阅读说明：本技术 遗传工程化造血干细胞及其用途 (Genetically engineered hematopoietic stem cells and uses thereof ) 是由 J.博伦 A.F.拉多维奇-莫雷诺 J.利迪尔德 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：具有一种或多种遗传编辑的谱系特异性细胞表面蛋白基因的遗传工程化造血细胞如造血干细胞及其单独或与靶向谱系特异性细胞表面蛋白的免疫疗法组合的治疗用途。(Genetically engineered hematopoietic cells, such as hematopoietic stem cells, having one or more genetically edited lineage-specific cell surface protein genes and their therapeutic use alone or in combination with immunotherapy targeting lineage-specific cell surface proteins.)

具体实施方式

应解释为仅是说明性的，而不以任何方式限制本公开的剩余部分。本文引用的所有出版物出于本文引用的目的或主题通过引用并入。

实施例1：经由CRISPR/Cas9介导的基因编辑缺失CD19的外显子2和表达外显子2缺失的CD19的细胞的表征

本实施例报道了在细胞中经由CRISPR/Cas9遗传工程化改造CD19基因，以产生表达突变的CD19的经编辑的细胞，其中缺失了外显子2编码的片段(CD19ex2)，并在体外和体内表征了该经编辑的细胞。同样参见上述关于示例性外显子2缺失的CD19基因产物的公开内容。

材料和方法

sgRNA构建体的设计

通过手动检查紧邻靶区域的SpCas9 PAM(5'-NGG-3')设计所有sgRNA，并通过在线搜索算法(Benchench，Doench et al，2016；Hsuet al，2013)使人类基因组中潜在的脱靶位点最小化，从而根据预测的特异性确定优先级。所有设计的合成sgRNA均购自Synthego，其中5'和3'端的三个末端位点处均具有经化学修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸包含2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯(缩写为“ms”)，并且ms-sgRNA是HPLC纯化的。Cas9蛋白购自Synthego(图5-8B)和Aldervon(图9A，9B，10A-10D，14A-14D，17、18A和18B)。

永生化人细胞系的细胞维持和电穿孔

K562人白血病细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并于37℃和5％CO2下维持在DMEM+10％FBS中。K562细胞使用Lonza Nucleofector(程序SF-220)和人P3细胞核转染试剂盒(VPA-1002，Lonza)通过电穿孔Cas9核糖核酸蛋白(RNP)来编辑。Raji-Fluc-GFP细胞购自Capital Biosciences，并于37℃和5％CO2下维持在RPMI+10％FBS+1％谷氨酰胺中。Raji-Fluc-GFP细胞使用Lonza Nucleofector(程序DS-104)和SG细胞系4D-NucleofectorX试剂盒S(V4XC-3032，Lonza)通过电穿孔RNP来编辑。Cas9RNP通过在即将电穿孔之前将蛋白与ms-sgRNA以1:9(20:180pmol)的摩尔比于25℃温育10分钟来制备。电穿孔后，将细胞在比色皿中温育10分钟，转移至1m L上述培养基中，并培养24-72小时用于下游分析。

在原代人CD34+HSC中进行编辑

源自动员外周血中的冷冻CD34+HSC购自AllCells，并根据制造商的说明书进行解冻。可从AllCells或Stemcell冷冻购买源自脐带血的冷冻CD34+HSC，并按照制造商的说明书进行解冻和维持。为了编辑HSC，在电穿孔RNP之前，将约1e6个HSC解冻并在补充有StemSpan CC110混合物(StemCell Technologies)的StemSpan SFEM培养基中培养24小时。为了电穿孔HSC，将1.5e5沉淀并重悬于20μL Lonza P3溶液中，并与10uL Cas9 RNP混合，如上所述。CD34+HSC使用Lonza Nucleofector 2(程序DU-100)和人P3细胞核转染试剂盒(VPA-1002，Lonza)进行电穿孔。

基因组DNA分析

对于所有基因组分析，使用Qiagen DNeasy试剂盒从细胞中收获DNA。对于T7E1测定，使用CRISPR切割位点侧翼的引物进行PCR。产物通过PCR纯化(Qiagen)进行纯化，并将200ng在热循环仪中变性和重新退火并用T7内切核酸酶I(New England Biolabs)根据制造商的方案消化。将经消化的DNA在1％琼脂糖凝胶中电泳，并在BioRad ChemiDoc成像仪上观测。使用Image Lab软件(Bio-Rad)分析条带强度，并使用以下公式计算等位基因修饰频率(插入/缺失)：100×(1–(1–切割分数)^0.5)。为了使用TIDE(通过分解追踪插入/缺失(Tracking of In/dels by Decomposition))分析等位基因修饰频率，使用两种PCR引物对纯化的PCR产物进行Sanger测序(Eton)，并使用在线TIDE软件(Deskgen)分析各序列色谱图。使用来自模拟转染(仅Cas9蛋白)样品的参考序列进行分析。将参数设置为10个核苷酸的默认的最大插入/缺失大小，并将分解窗口设置为覆盖具有高质量迹线的最大可能窗口。低于3.5％的检测灵敏度的所有TIDE分析均设置为0％。

为了确定双重ms-sgRNA的基因组缺失程度，使用CRISPR切割位点侧翼的引物进行终点PCR，该引物扩增804bp区域。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，并在BioRadChemiDoc成像仪上观察，以观测完整的亲本条带和预期的较小(400-600bp，取决于ms-sgRNA组合)缺失产物。条带强度使用Image Lab软件(Bio-Rad)分析，并使用以下公式计算缺失百分比：100×切割分数。凝胶条带用凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取，并通过PCR纯化(Qiagen)进一步纯化以进行Sanger测序(Eton Bioscience)。

流式细胞术和FACS分析

如上所述用RNP核转染的Raji-fluc-GFP细胞在细胞培养物中维持48小时。用缀合有PE的CD19抗体(IM1285U；Beckman Coulter)对活细胞进行染色，并通过CD19的表达用BDFACS Aria进行分选分析。CD34+HSC使用抗CD33抗体(P67.7)进行CD33染色，并用AttuneNxT流式细胞仪(Life Technologies)通过流式细胞术分析。

CAR-T细胞的细胞毒性测定

CD19定向性CAR-T细胞(CART19)通过将表达CART19的慢病毒转导到健康人供体的CD4+和CD8+T细胞中产生。CART19构建体包含CD19识别域(源自FMC63单克隆抗体的单链可变片段)，源自CD28的共刺激域，以及CD3ζ域。通过基于流式细胞术的测定评估CART19的细胞毒性。用CellTrace Violet染料染色的Raji-fluc-GFP细胞用作靶细胞。未用CART19构建体转导的T细胞用作细胞毒性测定的阴性对照。在基于CTS OpTmizer的无血清培养基中以所示E/T比(10:1、3:1、0:1)共培养效应细胞(E)和肿瘤靶细胞(T)，其中1×10⁴个靶细胞，总体积为200μl/孔。温育20小时后，对细胞进行碘化丙啶染色并通过Attune NxT流式细胞仪(Life Technologies)进行分析。将活靶细胞以碘化丙啶阴性和CellTrace Violet阳性门控。细胞毒性按以下计算：(1-(CART19组的活靶细胞分数)/(阴性对照组中的活靶细胞分数))×100％。

体内植入实验

对于CD19体内植入实验，将细胞植入NOD scid gamma小鼠(NSG^TM小鼠；TheJackson Laboratory)。对于CD33体内植入实验，将细胞植入NSG-SGM3小鼠(The JacksonLaboratory)。

体外CFU测定

将1500个分选的CD34+HSPC接种在35mm细胞培养皿的1.5ml甲基纤维素(MethoCult^TM H4034 Optimum，Stem Cell Technologies)中，并于37℃下5％CO2培养箱中培养两周。然后对集落进行计数和根据形态外观评分。

结果

(i)gRNA的选择

如图4所示，靶向CD19的外显子2以进行CRISPR/Cas9介导的基因组缺失。一对sgRNA(一个sgRNA靶向内含子1和一个sgRNA靶向内含子2)导致同时产生通过Cas9得到的DNA双链断裂(DSB)和包括CD19外显子2完全丧失的区域切除。经由非同源末端连接(NHEJ)通过内含子1和2的连接来修复切割位置远侧的末端。经修饰的CD19基因的转录导致在RNA剪接过程中经由外显子2跳跃表达缺失外显子2的CD19变体(“CD19外显子2缺失”)。

通过手动检查紧邻CD19外显子2的SpCas9 PAM(5'-NGG-3')设计靶向内含子1和2的一组sgRNA，并通过在线搜索算法(Benchench，Doench et al，2016；Hsu et al，2013)使人基因组中的中靶位点最大化并使潜在的脱靶位点最小化，从而根据预测的特异性确定优先级(表3)。也可靶向CD19的外显子4以进行CRISPR/Cas9介导的基因组缺失，例如使用sgRNA-23和sgRNA-24(表3)。对于每个示例性CD19 sgRNA，序列靶向CD19，Cas类型为SpCas9。

表3：CD19 sgRNA组

¹基于所示发表算法的中靶和脱靶预测。评分是100分制且是成功的预测。

对于基因编辑，如材料和方法所述修饰sgRNA。经修饰的sgRNA用“ms”前缀表示。在人白血病细胞系K562细胞中筛选靶向内含子1或2的CD19sgRNA，并通过T7E1测定法和TIDE分析进行分析(图5)。在评估的12种ms-sgRNA中，ms-sgRNA 1、3-9靶向内含子1，ms-sgRNA10靶向外显子2，并且ms-sgRNA 14-16靶向内含子2。由于使用当前的PCR引物组无法准确地区分经编辑和未编辑条带之间的大小变化，未对此样品计算ms-sgRNA-1的插入/缺失百分比。

使用ms-sgRNA对来缺失K562细胞中的CD19外显子2，并且使用基于PCR的测定法检测CRISPR/Cas9介导的CD19外显子2的基因组缺失(图6)。与靶向内含子2的ms-sgRNA(ms-sgRNA 14、15、16)组合筛选靶向内含子1的ms-sgRNA(ms-sgRNA 3、4、5、6、9)的组合活性，以产生基因组缺失。与较大的亲本条带(801bp)相比，跨越基因组缺失区的PCR显示较小的缺失PCR产物(400-560bp)。通过终点PCR定量编辑效率为缺失百分比(图6，图C)。

(ii)表达外显子2缺失的CD19的CD34+细胞的体外表征

在CD34+HSC中筛选靶向内含子1或2的CD19 sgRNA(图7和图9)。使用ms-gRNA对来缺失CD34+HSC中的CD19外显子2。与靶向内含子2的ms-sgRNA(ms-gRNA 14、15、16)组合筛选靶向内含子1的ms-sgRNA(ms-sgRNA 4、6、9)的组合活性，以产生基因组缺失(图8A和图8B)。与较大的亲本条带相比，跨越基因组缺失区域的PCR显示较小的缺失PCR产物。通过终点PCR定量编辑效率为缺失百分比。

使用其他ms-gRNA对来缺失CD34+HSC中的CD19外显子2。发现靶向内含子1的ms-sgRNA (ms-sgRNA 1，6，7)与靶向内含子2的ms-sgRNA(ms-gRNA14，15、16)组合的组合使用有效地产生外显子2的基因组缺失(图10A和图10B)。

跨越基因组缺失区的PCR显示与较大的亲本条带相比，较小的缺失PCR产物。结果显示，使用gRNA6/gRNA14对进行CRISPR编辑后，高效生成表达CD19ex2的HSC。图10C。体外CFU测定显示，CD19ex2 HSC不影响体外分化。图10D。对于CFU测定，将1500个分选的CD34+HSPC接种在35mm细胞培养皿的1.5ml甲基纤维素(MethoCultTM H4034 Optimum，Stem CellTechnologies)中，并在5％CO2培养箱中于37℃下培养两周。然后对集落进行计数和根据形态外观评分。

(iii)表达外显子2缺失的CD19的Raji B-细胞淋巴瘤细胞的表征

还在Raji B细胞淋巴瘤细胞HSC中筛选靶向内含子1或2的CD19 sgRNA。使用ms-gRNA对来缺失Raji B细胞淋巴瘤细胞中的CD19外显子2(CD19ex2)。与靶向内含子2的ms-sgRNA(ms-gRNA 14)结合使用靶向内含子1的ms-sgRNA(ms-sgRNA 6)的组合活性，以产生基因组缺失。图11A。跨越基因组缺失区的PCR显示与较大的亲本条带相比，较小的缺失PCR产物。ex2小缺失条带代表Cas9切割后替代DNA修复事件产生的产物。ex2小缺失序列编码具有外显子2编码的片段缺失的相同CD19突变体。通过终点PCR定量编辑效率为缺失百分比。图11B。

通过使用识别CD19的C末端的抗体的Western印迹和使用FMC63抗CD19抗体(识别外显子2编码的CD19区域)或多克隆抗CD19抗体的流式细胞术来分析表达外显子2缺失的CD19(CD19ex2)的克隆性淋巴瘤细胞的蛋白分析。通过使用识别全细胞裂解物CD19的C末端的抗体(#3574兔抗人CD19Pab，Cell Signaling Technology)的Western印迹或使用识别外显子2编码的CD19区域的FMC63抗CD19抗体(FMC63 R-PE小鼠抗人CD19 Mab，EMDMillipore)的流式细胞术来分析克隆性淋巴瘤细胞中外显子2缺失的CD19(CD19ex2)的表达水平。使用多克隆抗CD19抗体(#3574兔抗人CD19Pab，Cell Signaling Technology)通过细胞内染色和流式细胞术鉴定细胞内CD19。

如通过Western印迹所检测，在一个或两个染色体进行了编辑的Raji B细胞中观测到外显子2缺失的CD19的表达。图11C。类似地，还通过流式细胞术在Raji B细胞中检测外显子2缺失的CD19的表面表达和细胞内存在。图11D。

此外，分析了表达CD19外显子2的Raji B细胞的生长和存活力。人淋巴瘤细胞系Raji获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。Raji细胞在补充有10％热灭活的HyClone胎牛血清(GE Healthcare)的RPMI-1640培养基(ATCC)中培养。细胞存活力和活细胞数目通过自动细胞计数器Cellmoter(Nexcelom)测量。如图11E所示，表达CD19外显子2的细胞在增殖(左图)和存活力(右图)上未显示缺陷。

(iv)在人源化小鼠模型中植入CD19ex2造血干细胞(HSC)

图12A提供了产生表达CD19ex2的HSC并表征人源化小鼠模型(如，NSG小鼠)中HSC的体内分化的示例性流程图。在一些实例中，可在HSPC植入后14周进行CAR-T疗法。可将NSG小鼠分为以下表4所示的四组：

表4体内表征组

使用靶向内含子1的ms-sgRNA(ms-sgRNA 6)和靶向内含子2的ms-sgRNAs(ms-gRNA14)的组合产生基因组缺失以产生表达CD19ex2的CD34+HSC细胞，如上所述的。另请参见材料和方法。将样品分为两部分：在体外对2％的细胞进行表征，然后将其余部分移植至6-8周龄的NOD scid gamma小鼠(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG^TM小鼠，人源化小鼠模型，The Jackson Laboratory)。如上所述，体外部分通过集落形成单位(CFU)测定和基因型分型来表征。

向经辐射的NSG^TM小鼠施用体内部分。可在不同时间点(如，4周、8周、12周)从小鼠获得血液样品，通过基因型分型分析并评估人CD45+细胞百分比。16周时，将小鼠处死，并收集外周血、骨髓和脾脏进行分析。主要终点是移植百分比，其可通过基因型分型和流式细胞术分析(如，小鼠相比人CD45，CD20/CD19，缺乏外显子2的CD19、Cd34、CD33、CD3)评估。次要终点可以是通过Western印迹法和/或qRT-PCR检测的缺乏外显子2的CD19的表达。

通过流式细胞术确定从HSC处理的小鼠收集的外周血中hCD45+细胞百分比，结果在图12B中提供。经编辑的表达CD19ex2的HSC在NSG小鼠中第4、9和12周显示有效移植，其水平与对照HSC细胞基本相同。

在输注RNP HSC或CD19ex2 HSC后第9周，测量从NSG小鼠收集的外周血中CD45+/CD20+细胞(代表分化的B细胞)的水平。如图12C所示，9和12周时，经编辑的细胞(CD19ex2HSC)显示比未编经辑的细胞(RNP HSC)明显更高的B细胞分化水平。

(v)体内Raji肿瘤模型

可将体内Raji肿瘤模型用于测定本文所述的任何治疗方法的功效。如材料和方法所述，离体产生表达缺乏外显子2的内源性CD19(CD19外显子2缺失)的Raji-fluc-GFP细胞。富集经编辑的细胞后，将样品分为两部分：一部分在体外进行表征，其余部分异种移植至6-8周龄的NSG小鼠中(图13)。

如材料和方法所述，体外部分通过细胞毒性和分子测定来表征。在伯基特淋巴瘤小鼠模型中评估体内部分的CART19的功效和选择性，并通过所示测定方法进行测定，如材料和方法所述。小鼠组示于表5中。简言之，注射表达缺乏外显子2的内源性CD19的Raji-fluc-GFP细胞后一周，向小鼠输注CART19细胞。通过体内成像系统(IVIS)在各个时间点(如，6天、12天、18天、35天)评估小鼠，以确定Raji细胞(CD19/CD19ex2)的丰度。还从小鼠获得血液样品以定量CART19细胞数目。

表5体内表征组

组	条件	CART19	#小鼠
				1	未处理对照	-	4
2	未处理对照	+	10
				3	Raji Fluc GFP；CD19+/+	-	10
4	Raji Fluc GFP；CD19+/+	+	10
				5	Raji Fluc GFP；CD19外显子2DEL	-	10
6	Raji Fluc GFP；CD19外显子2DEL	+	10

评估治疗功效的主要终点，例如通过存活、肿瘤负荷量和IVIS成像得到的肿瘤负荷来进行。例如，通过确定Raji-GFP细胞的持久性来评估治疗选择性的主要终点。CART19疗法的次要终点包括药代动力学和肿瘤浸润，CD19的次要终点包括缺乏外显子2的CD19表达。

预期CART19细胞杀死表达CD19外显子2的Raji细胞，而已进行了操作以缺失CD19外显子2的Raji细胞将存活并逃避CART杀伤。

(vi)缺少CD19外显子2的Raji-fluc-GFP细胞系的产生

用ms-sgRNA对转染Raji-fluc-GFP细胞系，并通过荧光激活细胞分选(FACS)分析CD19表达。基于相对CD19表达将细胞分为三个群：“hi”(高)，“int”(中等)和“lo”(低)(图14A)。包括亲代Raji细胞和仅用Cas9核转染的Raj-fluc-GFP作为对照。定量各条件下的活细胞百分比(图14B)。在各条件下，还跨越细胞的基因组缺失区域进行PCR，显示与较大的亲本条带相比，较小的缺失PCR产物(图14C)。还通过各条件下的终点PCR测定总体群中CD19外显子2的百分比(图14D)，这表明在CD19“int”和CD19“lo”细胞群中具有CD19外显2缺失的细胞百分比更高。

(vii)CART细胞毒性

如材料和方法所述，产生CD19定向性CAR-T细胞(CART19)，并与Raji-fluc-GFP细胞一起温育。温育20小时后，通过流式细胞术评估细胞毒性。图15A和图15B显示与CD19“hi”群相比，CD19“低”Raji细胞的特异性裂解减少。

如图14A至图14D所示，Raji“hi”群是基因型混合的细胞群。可富集单细胞以分析克隆群以及未经编辑的亲本群。对照CD19-hi群是混合基因型(20-40％CD19外显子2缺失)，并且用野生型对照群的情况下预期杀伤作用增强。

(viii)体内功效和选择性

图16概述了评估与经编辑的HSC配对的CART疗法的功效和选择性的综合体内模型。简言之，制备缺乏CD19外显子2(CD19ex2缺失)的HSC。向小鼠组施用对照(未编辑的)HSC或缺乏CD19外显子2的HSC。4周后，向小鼠施用Raji伯基特淋巴瘤细胞，1周后再施用CART19细胞。每周通过IVIS成像对小鼠进行评估，并且每4周获得血液样品。12周后，将小鼠处死，收集外周血、骨髓和脾脏进行分析。

实施例2：经由CRISPR/Cas9介导的基因编辑缺失CD33的外显子2并表征表达外显子2缺失的CD33的细胞

本实施例报道了在细胞中经由CRISPR/Cas9遗传工程化改造CD33基因，以产生表达突变的CD33的经编辑的细胞，其中外显子2编码的片段是缺失的(CD33ex2)，并使用以上实施例1所述或本领域已知的测定法对该经编辑的细胞进行体外和体内表征。同样参见以上关于示例性外显子2缺失的CD33基因产物的公开内容。

(i)选择gRNA

如图17所示，通过两个sgRNA将Cas9核酸酶靶向CD33的内含子1和2。通过Cas9的DNA双链断裂(DSB)的同时产生导致区域的切除，包括外显子2完全丧失。经由非同源末端连接(NHEJ)，通过内含子1和2的连接修复切割位点远端的末端，其中三角形指示修复的接合。经修饰的基因组的转录导致CD33m同等型的表达。

通过手动检查紧邻CD33外显子2的SpCas9 PAM(5'-NGG-3')设计一组ms-sgRNA，并通过在线搜索算法(Benchling,Doench et al(2016)；Hsu et al(2013))使人基因组中潜在的脱靶位点最小化，从而根据预测的特异性确定优先级(表6)。然后根据体外基因编辑效率选择靶向内含子1或2的ms-sgRNA的子集。各个gRNA靶向人CD33，并且使用Cas9型SpCas9。

表6：CD33 sgRNA组

¹基于所示发表算法的中靶和脱靶预测。评分为百分制，并且是成功的预测。

通过TIDE测定法在原代CD34⁺HSC中筛选靶向内含子1或2的CD33ms-sgRNA(图17A和图17B)。

使用ms-gRNA对，在CD34+HSC中测试(图18B和图18C；图27)。使用靶向外显子2和3的对照sgRNA(分别为Sg和811)观测到外显子2和3的有效缺失，导致CD33敲除。用靶向内含子1和2的sgRNA对(如，sgRNA 17和23；sgRNA 17和24)观测到含有外显子2的CD33的减少。

图19A示出显示CD34+HSC的流式细胞术的结果，其中CD34+HSC未编辑(左图，模拟)，或对于KO用向导RNA编辑(产生完整CD33敲除(中间图)，或用向导RNA18和24编辑，导致表达具有外显子2编码片段缺失的突变的CD33(CD33ex2，右图)。图19B显示编辑效率，如从图19A中所示的流式细胞术分析确定的。CD34+CD33ex2事件的百分比通过使用含有外显子2(以黑色显示)侧翼的引物的缺失PCR确定。

(ii)双重gRNA靶向的CD33ex2细胞的基因型分型和体外分化

由gRNA18和gRNA24对编辑的细胞以及CD33-KO CD34⁺HSC细胞的CFU测定表明这两种类型的细胞在体外都保留分化潜能。图20A。表达CD33ex2突变体的许多分化髓系细胞克隆的PCR基因型分型显示，gRNA18和gRNA24对产生外显子2缺失的CD33等位基因和CD33敲除等位基因的混合物。图19B和图20B。以下表7提供了基因型和频率。

表7分化的CD33ex2髓系细胞的基因型和频率

基因型	频率
		KO/KO	44/87
ex2/ex2	16/87
		ex2/KO	27/87

(iii)AML细胞系中CD33ex2的产生和表征

使用gRNA18和gRNA24对经由CRISPR/Cas9对AML细胞系THP1(单核细胞白血病)和HL-60(早幼粒细胞白血病)进行遗传编辑，以产生表达CD33ex2的细胞，其通过流式细胞术分选。扩增单细胞以建立表达CD33ex2的克隆，对所述克隆进行吉妥单抗-奥佐米星处理，如下所公开。基因组PCR显示，CD33外显子2在一个CD33等位基因或两个等位基因中均缺失。图21A。图21B示出用于检测包括全长(M)和外显子2缺失(m)的总CD33的PCR引物对和仅用于检测CD33m的PCR引物对。一个克隆在外显子1区域中显示部分缺失。通过RNA分析对全长CD33转录物和CD33ex2转录物的水平进行分析，结果示于图21C。通过PCR和测序分析进行更深的基因组表征显示内含子1和内含子2的可再现的修复连接。根据IDEL的类型，修复连接导致产生CD33ex2或完整CD33 KO的转录物。例如，在某些情况下，插入/缺失延伸至外显子1，产生CD33 KO。

(iv)CD33ex2细胞对吉妥单抗-奥佐米星(GO)细胞毒性的敏感性较低

用吉妥单抗-奥佐米星处理表达CD33ex2的AML细胞克隆，并确定经处理的细胞的存活力。人AML细胞系THP-1和HL-60获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。THP-1细胞在补充有10％热灭活的HyClone胎牛血清(GE Healthcare)和0.05mM 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)的RPMI-1640培养基(ATCC)中培养。HL-60细胞在补充有20％热灭活的HyClone胎牛血清(GE Healthcare)的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM，Gibco)中培养。对于用AML细胞系的体外细胞毒性测定，将THP-1和HL-60细胞与GO在其完全培养基中温育72小时。使用0.1ng/mL至10μg/mL的渐增浓度的GO。将细胞以每孔2x10⁴个接种在96孔板中。根据制造商说明书，用Celltiter Glo(Promega)测量活细胞数目，并使用GloMax多板阅读器(Promega)测定发光。IC50定义为与无GO处理的细胞(对照组＝100％)相比，产生活细胞数目的50％减少所需的化合物浓度。为了测量细胞死亡，细胞在室温下在1x Annexin结合缓冲液(Invitrogen)中用Annexin V(Invitrogen)和DAPI(Biolegend)染色15分钟。用Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher Scientific)采集数据，并使用FlowJo软件(TreeStar)分析。

如图22A所示，与Jurkat细胞(IC₅₀902.7 ng/ml)相比，AML细胞系THP-1和HL-60对GO细胞毒性更敏感(IC₅₀分别为16.3ng/ml和35.5ng/ml)。与未编辑的亲本细胞相比，表达CD33ex2的经编辑的AML细胞显示更低的对GO细胞毒性的敏感性。图22B。

在表达CD33ex2的经编辑的HSPC细胞中观测到相似的结果。在一项研究中，发现野生型HSPC的IC₅₀值约为93.4ng/ml，并且发现HSPC CD33KO和HSPC CD33ex2的IC₅₀值分别约为248.1ng/ml和246.4ng/ml。

用GO处理野生型HSC细胞(CD33+)、CD33 KO HSC和CD33ex2 HSC，并在撤回GO处理后将存活的细胞在髓样培养基中培养30天。如上所述确定存活细胞的存活力。令人惊讶地，与野生型和CD33 KO HSC细胞相比，GO处理后CD33ex2 HSC显示出高得多的存活力。图22C。

(v)保护CD33ex2细胞免受CART33介导的杀伤

通过将表达CART33的慢病毒转导至健康人供体的CD4+和CD8+T细胞产生CD33定向性CAR-T细胞(CART33或CAR1)。CART33构建体包含识别外显子2编码的CD33片段的单链可变片段(scFv)，CD8α的铰链域，CD8的跨膜域，4-1BB的共刺激域和CD3ζ的胞质信号传导域。

通过基于流式细胞术的测定评估CART33的细胞毒性。Raji(CD33-)细胞用作细胞毒性测定的阴性对照。在基于CTS OpTmizer的无血清培养基中以所示E/T比(5：1和1：1)共培养效应细胞(E)和肿瘤靶细胞(T)，其中总体积为200μl/孔，1×10⁴个靶细胞。温育20小时后，对细胞进行碘化丙啶染色并通过Attune NxT流式细胞仪(Life Technologies)分析。将活靶细胞以碘化丙啶阴性和CellTrace Violet阳性门控。细胞毒性按以下计算：(1-(CART19组的活靶细胞分数)/(阴性对照组中的活靶细胞分数))×100％。

在CD33+HL-60细胞中观测到高水平的细胞裂解(图23A)，并且在HL-60细胞中CD33ex2突变体的表达显著降低细胞裂解水平(图23B)，类似于具有CD33敲除的HL-60细胞(图23C)。比较结果在图23D中提供。

实施例3：有效的多重基因组编辑

按照常规方法或本文所述方法，在NALM-6细胞或HSC中对HSC细胞的CD19和CD33基因进行有效的双重基因组编辑。以下表8提供了靶向CD19的外显子2和CD33的外显子3的gRNA。

表8双重编辑CD19和CD33的向导RNA

从大量经编辑的细胞中分离基因组DNA，并进行TIDE测定以检测NALM-6、HL-60细胞和HSC中的基因组编辑。结果描述在图24A-24D中。从这项研究中获得的结果表明，约70％的HSC包含CD19基因的两个基因座中的突变，约80％的HSC包含CD33基因的两个基因座中的突变，表明至少50％的双重编辑的细胞在至少一个染色体上具有经编辑的CD19基因和经编辑的CD33基因两者。HL-60细胞和Nalm-6细胞中观测到相似水平的编辑细胞。

实施例4：编辑多个基因座对存活力的影响

评估NALM-6、HL-60细胞和HSC在多个基因座处的基因组编辑对细胞存活力的影响。核转染前2天，将HSPC解冻，或者传代Nalm-6或HL-60细胞。24和48小时(核转染当天)时，对细胞计数并评估细胞存活力。用CD33_gRNA-37RNP和CD19_gRNA-19复合物核转染并根据本文所述的材料和方法进行。在所示时间点对细胞计数并评估细胞存活力。结果描绘在图25A-25C中，并且表明双重Cas9/gRNA递送不损害细胞系中的存活力。在HSC中未观测到单向导RNA的额外毒性。

实施例5：个别向导的表现

在HL-60细胞中评估单个向导RNA CD33 sgRNA-18和CD33 sgRNA-24的基因组编辑效率。从大量经编辑的细胞中分离基因组DNA，并进行TIDE分析以检测基因组编辑。结果示于表9。

表9由gRNA 18和gRNA 24单独产生的插入/缺失百分比

CD33向导	HL60细胞中的插入/缺失
		3’-sg 18	94％
5’-sg-24	46％

实施例6：血液系统疾病的治疗

下面提供了使用本文所述的方法、细胞和试剂治疗急性髓系白血病的示例性治疗方案。

1)鉴定患有AML的患者，该患者是接受造血细胞移植(HCT)的候选者；

2)使用标准方法和技术，鉴定具有匹配HLA单倍型的HCT供体；

3)从供体中提取骨髓；

4)离体遗传操作供体骨髓细胞。简言之，引入谱系特异性细胞表面抗原表位的靶定修饰(缺失，取代)。通常，表位通常应为至少3个氨基酸(如，约6-10个氨基酸)。供体骨髓细胞上的靶定谱系特异性细胞表面抗原的此表位的遗传修饰不应实质上影响蛋白的功能，因此，不应实质上影响骨髓细胞的功能，包括它们成功植入患者内并介导移植物抗肿瘤(GVT)作用的能力。

任选的骤5-7：

在一些实施方案中，可在本文所述的示例性治疗方法中进行(一次或多次)以下提供的步骤5-7：

5)使用标准技术对AML患者进行预调节，例如输注化学治疗剂(如，依托泊苷，环磷酰胺)和/或辐照；

6)向AML患者施用工程化供体骨髓，以允许成功移植；

7)接着用细胞毒性剂，例如表达嵌合受体的免疫细胞(如，CAR T细胞)或抗体-药物缀合物，其中与细胞毒性剂结合的表位与经修饰的表位相同，且不再存在于供体工程化骨髓移植物。因此，靶向疗法应特异性靶向谱系特异性细胞表面抗原的表位，而不同时消除不存在该表位的骨髓移植物。

可选的步骤8-10：

在一些实施方案中，步骤8-10可在如本文所述的示例性治疗方法中进行(一次或多次)：

8)施用细胞毒性剂，例如表达嵌合受体的免疫细胞(如，CAR T细胞)或靶向谱系特异性细胞表面抗原表位的抗体-药物缀合物。预期这种靶向疗法消除癌细胞以及患者的非癌细胞两者。

9)使用标准技术(如，输注化学治疗剂)对AML患者进行预调节。

10)向AML患者施用工程化供体骨髓，以允许成功移植。

第8-10步导致消除表达靶蛋白的患者癌细胞和正常细胞，而为正常细胞群补充对靶向疗法具有抗性的供体细胞。

实施例7：吉妥单抗-奥佐米星对工程化HSC的影响

如图28所示，在用包含Cas9和sgRNA的核糖核蛋白电穿孔之前，将源自动员外周血的冷冻CD34+HSPC解冻并培养72小时。在以下条件下对样品进行电穿孔：

i)模拟(仅Cas9)，

ii)KO sgRNA(CD33 sgRNA-37)，或

iii)外显子2缺失(双gRNA 18+24)。

使细胞恢复72小时，收集基因组DNA并通过gRNA靶区域的PCR进行分析。通过TIDE评估确定具有外显子2敲除的细胞百分比，并确定插入/缺失百分比。通过终点PCR测定具有外显子2缺失的群的分数。

通过流式细胞术评估CD33阳性细胞百分比，证实用gRNA-37编辑有效敲除CD33。图30。发现HSC中的编辑事件会导致各种插入/缺失序列，如图29所示例。

(i)具有CD33外显子2缺失的细胞对吉妥单抗-奥佐米星(GO)的敏感性

为了确定体外毒性，将细胞与GO在其培养基中温育，并随时间定量活细胞数目。如图31A和图31B所示，与表达全长CD33的细胞(模拟)相比，由CD33 sgRNA-37产生的CD33敲除细胞和由CD33 gRNA-18和gRNA-24对产生的CD33ex2 del细胞对GO处理具有更强的抗性。认为CD33KO细胞中观测到的50％编辑是分裂细胞中的充分保护。认为CD33ex2 del细胞存活力的最初下降对应于未编辑的细胞死亡。

(ii)CD33修饰细胞的富集

为了测定GO处理后CD33修饰细胞是否富集，用50％的标准Cas9/gRNA比率编辑CD34+HSPC。在GO处理之前和之后分析总体细胞群。如图31C所示，在GO处理之前，通过TIDE测定51％的gRNA-37修饰的细胞(KO)，通过缺失PCR测定15％的gRNA 19+24(ex2缺失)。GO处理后，CD33修饰的细胞至少富集了1.5倍，结果是KO细胞百分比增加至80％，外显子2缺失百分比增加至50％。该数据表明GO处理后CD33修饰的细胞富集。

(iii)CD34+HSPC的体外分化

在分化后的不同天数，GO处理之前和之后评估细胞群的髓样分化。如图31D和图31E所示，用CD33 sgRNA-37产生的CD33敲除细胞和用CD33gRNA-18和gRNA-24对产生的CD33ex2 del细胞显示分化标志物CD14的表达增加，而表达全长CD33的细胞(模拟)不分化。

实施例8：CD19中外显子2或外显子4缺失的产生

NALM6细胞系如下用所示的ms-sgRNA转染以修饰CD19基因座：

1)WT(野生型，未修饰)，

2)靶向内含子1和2的sgRNA 6+14，以产生CD19外显子2缺失蛋白，

3)靶向内含子1和2的sgRNA 7+16，以产生CD19的CD19外显子2缺失蛋白，

4)靶向内含子3和4的sgRNA 23+24，以产生CD19外显子4缺失蛋白，和

5)靶向外显子1的sgRNA 18，以形成CD19敲除。

克隆选择转染的细胞系，并通过荧光激活细胞分选术(FACS)分析CD19的表达。如本文所述，将用Cas9的核糖核蛋白和sgRNA核转染的NALM6细胞在细胞培养中维持48小时。

使用两种不同的抗体(一种识别由外显子4编码的Ig样C2型域，第二种识别CD19的C末端)，通过Western印迹评估来自细胞群的样品。表达全长或用所示(NT＝非靶向对照gRNA，WT＝野生型)gRNA修饰的那些的克隆性NALM6细胞的蛋白分析。为了确认gRNA核转染细胞中CD19的缺失以及CD19ex2缺失和CD19ex4缺失克隆中经修饰的CD19的缺失，使用识别CD19C末端的多克隆抗CD19抗体(#3574兔抗人CD19 Pab，Cell Signaling Technology)对裂解物进行印迹分析。用识别外显子4编码的表位的抗CD19抗体(OTI3B10，Origene)在细胞裂解物中进行Western印迹，以确认gRNA 23+24核转染细胞中外显子4的缺失。用C末端抗体的Western印迹证实CD19ex2缺失和CD19ex4缺失蛋白比全长CD19更小。图32A和图32B。

实施例9：对于两种细胞表面抗原编辑的细胞的产生和评估

结果

通过流式细胞术测量未编辑的MOLM-13细胞和THP-1细胞(均为人AML细胞系)中CD33、CD123和CLL1(CLEC12A)的细胞表面水平。MOLM-13细胞具有高水平的CD33和CD123，以及中-低水平的CLL1。HL-60细胞具有高水平的CD33和CLL1，以及低水平的CD123(图33)。

如本文所述，在MOLM-13细胞中使用gRNA和Cas9突变CD33和CD123，通过流式细胞术分选纯化CD33和CD123修饰的细胞，并测量CD33和CD123的细胞表面水平。野生型MOLM-13细胞中CD33和CD123水平是高的；CD33的编辑仅导致低的CD33水平；CD123的编辑仅导致低的CD123水平，而CD33和CD123两者的编辑均导致低的CD33和CD123水平(图34)。然后使用本文所述的体外细胞毒性测定法测试经编辑的细胞对CART效应细胞的抗性。在模拟CAR对照条件下(图35，最左边的一组柱)，所有四种细胞类型(野生型，CD33-/-，CD123-/-和CD33-/-CD123-/-)都经历了低水平的特异性杀伤。CD33CAR细胞有效杀伤野生型和CD123-/-细胞，而CD33-/-和CD33-/-CD123-/-细胞显示对CD33 CAR具有统计学上显著的抗性(图35，第二组柱)。CD123 CAR细胞有效杀伤野生型和CD33-/-细胞，而CD123-/-和CD33-/-CD123-/-细胞显示对CD123 CAR具有统计学上显著的抗性(图35，第三组柱)。CD33 CAR和CD123 CAR细胞的合并物有效杀伤野生型细胞、CD33-/-细胞和CD123-/-细胞，而CD33-/-CD123-/-细胞显示对CAR细胞合并物具有统计学上显著的抗性(图35，最右边的一组柱)。该实验表明，敲除两种抗原(CD33和CD123)可保护细胞抵抗靶向这两种抗原的CAR细胞。此外，经编辑的细胞群包含足够高比例的在两种抗原的两个等位基因处进行了编辑的细胞，并且具有足够低的细胞表面抗原的细胞表面水平，从而实现对两种类型的CAR细胞具有统计学上显著的抗性。

如本文所述，在HL-60中使用gRNA和Cas9突变CD33和CLL1，通过流式细胞术分选纯化CD33和CLL1修饰的细胞，并测量CD33和CLL1的细胞表面水平。野生型HL-60细胞中CD33和CLL1水平较高；CD33的编辑仅导致低的CD33水平；CLL1的编辑仅导致低的CLL1水平，而CD33和CLL1两者的编辑均导致低的CD33和CLL1水平(图36)。然后使用本文所述的体外细胞毒性测定法测试经编辑的细胞对CART效应细胞的抗性。在模拟CAR对照条件下(图37，最左边的一组柱)，所有四种细胞类型(野生型，CD33-/-，CLL1-/-和CD33-/-CLL1-/-)都经历了低水平的特异性杀伤。CD33 CAR细胞有效杀死野生型和CLL1-/-细胞，而CD33-/-和CD33-/-CLL1-/-细胞显示对CD33 CAR具有统计学上显著的抗性(图37，第二组柱)。CLL1 CAR细胞有效杀死野生型和CD33-/-细胞，而CLL1-/-和CD33-/-CLL1-/-细胞显示对CLL1 CAR具有统计学上显著的抗性(图37，第三组柱)。CD33 CAR和CLL1 CAR细胞的合并物有效杀伤野生型细胞、CD33-/-细胞和CLL1-/-细胞，而CD33-/-CLL1-/-细胞显示对CAR细胞的合并物具有统计学上显著的抗性(图37，最右边的一组柱)。该实验表明，敲除两种抗原(CD33和CLL1)保护细胞抵抗靶向这两种抗原的CAR细胞。此外，经编辑的细胞群包含足够高比例的在两种抗原的两个等位基因处进行了编辑的细胞，并且具有足够低的细胞表面抗原的细胞表面水平，从而实现对两种类型的CAR细胞具有统计学上显著的抗性。

如本文所述，使用TIDE分析定量人CD34+细胞中基因编辑的效率。在内源性CD33基因座处，单独靶向或与CD123或CLL1组合靶向CD33时，观测到约70-90％的编辑效率(图38，左图)。在内源性CD123基因座处，单独或与CD33或CLL1组合靶向CD123时，观测到约60％的编辑效率(图38，中间图)。在内源性CLL1基因座处，单独或与CD33或CD123组合靶向CLL1时，观测到约40-70％的编辑效率(图38，右图)。该实验表明，可在两个细胞表面抗原基因座处以高频率编辑人CD34+细胞。

如本文所述，通过集落形成测定法测量遗传编辑的人CD34+细胞的分化潜力。单独或全部成对组合对于CD33、CD123或CLL1编辑的细胞产生BFU-E集落，表明该细胞在此测定法中保留明显的分化潜能(图39A)。经编辑的细胞还产生CFU-G/M/GM集落，表明该细胞在该测定中保留了与未编辑的对照在统计学上不能区别的分化潜能(图39B)。经编辑的细胞还产生可检测的CFU-GEMM集落(图39C)。总之，分化测定表明在两个基因座处编辑的人CD34+细胞保留了分化为多种细胞类型的能力。

材料和方法

AML细胞系

人AML细胞系HL-60获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。HL-60细胞在补充有20％热灭活的HyClone胎牛血清(GE Healthcare)的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM，Gibco)中培养。人AML细胞系MOLM-13获自AddexBio Technologies。MOLM-13细胞在补充有10％热灭活的HyClone胎牛血清(GE Healthcare)的RPMI-1640培养基(ATCC)中培养。

向导RNA设计

通过手动检查紧邻靶区域的SpCas9 PAM(5'-NGG-3')设计所有sgRNA，并通过在线搜索算法(Benchench，Doench et al，2016；Hsu et al，2013)使人基因组中潜在的脱靶位点最小化，从而根据预测的特异性确定优先级。所有设计的合成sgRNA均购自Synthego，其中5'和3'端处三个末端位点均具有经化学修饰的核苷酸。经修饰的核苷酸包含2'-O-甲基-3'-硫代磷酸酯(缩写为“ms”)，并且ms-sgRNA是HPLC纯化的。Cas9蛋白购自Synthego。

AML细胞系电穿孔

Cas9蛋白和ms-sgRNA(以1:1的重量比)混合，并在室温下温育10分钟，然后进行电穿孔。使用带有程序THP-1和Opt-3的MaxCyte ATx电穿孔仪系统用Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)分别电穿孔MOLM-13和HL-60细胞。在流式细胞术分选之前于37℃下温育细胞5-7天。

人CD34+细胞培养和电穿孔

冷冻保存的人CD34+细胞购自Hemacare，并根据制造商说明书解冻。在补充有人细胞因子(Flt3、SCF和TPO，均购自Peprotech)的GMP SCGM培养基(CellGenix)中培养人CD34+细胞2天。使用Lonza 4D-Nucleofector和P3原代细胞试剂盒(程序CA-137)，用Cas9 RNP(1:1重量比的Cas9蛋白和ms-sgRNA)对CD34+细胞进行电穿孔。为了用双重ms-sgRNA进行电穿孔，加入等量的各ms-sgRNA。分析前于37℃下培养细胞。

基因组DNA分析

使用prepGEM DNA提取试剂盒(ZyGEM)，在电穿孔后2天从细胞中提取基因组DNA。通过PCR扩增感兴趣的基因组区域。PCR扩增子通过Sanger测序(Genewiz)分析，并使用万维网tide.deskgen.com获得的TIDE(通过分解来追踪插入/缺失)软件计算等位基因修饰频率。

体外集落形成单位(CFU)测定

电穿孔后两天，将500个CD34+细胞接种在6孔板的1.1mL甲基纤维素(MethoCultH4034 Optimum，Stem Cell Technologies)中，一式两份，并培养2周。然后使用StemVision(Stem Cell Technologies)对集落进行计数和评分。

流式细胞术分析和分选

针对人CD33(P67.6)，CD123(9F5)和CLL1(REA431)的荧光染料缀合抗体分别购自Biolegend，BD Biosciences和Miltenyi Biotec。所有抗体都用它们各自的同种型对照进行测试。通过在人TruStain FcX存在下于冰上温育细胞与特异性抗体30分钟来进行细胞表面染色。对于所有染色，通过DAPI(Biolegend)染色将死细胞排除在分析之外。采集所有样品，并使用Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher Scientific)和FlowJo软件(TreeStar)分析。

对于流式细胞术分选，将细胞用荧光染料缀合抗体染色，然后用Moflow Astrios细胞分选仪(Beckman Coulter)分选。

CAR构建体和慢病毒生产

除在CD33/CLL-1多重细胞毒性实验中使用的抗CD33 CAR-T外，还构建了靶向CD33、CD123和CLL-1的第二代CAR。各CAR由以下组成：细胞外scFv抗原结合域，使用CD8α信号肽，CD8α铰链和跨膜区域，4-1BB共刺激域，以及CD3ξ信号传导域。抗CD33 scFv序列获自克隆P67.6(Mylotarg)；抗CD123scFv序列来自克隆32716；以及CLL-1scFv序列来自克隆1075.7。抗CD33和抗CD123 CAR构建体使用重至轻定向的scFv，而抗CLL1 CAR构建体使用轻至重定向。重链和轻链通过(GGGS)3接头连接。将各个靶标的CAR cDNA序列亚克隆至pCDH-EF1α-MCS-T2A-GFP表达载体的多克隆位点，并按照制造商协议(System Biosciences)生成慢病毒。慢病毒可通过使用Lipofectamine3000(ThermoFisher)瞬时转染293TN细胞(System Biosciences)产生。通过将抗CD33 scFv的轻链和重链(克隆My96)，至CD8α铰链域，ICOS跨膜域，ICOS信号传导域，4-1BB信号传导域和CD3ξ信号传导域克隆入慢病毒质粒pHIV-Zsgreen来产生CAR构建体。

CAR转导和扩增

根据制造商方案(Stem Cell Technologies)，使用抗CD4和抗CD8微珠通过磁珠分离法从Leuko Pak(Stem Cell Technologies)中分离人原代T细胞。将纯化的CD4+和CD8+T细胞以1:1混合，并使用抗CD3/CD28偶联的Dynabeads(Thermo Fisher)以1:1的珠和细胞比激活。使用的T细胞培养基是补充有免疫细胞血清替代物，L-谷氨酰胺和GlutaMAX(均购自Thermo Fisher)和100IU/mL IL-2(Peprotech)的CTS Optimizer T细胞扩增培养基。活化后24小时在聚凝胺(Sigma)存在下通过旋转接种(spinoculation)进行T细胞转导。冷冻保存之前培养CAR-T细胞9天。在所有实验之前，将T细胞解冻并在37℃静置4-6小时。

基于流式细胞术的CAR-T细胞毒性测定

通过比较靶细胞的存活率相对于阴性对照细胞的存活率来测量靶细胞的细胞毒性。对于CD33/CD123多重细胞毒性测定，野生型和CRISPR/Cas9编辑的MOLM-13细胞用作靶细胞，而野生型和CRISPR/Cas9编辑的HL60细胞用作CD33/CLL-1多重细胞毒性测定的靶细胞。野生型Raji细胞系(ATCC)用作两个实验的阴性对照。按照制造商说明书，分别用CellTrace Violet(CTV)和CFSE(Thermo Fisher)对靶细胞和阴性对照细胞进行染色。染色后，将靶细胞和阴性对照细胞以1:1混合。

抗CD33、CD123或CLL1 CAR-T细胞用作效应T细胞。未转导的T细胞(模拟CAR-T)用作对照。对于CAR合并物组，将适当的CAR-T细胞以1:1混合。将效应T细胞与靶细胞/阴性对照细胞混合物以1:1的效应物与靶标比率共培养，一式二份。包括一组没有效应T细胞的单独靶细胞/阴性对照细胞混合物作为对照。在流式细胞术分析之前，将细胞在37℃下温育24小时。碘化丙啶(ThermoFisher)用作存活力染料。对于计算特异性细胞裂解，使用活的靶细胞与活的阴性对照细胞的分数(称为靶分数)。特异性细胞裂解计算为((无效应细胞的情况下的靶分数–有效应细胞的情况下的靶分数)/(无效应细胞情况下的靶分数))×100％。

其他实施方案

本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由发挥相同，等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是通用的一系列等同或相似特征的示例。

根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开内容的本质特征，并且在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对本公开内容进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求书之内。

等价方案

尽管已经在本文中描述和示出了几个本发明的实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于进行功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优点的多种其他手段和/或结构，并且认为此类变型和/或修改中的每一个在本文所述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易地理解，本文描述的所有参数，尺寸，材料和构造均是示例性的，并且实际参数，尺寸，材料和/或构造将取决于一个或多个使用本发明的教导的特定应用。本领域技术人员将认识到或仅通过常规实验能够确定本文所述的具体发明实施方案的许多等同方案。因此，应当理解，前述实施方案仅以示例的方式给出，并且在所附权利要求书及其等同方案的范围内，可以以不同于具体描述和要求保护的方式来实践本发明的实施方案。本公开内容的发明实施方案涉及本文所述的每个单独的特征，系统，制品，材料，试剂盒和/或方法。另外，若此类特征，系统，物品，材料，试剂盒和/或方法不是相互矛盾的，则两个或更多个此类特征，系统，物品，材料，试剂盒和/或方法的任意组合包括在本公开内容的发明范围内。

如本文所定义和使用的所有定义应当理解为控制字典定义，通过引用并入的文件中的定义和/或所定义术语的普通含义。

本文所公开的所有参考文献，专利和专利申请就其各自被引用的主题而言通过引用并入，在某些情况下，其可以涵盖整个文件。

除非明确相反地指出，否则本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为表示“至少一个/种”。

如在说明书和权利要求书中所使用的，短语“和/或”应理解为是指如此结合的元件中的“任一个或两者”，即在某些情况下联合存在而在其他情况下不联合存在的元件。用“和/或”列出的多个元件应以相同的方式解释，即，如此连接的元件中的“一个或多个”。除了由“和/或”字句明确鉴定的元件之外，还可以可选地存在其他元素，无论与那些明确鉴定的那些元素相关还是无关。因此，作为非限制性示例，在一个实施方案中，当与诸如“包括”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以引用仅A(可选地包括除B以外的元件)；在另一个实施方案中，仅引用B(可选地包括除A以外的元件)；在又一个实施方案中，引用A和B两者(可选地包括其他元件)；等等。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或“和/或”应解释为包含性的，即包含多个或一批元件中的至少一个，但也包括超过一个，以及(可选)其他未列出的物品。相反明确指出的仅仅术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或当在权利要求书中使用时，“由...组成”将指仅仅包括许多或一批元件的一个元件。一般而言，如本文中使用的术语“或”当前面有排他性术语，诸如“任一”、“之一”、“仅一个”、或“恰好一个”时仅应解释为指示排他性备选(即“一个或另一个而非两者”)。“基本上由……组成”当在权利要求书中使用时应具有其在专利法领域中所使用的普通含义。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，在提及一个或多个元素的列表时，短语“至少一个”应理解为是指从元件列表中的任何一个或多个元素中选择的至少一个元素，但不一定包括元素列表内具体列出的每个元素中的至少一个，并且不排除元件列表中元件的任何组合。此定义还允许除了短语“至少一个”所指代的元件列表中具体鉴定的元件之外的元件可以可选地存在，无论与那些明确鉴定的元件有关还是无关。因此，作为非限制性示例，在一个实施方案中，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地“A和/或B中的至少一个”)可以指可选包括超过一个A，不存在B(并且可选地包括除B以外的元件)；在另一个实施方案中，至少一个，可选地包括超过一个B，不存在A(并且可选地包括除A以外的元件)；在又一个实施方案中，至少一个，可选地包括超过一个A，以及至少一个，可选地包括超过一个B(以及可选地包括其他元件)；等等。

还应理解的是，除非明显相反指示，否则在本文要求保护的包括多个步骤或行为的任何方法中，方法的步骤或行为的顺序不必限于方法的步骤或行为叙述的顺序。