具体实施方式

以下，对本发明的液厚控制机构、培养装置以及液厚控制方法的实施方式详细地进行说明。但是，本发明并不受以下的实施方式的具体内容限定。

首先，参照图1以及图2对在本实施方式的液厚控制机构中使用的培养袋进行说明。图1是示出在本实施方式的液厚控制机构中使用的培养袋的概要的说明图，图1的(a)是俯视图，图1的(b)是主视图。图2是示出在本实施方式的液厚控制机构中使用的培养袋的具备各种凹部的培养部的一部分的示意图。

本实施方式的培养袋10是由软包装材料构成的培养袋，且能够通过利用热封等将底部侧膜11(下表面膜)与顶板侧膜12(上表面膜)的周边部贴合而形成。另外，在培养袋10设置有至少一个口13。在该口13连接有软管，利用配设于软管的送液机构经由该口13进行培养基向培养袋10的注入、以及培养基从培养袋10的排出等培养基的送液。

并且，根据向培养袋10注入的培养基的量，底部侧膜11与顶板侧膜12的间隔(液厚)发生变化。

培养袋10内的底部侧膜11的表面被用作对细胞或球体进行培养的培养部。如图2所示，在该底部侧膜11的培养部形成有用于收容细胞或球体等培养对象物的多个凹部。通过形成这样的凹部，能够适当地形成球体并对其进行培养。另外，培养部11中的多个凹部的配置能够采用例如交错状或格子状等。

在图1中，培养袋10的底部侧膜11呈平面状，伴随着培养基的流入，顶板侧膜12向上方鼓起。通过这样设置培养袋10，能够使培养袋10内的培养基的液厚均匀化，从而能够使所有凹部与载置面接触。因此，能够减少培养对象物的增殖性的差异或细胞播种时的细胞数的偏差。

需要说明的是，在本实施方式的液厚控制机构中使用的培养袋并不限定于这样的形状，其也可以通过利用热封等将相同形状的底部侧膜11与顶板侧膜12贴合而形成。

另外，在图1中，培养袋10以培养部的口附近的形状相对于口倾斜的方式形成，由此，培养基容易向口流动。但是，培养部的形状并不限定于这样的形状，也可以将培养部设为例如长方形等矩形状。并且，如后述那样，也能够适当地使培养袋具备两个以上的口。

在底部侧膜11的培养部形成的凹部的形状能够采用图2的(a)所示那样的圆锥或四棱锥等锥状、或图2的(b)所示那样的半球状或圆角状。

另外，如图2的(c)所示，优选将在底部侧膜11的培养部形成的凹部的形状设为侧壁的至少一部分形成为大致垂直状的形状。在这些凹部，侧壁的大致垂直部分的垂直方向上的长度比培养对象物的最大直径的一半长。另外，凹部中的侧壁为大致垂直的区域的形状能够采用例如圆柱状、四棱柱状等。

通过将培养袋10中的凹部设为这样的形状，在从口13向培养袋10内输送培养基的情况下，即使将其流速设为1ml/分以上，也能够防止培养对象物从凹部飞出并向另一凹部移动的情况。

在培养对象物为球体的情况下，作为凹部的深度，优选设为50～500μm。这是因为，若使凹部的深度大于500μm，则即使向培养袋10输送培养基，有时也难以充分地对凹部内的培养基进行置换，因此具备比500μm深的凹部的培养容器的加工难度升高。另外是因为，较小的球体的大小为50μm～100μm左右，较大的球体的大小为200μm～300μm左右。

凹部内的底部的形状没有特别限定，但在培养对象物为球体的情况下，为了容易凝集单细胞而能够适当地进行球体的形成，优选将凹部内的底部的形状设为锥体状、半球状、或者圆角状。

在培养对象物为单细胞的情况下，作为凹部的深度(a)，优选设为5～50μm。这是因为，单细胞的大小为6μm～15μm左右，且大多为10μm左右。

凹部的开口部的形状没有特别限定，可以将其设为圆形、或正方形等矩形状。另外，凹部的开口部的宽度能够根据培养对象物尺寸适当设定。

例如，在培养对象物采用球体的情况下，可以将凹部的开口部的圆或内切圆的直径的下限设为60μm以上、70μm以上、80μm以上、90μm以上、100μm以上、110μm以上、120μm以上、150μm以上等。另外，可以将凹部的开口部的圆或内切圆的直径的上限设为1mm以下、900μm以下、800μm以下、700μm以下、500μm以下等。

另外，在培养对象物采用单细胞的情况下，可以将凹部的开口部的圆或内切圆的直径的下限设为5μm以上、6μm以上、8μm以上等。另外，可以将凹部的开口部的圆或内切圆的直径的上限设为50μm以下、40μm以下、30μm以下等。

作为在本实施方式的液厚控制机构中使用的培养袋10的材料，能够适当地使用聚乙烯或聚丙烯等聚烯烃系树脂等。例如，能够列举出聚乙烯、乙烯与α-烯烃的共聚物、乙烯与乙酸乙烯酯的共聚物、使用了乙烯与丙烯酸或甲基丙烯酸共聚物与金属离子的离聚物等。另外，也能够使用聚烯烃、苯乙烯系弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、硅酮树脂等。并且，也能够使用硅酮橡胶、软质氯乙烯树脂、聚氨酯树脂、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、氯代聚乙烯树脂、聚氨基甲基乙酯系热塑性弹性体、聚酯系热塑性弹性体、硅酮系热塑性弹性体、苯乙烯系弹性体，即例如SBS(苯乙烯·丁二烯·苯乙烯)、SIS(苯乙烯·异戊二烯·苯乙烯)、SEBS(苯乙烯·乙烯·丁烯·苯乙烯)、SEPS(苯乙烯·乙烯·丙烯·苯乙烯)、聚烯烃树脂、氟系树脂等。

另外，优选在底部侧膜11的培养部进行低粘接性表面处理涂敷，以使得球体或单细胞不会粘接。具体而言，优选预先涂布细胞粘接抑制剂(细胞低粘接处理剂)。

作为细胞粘接抑制剂，能够使用磷脂聚合物、聚乙烯醇衍生物、磷脂·高分子复合体、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇、白蛋白等。另外，也可以将它们组合使用。

并且，作为培养袋10中的口13的材料，例如能够使用聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚苯乙烯系弹性体、FEP等热塑性树脂成形。

接下来，对本实施方式的液厚控制机构进行说明。本实施方式的液厚控制机构是对填充在具备至少一个口且由软包装材料构成的培养袋中的培养基的液厚进行控制的液厚控制机构，其特征在于，该液厚控制机构具有：检测部，其对根据培养基的液厚的变化而产生的变化进行测定；以及控制部，其基于从检测部输入的检测信息对在将培养袋与培养基袋连结的管状构件配设的送液机构的动作进行控制，从而对培养袋与培养基袋间的培养基的送液进行控制。

作为根据培养基的液厚的变化而产生的变化，能够采用构件的位置的位移，作为检测部，能够适当地使用测长传感器。

另外，能够通过控制部基于检测信息算出培养基的液厚，并基于该液厚对送液机构的动作进行控制。

作为测长传感器，能够使用电磁感应式、激光式、超声波式以及磁式等各种传感器。另外，存在模拟(线性)式和开关式，但优选使用作为始终进行测定的类型的模拟式的传感器。

另外，在使用电磁感应式的测长传感器等的情况下，优选在进行测定的位置安装金属构件。由此，能够提高传感器的灵敏度。需要说明的是，在使用激光式或超声波式的测长传感器等的情况下，不在进行测定的位置安装金属构件也能够进行测定。

具体而言，在使用模拟接近传感器(电磁感应式、测定距离1～6mm、sensortech株式会社制、MDA-C5)作为测长传感器的情况下，输出电压(或输出电流)与测定距离大致成比例，在该测定距离的范围内，对每0.01V输出电压检测0.01mm的液厚(培养袋内的培养基的液厚)的变化。

例如，在使用培养部的面积为50cm²的培养袋的情况下，0.01mm的液厚的培养基的液量为0.05ml。在该情况下，若将送液速度设为2ml/分，则能够以1.5秒对培养基进行送液，从而能够使液厚增减0.01mm。另外，若将送液速度设为0.5ml/分，则能够以6秒对培养基进行送液，从而能够使液厚增减0.01mm。

另外，通过使用模拟距离传感器(电磁感应式，测定距离0～12mm，富士电机设备控制株式会社制，PE2-LA10D)作为测长传感器，能够对例如8mm左右的更大的液厚进行控制。

在使用测长传感器直接对液厚进行测定的情况下，例如能够将测长传感器配置于载置培养袋的架台，并将金属构件配置于按压构件，从而利用测长传感器对距金属构件的距离进行测定。

在该情况下，液厚能够通过如下方法得到：将测长传感器的输出电压与规定的系数相乘，并进行减去膜的厚度等的校正。

另外，也能够如后述那样，将测长传感器配置于对按压构件进行支承的顶板部，并将金属构件配置于按压构件，从而利用测长传感器对距金属构件的距离进行测定。

在该情况下，液厚能够通过如下方法得到：将测长传感器的输出电压与规定的系数相乘，从而算出测长传感器距金属构件的距离，并从载置有培养袋的架台的上表面距测长传感器的下表面的距离中减去上述算出的距离、金属构件的厚度、按压构件的高度以及膜的厚度。

另外，也能够将根据培养基的液厚的变化而产生的变化设为载置有培养袋的培养袋收容部的重量的变化，从而使用重量传感器作为检测部。并且，也能够利用控制部基于重量的变化算出培养基的液厚，并基于该液厚对送液机构的动作进行控制。

即，也能够从测定时点的重量中减去培养袋的液厚为零的时点的重量并将其换算为体积，通过该体积除以培养部的面积算出液厚，并基于该液厚对送液机构的动作进行控制。

根据这样的本实施方式的液厚控制机构，能够对培养袋中的培养基的液厚进行把握，因此能够对培养袋内的培养基的余量进行把握。

另外，能够对培养袋的上表面膜与下表面膜接触的时机进行把握。由此，能够防止成为在培养袋内没有培养基的状态的情况。另外，也能够对由泵的故障或设置不当引起的送液错误进行检测。

另外，通过将培养基的液厚的检测值反馈到控制部，能够对培养袋中的培养基的液厚进行控制，因此能够将培养袋的上表面膜与具有多个凹部的下表面膜的间隙控制为无法供球体移动的大小(约50μm的间隙)。

接下来，参照图3～图8对本实施方式的培养装置以及液厚控制方法进行说明。图3是示出本实施方式的培养装置的概要的说明图。图4是示出本实施方式的培养装置中的培养袋收容部的概要的俯视图。图5是示出该培养袋收容部的概要的主视图，且示出在培养袋封入有培养基的状态，图6是示出该培养袋收容部的概要的左视图，其示出在培养袋封入有培养基的状态。图7是示出该培养袋收容部的概要的主视图，且示出在培养袋未封入有培养基的状态，图8是示出该培养袋收容部的概要的左视图，且示出在培养袋未封入有培养基的状态。需要说明的是，在这些图中，省略了封堵软管的流路的夹管阀等封堵机构。

本实施方式的培养装置是对填充在具备至少一个口且由软包装材料构成的培养袋中的培养基的液厚进行控制的培养装置，其特征在于，该培养装置具有：架台，其供培养袋载置；按压构件，其相对于架台按压培养袋，从而使培养袋内的液厚均匀；顶板部，其与按压构件相面对地配置；支承机构，其相对于顶板部将按压构件支承为能够在垂直方向上移动；检测部，其对根据培养基的液厚的变化而产生的变化进行测定；以及控制部，其基于从检测部输入的检测信息对在将培养袋与培养基袋连结的管状构件配设的送液机构的动作进行控制，从而对培养袋与培养基袋间的培养基的送液进行控制。

具体而言，如图3所示，具有：培养袋收容部20、载置于该培养袋收容部20的培养袋10、培养基袋40、在将培养袋10与培养基袋40连结的软管配设的送液机构30、以及与测长传感器25和送液机构30连接的控制部60。控制部60以外的结构在培养时配置于培养器50内。

在培养袋收容部20中，在架台21的四角立起设置有顶板支承部22，在顶板支承部22固定有顶板部23。另外，在顶板部23的周边部设置有引导销273，该引导销273贯穿在按压构件27的安装部272设置的引导孔，按压构件27以能够沿着引导销273在垂直方向上移动的方式设置。

并且，在顶板部23设置有顶板开口部231，从而能够通过该顶板开口部231对培养装置20的内部进行视觉辨认。

另外，在顶板部23的四角设置有永磁铁26作为朝向下方对按压构件27施力的施力机构，在安装部272中的与永磁铁26相对应的位置设置有永磁铁2721作为施力机构。这些永磁铁彼此以使同极侧对置的方式配置，通过在永磁铁26与永磁铁2721之间作用的斥力，按压构件27的按压部271能够在相对于培养袋10的顶板侧膜12垂直地按压的状态下在垂直方向上移动。

需要说明的是，施力机构73并不限定于永磁铁。另外，也可以省略施力机构73，利用按压构件27的自重使按压构件27相对于顶板侧膜12上下移动。

另外，以使按压部271的底面配置于培养袋10中的培养部的内侧的方式确定按压构件27的尺寸。

通过像这样利用按压构件27按压培养袋10，顶板侧膜12的起伏的产生得到抑制。其结果是，在进行培养基的注入或排出的期间，顶板侧膜12被保持为与架台21的载置面平行，培养袋10中的培养基的液厚变得均匀。

按压构件27例如可以由聚碳酸酯那样的合成树脂形成，也可以由玻璃形成。另外，优选按压构件27的一部分或全部具有透明性，以能够对培养的进展状况或培养对象物的状态等进行确认。

如图5以及图6所示，在向培养袋10内填充培养基时，成为按压构件27被培养袋10推起的状态。

另一方面，当通过配置于软管14的送液机构30经由与培养袋10的口13连结的软管14从培养袋10排出培养基时，培养袋10中的培养基的液厚随之减少，伴随于此，按压构件27下降。

并且，如图7以及图8所示，当培养基从培养袋10完全排出时，培养袋10被按压构件27按压至上表面膜与下表面膜接触的状态(形成于底部侧膜11的多个凹部被顶板侧膜12封堵的状态)。此时，培养袋10中的培养基的液厚为零。

传感器支承部24固定于顶板部23的周边部，且在该传感器支承部24的前端部安装有测长传感器25。另外，以与测长传感器25相面对的方式在按压构件27的安装部272安装有金属构件2722。需要说明的是，传感器支承部24以及测长传感器25的配置并不限定于此，在能够对距金属构件2722的距离进行测定的范围内，能够相对于顶板部23将传感器支承部24以及测长传感器25安装于任意的位置。

并且，通过利用测长传感器25对距金属构件2722的距离进行测定从而算出培养袋10中的培养基的液厚，能够对该液厚进行检测。

例如，液厚能够通过如下方法得到：将测长传感器25的输出电压与规定的系数相乘，从而算出测长传感器25距金属构件2722的距离，并从架台21的上表面距测长传感器25的下表面的距离中减去上述算出的距离、金属构件2722的厚度、按压构件的高度以及上表面膜和下表面膜的厚度。

送液机构30配设于将培养袋10与培养基袋40连结的软管。作为该送液机构30，优选使用例如蠕动泵或注射泵那样的能够以低速进行高精度的送液的泵。需要说明的是，送液机构30并不限定于这些泵，也能够采用基于水位差(自重)或加压等的泵。

通过使这样的送液机构30进行动作，能够进行培养基从培养基袋40向培养袋10的填充、以及培养基从培养袋10向培养基袋40的排出。

送液机构30的动作基于来自测长传感器25的检测信息而由控制部60控制。此时，控制部60能够基于从测长传感器25输入的(发送来的)输出电压(或输出电流)算出培养袋10中的培养基的液厚，并基于液厚对送液机构30的动作的开始和停止、以及旋转速度等进行控制，从而将液厚控制为所期望的大小。

培养基袋40能够被用作用于供给培养基的培养基供给袋、或用于排出培养基的培养基排出袋。

培养器50收容培养袋10、培养袋收容部20、送液机构30以及培养基袋40并保持恒定的温度以及湿度，从而维持培养袋10内的细胞或球体的培养环境。

控制部60(控制单元)没有特别限定，其只要能够基于来自测长传感器25的检测信息对送液机构30的动作进行控制即可，但能够采用具备输入输出部61(输入输出单元)、PLC(programmable logic controller、可编程逻辑控制器)62、继电部63(继电器)、操作部64(触摸面板等)、电源部65(稳定化电源等)以及布线阻断部66(电流断路器)的结构。另外，也可以利用微型计算机或计算机实现这样的结构。

能够预先对所期望的控制内容进行编程并将其存储于PLC62，从而基于该内容对送液机构30的动作进行控制。

例如，能够利用控制部60中的PLC62存储与培养基的液厚为零的第一状态相对应的第一信息，将第一信息与规定的变化量相加而算出第二信息，并基于第二信息对送液机构30的动作进行控制，从而将培养基的液厚控制为与第二信息相对应的第二状态。需要说明的是，第一信息以及第二信息能够采用电压、电流、晶体管输出或培养基的液厚等。

具体而言，能够在对与排出培养袋10中的培养基而液厚为零的状态相对应的输出电压进行存储后，以基于来自测长传感器25的检测信息使培养袋10中的培养基成为所希望的液厚的方式对泵等送液机构30的驱动进行控制，从而向培养袋10供给培养基。

本实施方式的培养装置以及液厚控制方法并不限定于上述的结构或方法，只要能够实施本实施方式的液厚控制机构，也可以采用其他结构或方法。

例如，也能够将测长传感器配置于载置培养袋的架台，并将金属构件配置于按压构件，从而构成培养装置。另外，也能够采用如下结构：使用重量传感器对包括培养袋10中的培养基在内的重量进行检测并将其向控制部60输出，控制部60基于培养基的重量算出培养基的液厚，从而对送液机构30的动作进行控制。

并且，作为在本实施方式的液厚控制机构中使用的培养袋，也优选使用具备两个口的培养袋，在将第一口与第一袋连结的管状构件配设第一送液机构，并在将第二口与第二袋连结的管状构件配设第二送液机构，利用控制部基于从检测部输入的检测信息对第一送液机构以及第二送液机构的动作进行控制。

即，也优选在与两个口分别连结的软管配设泵等而实现本实施方式的培养装置以及液厚控制方法。

具体而言，能够适当地使用图9以及图10所示那样的具备两个口13a的培养袋10a。

在这些图中，在培养袋10a的一个口13a经由软管连结有培养基袋40，并在该软管配设送液机构30。此时，培养基袋40能够被用作培养基供给袋等。另外，在培养袋10a的另一口13a经由软管连结有废液袋40a，并在该软管配设有送液机构30a。需要说明的是，在各口经由软管连结的袋也可以是其他用途的袋。

若将本实施方式的培养装置设为这样的结构，则能够基于来自测长传感器25的检测信息对送液机构30以及送液机构30a的动作进行控制。

因此，例如能够在使培养袋10a中的培养基的液厚成为无法供球体移动的大小(约50μm的间隙)的状态下，将培养基从培养基袋40向培养袋10a输送，并且将培养基从培养袋10a向废液袋40a输送，从而进行培养基的更换。另外，此时，也能够对送液机构30以及送液机构30a的动作进行控制，从而对培养基的送液速度进行控制。

另外，作为在本实施方式的液厚控制机构中使用的培养袋，也优选采用如下结构：在顶板侧膜12中，在培养袋10的内侧设置有顶板突起部，使顶板突起部的宽度小于形成于底部侧膜11的凹部的开口部的宽度，并使顶板突起部的高度小于培养对象物的最小直径，从而在顶板突起部与培养部的上端面的一部分接触的情况下，在上端面与顶板侧膜12的下表面之间形成间隙。

若将在本实施方式的液厚控制机构中使用的培养袋设为这样的结构，则能够成为使顶板突起部与上端面的一部分接触，从而在上端面与顶板部之间形成比培养对象物的尺寸小的间隙的状态。由此，能够使培养基等液状物从间隙通过，并且能够防止球体等培养对象物的移动。

在培养对象物采用球体的情况下，本实施方式的培养装置能够在形成球体的工序、在维持球体状态的状态下对其进行培养并使其增殖的工序、以及在球体状态下进行分化诱导的工序等中使用。

另外，也能够在使用已经过分化诱导工序而从iPS细胞或ES细胞、其他干细胞得到的分化细胞形成球体的方法、或将分化诱导后的细胞暂时冷冻保存，并在再次解冻后形成球体的方法等中使用。

如以上说明的那样，根据本发明的实施方式的液厚控制机构、培养装置以及液厚控制方法，能够对培养袋中的培养基的液厚进行把握，因此能够对培养袋内的培养基的余量进行把握。

另外，能够对培养袋的上表面膜与下表面膜接触的时机进行把握，由此，能够防止成为在培养袋内没有培养基的状态的情况。另外，也能够对由泵的故障或设置不当引起的送液错误进行检测。

并且，通过将培养基的液厚的检测值反馈到控制部，能够对培养袋中的培养基的液厚进行控制，因此能够将培养袋的上表面膜与具有多个凹部的下表面膜的间隙控制为无法供球体移动的大小。

另外，通过使用具备两个口的培养袋作为培养袋，并在与两个口连结的各软管配设泵，例如能够在使培养袋中的培养基的液厚成为无法供球体移动的大小的状态下，将培养基从培养基袋向培养袋输送，并且将培养基从培养袋向废液袋输送，从而进行培养基的更换等。

本发明并不限定于以上的实施方式，在本发明的范围内能够实施各种变更，这是不言而喻的。例如，也能够采用培养袋具备三个以上的口，在将这些口连结的各软管配设泵，并基于来自检测器的信息对这些泵进行控制的结构，或者进行变更培养装置中的按压构件、测长传感器的配置等适当变更。

工业实用性

本发明能够在高效地大量制作尺寸均匀的球体等的情况下适当地利用。

将本说明书中记载的文献以及作为本申请的巴黎公约优先权的基础的日本申请说明书的内容全部援引于此。

附图标记说明

10培养袋、11，11a，11b底部侧膜、111，111a，111b凹部、12顶板侧膜、13口、14软管(管状构件)、20培养袋收容部、21架台、22顶板支承部、23顶板部、231顶板开口部、24传感器支承部、25测长传感器、26永磁铁、27按压构件、271按压部、272安装部、2721永磁铁、2722金属构件、273引导销、30送液机构、40培养基袋、50培养器、60控制部、61输入输出部、62PLC(可编程逻辑控制器)、63继电部、64操作部、65电源部、66布线阻断部。