毒。用无菌手术剪在皮肤上切出2mm长的横向切口。通过插入钝头钳的尖端在皮肤和肌肉层之间形成包。将胶囊剂插入到袋中并向侧面推，使得其远离切口朝向，将切口通过施加手术黏合剂密封。

在出生当天(出生后第0天，PND 0)植入EB300胶囊剂之后，测试了EB300胶囊剂作为在其接受者中提高E2水平的装置的效力。在PND 1、2、3、4、7、10、21和30时收集血清和下丘脑，并测量E2浓度。血清E2浓度升高并维持在稳定水平持续10天(图1A至B)并随时间逐渐降低，但在经EB处理的组中直至PND 30其仍维持在比未经处理的对照组略高的水平(图1A)。从下丘脑测量的E2(按1mg组织体积等于1mL计算)显示出类似的升高模式，但浓度比在血清中的高100倍，并且随后到PND 4时急剧下降，并到PND 7时恢复到接近基础水平(图1B)。在雄性和雌性中观察到相同的激素谱模式(图2A至B)。这些结果表明EB300植入剂在循环血液中诱导持续的高水平E2，持续长达约30天。此外，前4天下丘脑E2水平相对于血清水平的选择性升高以及随后当血清E2水平仍然高时下丘脑E2水平的急剧下降表明，下丘脑可具有暂时积累和去除E2的独特的调节系统。

EB300植入剂对下丘脑亲吻促动素表达的影响。

雄性和雌性二者中，在2.5月龄时的成年早期，新生儿暴露于雌激素显著降低了弓状核(ARC)亲吻促动素免疫反应性(图3A)，并且类似地，在EB300组中在6至7月龄时观察到较低的免疫反应性(图3B)。总体上，在年轻大鼠和年长大鼠二者中，雄性的亲吻促动素免疫反应性低于雌性，但EB降低了在两种性别中的亲吻促动素(KISS，Kiss1基因的蛋白质产物)免疫反应性。该结果表明新生儿中的EB300植入剂降低了KISS表达，并且该作用持续了较长时间。随着大鼠到2月龄时达到初情期，并且KISS是建立生育力的关键主要激素，降低的KISS影响接受EB300植入剂的大鼠的生育力。

EB300植入剂对下丘脑基因表达的影响。图4A至K描绘了成年下丘脑，KISS1在AVPV和ARC区域中表达(图4A)。

KISS 1在AVPV和ARC区域中表达(图4A)。通过抗KISS1抗体、KISS1蛋白(图像中的白色点)在ARC区域中检查KISS1表达(在图4A中，组织切片的平面被标记为红色虚线)。与未经处理的(对照)组相比，EB300下丘脑中的KISS1表达明显降低(图4B)。为了定量比较对照和EB300组之间的KISS1表达，解剖下丘脑区域(包括AVPV和ARC区域)，并通过单细胞RNA测序(scRNAseq)进行检查(图4C)。在雌性中，从分别来自对照组和EB300组的总共4,049个和4,223个细胞(图4E)中鉴定出10种不同的细胞类型(细胞簇)(图4D)。从下丘脑细胞簇中，鉴定出Kiss1表达簇(簇-9)(图4F)，并在对照组和EB300组之间比较Kiss1表达细胞的数量和Kiss1的表达水平。在簇-9中，在对照组和EB300组中分别发现了307个和194个细胞。从各组分别鉴定出68个和30个Kiss1阳性细胞。该结果表明，与对照组相比，在EB300下丘脑中，簇-9和Kiss1表达细胞的总细胞数二者均降低(图4G)。在雄性中，鉴定出十个不同的簇(图4H)，其中在对照组和EB300组中分别检查了总共4,674个和4,229个细胞(图4I)。从下丘脑细胞簇中，鉴定出Kiss1表达簇(簇-8)(图4J)。在对照组和EB300组之间比较Kiss1表达细胞的数量和Kiss1的表达水平。在簇-8中，在对照组和EB300组中分别发现了178个和83个细胞。从各组分别鉴定出65个和37个Kiss1阳性细胞。该发现表明，与对照组相比，在EB300下丘脑中，簇-8和Kiss1表达细胞的总细胞数降低(图4K)。总之，这些结果表明，对新生雌性和雄性大鼠进行EB处理降低了下丘脑中KISS1细胞的数量，并从而降低了KISS1蛋白表达。

对垂体的影响

对雄性和雌性垂体进行组织病理学分析以观察在注射EB300之后垂体是否经历了变化(图5)。通过H&E染色通过组织学对从对照组和EB300组获得的垂体的石蜡切片进行检查，发现组之间没有组织学差异。LHβ(黄体生成素β亚基)和GH(生长激素)的免疫组织化学未发现对照组和经EB处理的组之间LH和GH表达的差异(图5)。这些结果表明EB植入剂的作用可能不影响生长激素分泌或LH激素分泌。

KISS-10注射之后的LH分泌。

当KISS从亲吻促动素神经元分泌时，KISS与其位于GnRH神经元上的同源受体KISS1R结合，并刺激GnRH分泌，这进而刺激来自垂体促性腺激素细胞的LH分泌。为了确定在植入有EB300的动物中GnRH神经元和促性腺激素细胞是否保留其反应性和功能性，在2.5月龄动物中在注射亲吻促动素-10(KISS-10；KISS的10个氨基酸长的类似物)之前和之后测量血清LH浓度(图6)。在KISS-10注射之前，经EB处理的雄性和雌性中的血清LH基础水平较低。然而，在对照和经EB处理的雄性和雌性中观察到对KISS-10的稳健应答(图6)。这一发现表明EB300植入剂不改变GnRH神经元或垂体促性腺激素细胞的发育和功能，表明EB300的生物学影响的特异性。

EB300对性腺的影响。

为了确定新生儿雌二醇暴露是否影响雄性的性腺发育，在PND 1、3和10时收集睾丸，并将生精小管、睾丸网和睾丸间质用H&E染色并经显微镜检查。在对照大鼠和EB大鼠之间未检测到明显的组织病理学差异(图7A)。然而，当进行TUNEL染色(其检测经历程序性细胞死亡的细胞)时，来自EB300组的许多生殖细胞在PND 3和10日龄时显示出阳性信号(图7B)，表明EB300植入剂诱导睾丸中的生殖细胞死亡。这一发现得到了相同组织中DDX4(生殖细胞标志物)染色降低的支持(图7C)。然而，在雌性中，卵巢、输卵管或子宫中的TUNEL染色未发现对照组和EB300组之间有任何显著差异(图8B)。然而，在PND 10时，在EB300大鼠的卵巢中，许多生殖细胞聚集在一起，而没有经历生殖细胞孢囊破裂。当对照组的卵母细胞被分离为单一的原始卵泡时，随后对DDX4和FOXL2(颗粒细胞标志物)的免疫染色确认了EB300组中的这一现象(图8C)。该结果与之前的报道一致，即E2抑制新生儿卵巢中的生殖细胞巢破裂(PMID：17446182)。总之，这些结果表明EB300植入剂可直接影响性腺发育。

在初情期前大鼠中单次植入EB300诱导雄性和雌性的完全不育。

生直力。

为了确定对亲吻促动素神经元和性腺的影响是否会导致不育，将经过验证的繁殖者引入对照大鼠和EB300大鼠的笼中，与其一起饲养两周，并计数它们所生的胎仔和幼仔的数量。对照大鼠产生胎仔，经EB处理的大鼠不产生幼仔(表1)。

表1.生育力(雄性和雌性)

对雌性生殖器官的影响。

在雌性中，经EB300植入/处理的动物没有表现出如通过阴道细胞学所确定的任何发情周期迹象，并且其阴道口仍然狭窄和阻塞(表2)。EB300组的5.5月龄大鼠的卵巢和子宫的形态学和组织学检查分别比对照组的那些更小和更薄(图9和10)。经EB300处理的大鼠缺乏子宫中的腺体和卵巢中的黄体(图9和10)。年轻(2.5个月)和年长(7个月)的经EB300处理的大鼠的卵巢和子宫显示出类似的形态学和组织学模式(图10)，表明这些表型持续存在。然而，在垂体中，未观察到显著差异(图5)，表明EB300植入剂的器官特异性作用。

表2.发情周期模式

对雄性生殖器官的影响。

为了确定精子计数和活力是否受到新生儿EB300植入剂的影响，在5月龄时测量精子数量和质量。与对照组相比，经EB处理的组中的精子浓度(百万/mL)显著较低(p＝0.001)(图11)。在植入EB300的大鼠中活动精子百分比显著降低(p＝0.003)。另外，与对照大鼠相比，在经EB300处理的大鼠中，进行性活动精子的百分比显著降低(p＝0.02)，并且其具有显著更高百分比的不动精子(p＝0.01)(图11)。这些结果表明新生儿EB300植入剂影响精子浓度和质量，影响雄性生育力。

当在2.5月龄时检查时，与对照组相比，所有EB300组动物都具有显著更小的睾丸、附睾、精囊和前列腺(图12A)。来自EBx11和EB300组的附睾具有较小的小管直径并且含有很少或不含生殖细胞(图12A)。EB300动物中较低的StAR(类固醇生成细胞、间质细胞的标志物)和DDX4(生殖细胞标志物)表达以及较高数量的TUNEL阳性细胞表明EB300植入剂导致较低的睾酮合成能力、较低的精子产生和较高水平的凋亡(图12B)。在年长动物中对睾丸和附睾的类似影响非常明显(图13和14)。在对照动物和EB动物之间未观察到垂体的显著差异(图13和14)。当比较组织重量时，EB300组的睾丸、附睾和附属腺体比对照组轻(图15)。

雄性性行为主要依赖于睾酮，睾酮是所有脊椎动物物种中睾丸的间质细胞分泌的激素。为了评估经EB处理的大鼠的性行为，使4月龄的雄性与在发情期(雌性乐于接受雄性的生殖阶段)的雌性一起居住，允许雄性交配。记录并比较到首次交配所需的时间(潜伏期)和30分钟内的交配数量。与对照动物相比，经EB300处理的动物具有显著更长的潜伏期(p＝0.01)并进行了更少的交配尝试(p＝0.02)(图16)，表明EB植入剂显著降低了雄性的交配行为。

综上所述，这些生殖特征表明EB胶囊剂的新生儿植入显著抑制性腺和附属腺体发育、配子发生和性行为，导致雄性和雌性二者不育。

在雄性和雌性二者中，植入有包含苯甲酸雌二醇的硅酮胶囊剂(EB)的大鼠产生比对照显著更少的性腺性类固醇。

生殖系统的发育缺陷将不可避免地影响性类固醇激素的合成，因此检查了性类固醇的血液浓度。从2月龄和6月龄的雄性收集外周血并测量它们的血清激素水平。在2至3月龄时，经EB300处理的组的血清睾酮水平显著低于对照组(图17)。当在6至7月龄时测量睾酮浓度时也观察到相同的趋势(图17)。在雌性中，在年轻时的经EB300处理的组和对照组之间，血清E2水平没有显著差异。然而，经EB300处理的组的动物的E2水平显著低于对照组(图17)。在另一方面，无论年龄大小，在经EB300处理的组和对照组之间，雌性的睾酮水平没有差异。有趣的是，与雄性对照组相比，植入有EB300胶囊剂的雄性具有显著更高的E2浓度(图18)，这可由雄性性腺中提高的芳香化酶活性引起。在另一方面，由于有缺陷的睾丸发育和卵巢发育(图7至14)，分别预期了经EB处理的动物中，雄性中的低睾酮水平和成年雌性中的低E2水平。在经EB处理的动物中精囊和前列腺的发育缺陷以及低交配行为可由这些低睾酮水平引起，因为它们的发育依赖于睾酮。

具有EB300植入剂的动物不显示病理状况。

通常测量体重作为健康状况的指标。将经EB300处理的动物和对照动物从出生到180日龄时进行称重(图19)。在雄性中，经EBx11和经EB300处理的组的体重低于对照组中的体重。在180日龄时，经EB300处理的组的体重显著低于对照组的体重，但在其他实验组之间无显著差异(图19A)。在雌性中，经EB处理的大鼠比对照组大鼠的体重增加得更迅速。在180日龄时，所有经EB处理的组均显示出比对照组显著更高的体重(图19B)。

当大鼠达到6至7月龄时，使其安乐死，并比较器官长度/体重或器官重量/体重的比。在雄性中，对照组和EB300组之间的股骨长度/体重无差异(图20)。与对照组相比，EB300组的脑/体重和垂体/体重的比更高，而EB300组的肾/体重比更低。在雄性中，对照组和EB300组之间的肝、脾和心脏的重量基本上保持相同(图20)。在雌性中，EB300组在EB300组的所有器官中显示出器官/体重比降低(图21)。然而，这些差异可由对体重增长的影响引起；EB300雌性比对照显著更重(约20％)(图21)。作为支持，在任何组中对肾和肝的组织学检查均未发现病理学状况(图22)。血液化学还显示出肾和肝中无病理学状况(数据未显示)。对整体乳腺的卡诺氏染色(Camoy’s staining)显示出EB300组中乳腺的正常分支。然而，在EB300组中，末端芽的收缩/发育不全是明显的。认为EB300组中的低出芽是由低E2水平引起的(图23)。

为了研究EB注射对造血、血细胞、红细胞(red bold cell，RBC)、血红蛋白、血小板和血红蛋白量/红细胞(MCH)，对平均微粒血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobinconcentration，MCHC)和白细胞(white blood cell，WBC)进行计数(表3)。在雄性和雌性二者中，RBC、血小板和WBC计数与对照组无差异，血红蛋白浓度、MCH和MCHC也无差异。总之，整体组织学和血液学数据表明，造血不受EB植入剂的影响。

EB300具有更宽的有效时间窗口。

了解了在PND 1时植入EB300诱导了完全且不可逆的不育，然后测试当在稍后时间点植入胶囊剂时是否诱导了不育。在PND 1、5、12和21时植入EB300。出乎意料地，在这些不同时间的所有植入都有效地抑制了雄性中的性腺发育，如通过睾丸尺寸和睾丸组织学连同使用针对Cyp17(间质细胞标志物)的抗体、DDX4和TUNEL染色的免疫组织化学所确定的(图24)。精囊和前列腺也显著更小(图25)。在雌性中，卵巢较小且未发现黄体，表明没有排卵(图26)。总之，EB300在雄性和雌性二者中在诱导不育方面具有宽的有效时间窗口。

EB100和EB30也有效诱导不育。

下面显示的数据表明EB30(30μg的EB)在使雄性和雌性动物(大鼠；在PND 1或2时植入EB)不育方面是有效的。

EB有效诱导仓鼠不育。

确定了EB125植入剂对仓鼠性腺发育的影响。向21日龄的仓鼠植入空胶囊剂(对照)或包含在硅橡胶胶囊剂中的125微克EB。从PND 30时的对象收集生殖组织。来自植入有EB125的仓鼠的睾丸比对照动物的睾丸显著更小。

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