测定纳米级系统(nss)的理化性质的方法
阅读说明：本技术 测定纳米级系统(nss)的理化性质的方法 (Method for determining physicochemical properties of nanoscopic systems (NSS) ) 是由 C·恩勒特 M·莱曼 I·尼尚 U·舒伯特 于 2020-02-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及使用分析型超速离心(AUC)测定纳米级系统(NSS)的理化性质的方法,包括以下步骤：生成与感兴趣的NSS相关的多维沉降分析图；选择样品相关参数；测定样品中沉降系数值/参数；将样本沉降系数值插入多维沉降分析图以获得NSS样品的映射值；以及从NSS样品的映射值推断NSS样品的理化性质。此外,本发明涉及用于执行该方法的系统、计算机程序产品和计算机可读存储介质。(The present invention relates to a method for determining physicochemical properties of a nanoscopic system (NSS) using Analytical Ultracentrifugation (AUC), comprising the steps of: generating a multi-dimensional sedimentation analysis map associated with the NSS of interest; selecting a sample-related parameter; determining a sedimentation coefficient value/parameter in the sample; inserting the sample sedimentation coefficient value into a multidimensional sedimentation analysis map to obtain a mapped value for the NSS sample; and inferring the physicochemical properties of the NSS sample from the mapped values of the NSS sample. Furthermore, the invention relates to a system, a computer program product and a computer-readable storage medium for performing the method.)
技术领域
本发明涉及根据权利要求1的主题使用分析型超速离心测定纳米级系统(NSS)的理化性质的方法。此外，本发明涉及执行根据权利要求18的主题的方法的系统、涉及根据权利要求19的计算机程序产品和涉及根据权利要求20的计算机可读存储介质。
背景技术
在医学诊断和治疗领域，纳米技术被认为可促进药物的广泛临床应用，但迄今为止，药物进入其作用部位一直受到多重途径障碍的阻碍。通过使用生物相容性纳米载体，例如脂质体、聚合物、无机纳米粒子、碳纳米管等，可以改善例如水溶性有限的药物的递送，从而提高这些药物在生物系统中的生物利用度。此外，通过将靶向特性结合到纳米颗粒中，可以将药物输送到特定器官和位于其中的组织。尽管纳米医学市场快速增长且多样化，但在理化层面和生物层面上缺乏关于纳米粒子表征的特定和标准化协议。同样，也缺乏确保纳米药物产品的质量、安全性和有效性的标准方法，而这些标准方法是产品获得资格和公共当局或机构的批准的先决条件。
需要一种能够访问(优选同时访问)与纳米药物产品相关的大量参数的单一技术。此外，优选在选择的溶液条件下，例如溶液中不同的pH值、缓冲条件、血清蛋白的存在与否，存在对此类纳米级系统(NSS)进行守恒质量平衡(conserved mass balance)和无稀释的原位分析的需要。
用于此类目的的合适技术是分析型超速离心(AUC)，它于上世纪初作为一种经典分析技术出现。AUC主要被生物物理学界用于定量评估蛋白质的溶液状态、形状和大小，包括它们的聚集和蛋白质-蛋白质的相互作用。AUC依赖于第一性原理的流体力学和热力学信息；因此，它可用于确定各种颗粒浓度和颗粒大小的范围内的多种类型颗粒的生物物理特性。AUC通常依赖于两种基本类型的沉降实验：平衡实验和沉降速度实验。在沉降速度实验中，原位观测物质向细胞底部的运动。向细胞底部移动的沉降边界通过它们在指定时间间隔内移动到参考处(不含颗粒的溶剂)的快照进行跟踪。沉降速度取决于颗粒的流体动力学特性，因此可以推导出颗粒的形状、质量和颗粒在溶液中的相互作用。颗粒的沉降速度可以在随pH、离子强度和温度(例如4℃至40℃)而变化的条件下进行研究。在平衡实验中(通常在较低的转子转速下进行)，旨在达到沉降和扩散之间的平衡。这些类型的实验可用于摩尔质量估计，还可以测定复合物的特性和粒子的自缔合以及种类之间的结合亲和力/强度的量化。
总之，需要一种合适的技术来表征纳米级系统(NSS)以及纳米级药物输送系统(NDDS)，该技术可以服务于整个大小范围(即，从大小<1nm到μm)，并允许应用具有原位检测和可调浓度/稀释度的各种溶液条件，而实际实验无需稀释。在本发明中，公开了以AUC实现该目的。
发明内容
在第一方面，本发明涉及使用分析型超速离心(AUC)测定纳米级系统(NSS)的理化性质的方法。在本发明的背景下，术语“AUC”是指分析型超速离心，其包括由市售AUC装置产生的范围从约1,000rpm到最大速度的速度，其中转子通常能够达到60,000rpm或更高的速度。所述方法包括以下步骤：第一步，生成与感兴趣的NSS相关联的多维沉降分析图，然后，第二步，根据样品选择AUC参数。在第三步中，测定样品中每个参数的沉降系数值，例如，测定样品中的各个参数(粘度、密度等)，在第四步中，将样品沉降系数值插入到多维沉降分析图上，得到NSS样品的映射值。具体地，将样品值映射到多维沉降分析图上以获得NSS特征，分别为指纹图谱(fingerprint)。在最后一步中，从NSS样品的映射值中推断出NSS样品的理化性质，即NSS样品的所有理化性质都可用，可以分别从像指纹图谱一样的映射值中推导出来。
NSS可理解为包括脂质体、固体脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、树状聚合物、金属颗粒以及碳纳米管。上述系统可以在内部或外部携带货物(cargo)(纳米级药物输送系统，NDDS)，也可以着色或彩色编码等。脂质体是基于脂质的，并且包含包裹水核的脂质双层，而固体脂质纳米颗粒则具有固体脂质核。聚合物纳米颗粒采用可生物降解/不可生物降解和生物相容性/非生物相容性的聚合物，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)纳米颗粒是可生物降解和生物相容性的主要例子。PLGA系统包含各种化学计量比的羟基乙酸和乳酸。NSS可能表现出支化或超支化的结构；树状聚合物是广泛支化的有机分子实体的一个例子。这些载体具有各种各样的不同特性，例如可调的分子量/摩尔质量、流体力学体积、大小、形状、密度、稳定性，它们可以是结晶的或非结晶的，由于其复杂的结构而具有可进入的末端基团和潜在的包裹或结合货物分子的能力，例如，聚合NSS可以结合遗传物质(“复合系统”)。金属颗粒由金属材料配制而成，例如金，如球形金纳米粒子、金纳米棒、金纳米笼和金纳米星。这些粒子在其外表面/结构上携带货物；释放可以由内部(例如，谷胱甘肽或pH值)或外部刺激(例如，光、温度)触发。碳纳米管是纤维状纳米圆柱体，其由单层(单壁碳纳米管)或多层(多壁碳纳米管)石墨烯层组成，所述石墨烯层的长度和直径分别为50nm至100nm和1-5nm至10-100nm。
根据本发明的术语“NSS”可理解为指的是纳米级系统，其中纳米级系统定义为具有从小于1nm到微米的典型总体大小或具有在该长度范围内的特征的系统。可以理解的是，NSS对其整体形状没有特别的限制。因此，根据本发明的NSS可以是颗粒，其中颗粒是小的局部物体，其可以归因于若干物理或化学性质，例如体积、密度或质量。NSS可以采用任何几何形状，例如，球状、管状等。术语“NDDS”是指纳米级药物输送系统，其中纳米级药物输送系统是另外包含药物的NSS。NSS和NDDS都可理解为是指悬浮在溶剂中的系统(或基质)，其中术语“溶剂”是指一种物质，在这种情况下，该物质能够溶解或稀释固体，特别是NSS，能够改变或不改变固体的化学或物理结构。在本发明的背景下，所用的溶剂是有机或水基或有机-无机(混合)溶剂或离子液体，例如水、盐溶液、细胞培养基，或其它生物相关溶液，例如血清和血。在本发明的背景下，术语“NSS”还包括关于它们的化学或物理结构被溶剂改变的那些“NSS”。
在本发明的背景下，术语“沉降分析图”是指空间的表示，该空间包括与感兴趣的NSS及其各自组成部分相关的限定数量的特征，其中这些特征源自沉降，特别是分析型超速离心，以及在多种不同的实验参数条件下进行的实验(“参数”的定义见下文)。因此，根据特征的数量，图像可以是二维或三维的，在本发明的背景下，它是包括可调整数量的独立变量的多维空间。根据本发明的方法，“沉淀分析图”还可以包括与感兴趣的NSS和NDDS相关的特征，这些特征已经由独立技术确定，用于结合AUC衍生测量补充所述NDDS理化性质。
这里使用的术语“参数”是指能够对特定系统进行分类的任何特性。具体地，参数是系统的一个元素，在识别系统或评估其性能、状态、条件等时是有用的或关键的。在本发明的背景下，NSS的特征在于诸如吸光度或折射之类的参数，这些参数与用于监测沉降期间(特别是AUC)感兴趣的NSS的行为的光学系统相关；在不同半径值下监测整个细胞的吸光度是测量所讨论的NSS沉降行为的最通用和最灵敏的方法。在折射检测(例如，Raleigh干涉检测)中，测量样品扇区(溶剂中的样品)和参考扇区(仅溶剂)之间的折射差异。在吸光度检测中，测量样品扇区(溶剂中的样品)和参考扇区(仅溶剂)之间的吸光度差异；或者，可以在强度模式下进行直接样本扇区测量。检测与浓度成正比，其可用于检测合适浓度的颗粒。与吸光度相反，折射还能够监测如下物体：例如，没有合适的光吸收中心/特性或发射中心/特性的聚合物。虽然在本发明的背景下，吸光度和折射可认为是简单的参数，但NSS也可以通过降解动力学表征，这是最复杂但也是最有洞察力的参数。
术语“沉降系数值”是指沉降系数s的值，其来自对AUC实验中沉降边界移动的移动速率的测量。所述沉降系数取决于颗粒的形状，其中在形状偏离球体的颗粒中，摩擦比f/f0大于1(所讨论分子的摩擦系数f/具有相同无水体积和质量的光滑球体的摩擦系数f0)。沉降系数进一步取决于颗粒的分子量/摩尔质量，其中较大的颗粒沉降得更快。系数s可以通过在合适的时间间隔查看沉降种类的群体来测量；如上所述，在沉降过程中，会产生边界，随着时间的增加，该边界会朝着更高的径向值前进。测定s的条件与以下相关：转子速度、样品和转子中心之间的距离、温度、溶剂、缓冲液、离心时间、检测时间间隔、扇区和光学窗口特性以及AUC仪器(包括超速离心机和检测仪器)。数据分析用于确定沉降系数s和扩散系数D；扇形单元中的质量传输由偏微方程描述，即LAMM方程：
dc/dt＝(1/r)/(d/dr)[rDdc/dt-sω2r2c]。
数据分析可以采用数值方法求解LAMM方程(通过分子动力学或数值近似，因为解析解很难得出)，或者在计算机和/或其他分析手段不可用的情况下，通过图解法求解。
术语“映射”是指将沉降系数值插入到多维沉降分析图上，所述多维沉降分析图将其它可能的参数上下文化(contextualize)。可以使用例如多元回归分析或任何其它数学拟合函数。
术语“理化学性质”应理解为是指已知可从沉降实验，特别是AUC实验或其它物理方法(例如粘度、密度)推导出的此类特性。上下文化是本发明的基础。这种沉降衍生的特性是感兴趣对象的大小和密度、对象在溶液、聚集体、共轭物中的浓度和分散性等。此外，对于复合系统，例如NSS，可以推断它们的完整性和稳定性，其中特定的完整性和稳定性可以根据溶剂环境进一步区分。
根据本发明的方法有利地允许使用沉降过程，特别是AUC，并且特别是在天然和相关生物样品条件下对多功能NSS进行原位评估。在本发明的方法中，待测定理化性质的样品经过有限次数的测量，其结果被映射到多维沉降分析图，从而允许从中推断样品的理化性质。因此，它提供了一种无需校准、可靠、广泛适用且特性良好的表征NSS的技术，其适用于整个粒径范围，并允许在分析过程中应用各种溶液条件而无需稀释。
在该方法的优选实施例中，纳米级系统(NSS)是纳米级药物输送系统(NDDS)。
在该方法的优选实施方式中，生成多维沉降分析图的步骤可以包括以下步骤：选择代表感兴趣的NSS的参数的步骤，然后是利用特定NSS和任何单一的NSS组分的AUC沉降系数值/参数/浓度系列来生成多维沉降分析图的步骤。通过使用足够数量的简单参数和复杂参数，以及沉降实验中足够数量的浓度值，根据准确、经过验证和物理化学的原理，可以生成高度复杂和多维度的准确沉降分析图，其中，简单参数，例如吸收和/或折射，复杂的参数，例如密度和/或降解动力学。
在进一步的实施中，参数可以从包括吸收/发射、折射、密度、降解动力学的组中选择。颗粒的密度与其偏微比容(partial specific volume)成反比，并且颗粒的密度可以例如来自颗粒在不同溶剂中的沉降速度实验。颗粒的密度可以例如使用具有不同密度和粘度的(已知)两种溶剂，例如D2O/H2O的混合物，并根据测量的溶剂中的沉降系数计算偏微比容。颗粒的降解动力学与其在随pH、温度、酶的存在、生物液等而变化的各种环境条件下的稳定性有关。在这种情况下，这些流体的组分(例如蛋白质或其它性质不同的物质)的相互作用也可能形成“电晕(corona)”，例如可以观察到可能影响NSS完整性的“蛋白质电晕(proteincorona)”。因此，电晕还可用于衡量特定NSS在生物液中的适用性。也可以定量研究组分以电晕形式或通过粒子设计策略共价地与粒子的结合。一个可能的例子是附着在颗粒表面的生物素-链霉亲和素-抗体(Biotin-streptavidin-antibody)系统。还可以看到抗体与颗粒表面的相互作用以及对其在流体中的完整性的影响。这被认为是对NSS系统的实用性、适用性和安全性的重要且必要的洞察。
在本发明的方法的优选实施例中，参数降解动力学可以包括物理参数相关降解和/或化学参数相关降解。其中，术语“物理参数相关降解”是指通过改变提供给样品的能量，即热能、电流、紫外线辐射或X射线而引起的降解。例如，NSS样品中温度相关降解可以在37℃下测量，并与4℃或20℃和/或不同时间下的测量值进行比较。相反，“化学参数相关降解”是指由样品的环境条件变化引起的降解，即通过改变例如质子(pH)或氧化剂或还原剂的浓度。术语“生物参数相关降解”是指存在例如溶剂中的酶，引起样品中NSS的降解。
在进一步的实施方式中，生成多维沉降分析图的步骤可以另外包括测定用于悬浮感兴趣的NSS的溶剂的粘度的步骤。流体的粘度描述了流体对流动的内部阻力，因此是流体摩擦力或颗粒在所述流体中移动的难易程度的量度。为了确定粘度，可以使用现有技术中已知的任何粘度计，例如玻璃毛细管粘度计(Ubbelohde)或旋转粘度计(流变仪)或简单的毛细管/球组合。通过这一步，将粘度信息添加到多维沉降分析图中，它允许在接近预期现实生活条件的条件下，即在人体体液中对NSS进行原位评估。
在特别优选的实施方式中，在使用AUC确定NSS样品的理化性质的方法中可以选择至少三个不同的样品相关参数。至少三个不同的样本相关参数在NSS的特性方面不同，从而能够对NSS进行分类。最优选地，参数可以包括密度、粘度和光学检测。在此，术语“光学检测”是指吸光度、折射、发射、荧光、发光、散射等光学检测方法。当测量与用于生成多维沉降分析图的NSS相同的NSS样品时，只需为感兴趣的样品选择和测量三个不同的参数。对任何给定的NSS样品使用至少三个不同的参数，可以通过仅使用有限数量的沉降步骤，特别是AUC沉降步骤来有效地测定其理化特性。同时，由于实验系统的定量性质，测定理化性质的方法是可靠的和可重复的。
在一个优选的实施方案中，理化性质可以选自由以下组成的组：NSS大小、NSS分子量/摩尔质量、NSS浓度、NSS分散度、NSS聚集体、NSS完整性和NSS稳定性。
NSS大小可以根据流体动力学等效球的大小测定，即基于它们的流体动力学直径：dh。流体动力学直径dh可通过来自沉降速度实验的以下关系获得：
NSS摩尔质量可以由Svedberg方程导出：
其中，M表示颗粒摩尔质量，R表示气体常数(Svedberg和Pedersen，1940)。虽然沉降系数s(从沉降边界随时间的迁移获得)和扩散系数D(从沉降边界随时间的扩展获得)是从沉降速度实验中得出的，但摩尔质量也可以从沉降和扩散之间获得的平衡，即平衡条件获得。
NSS浓度的理化性质是指完整的NSS及其组分种类的相对浓度。在沉降之前、沉降期间和沉降之后，它可以分别通过不同沉降系数分布曲线下的面积，即单位S上的逆强度(inverse intensities)，简单地从光密度或任何检测器信号中读取，角速度的选择允许对样品中的组分进行选择性分级。
NSS分散度和NSS聚集体是指与NSS在给定溶剂中的分布相关的特性，其中所述特性可以直接从各自的沉降速度分布图导出。这同样适用于NSS完整性和NSS稳定性的性质。
在本发明的方法的特别优选的实施方式中，NSS完整性可以包括NSS在溶剂中的完整性，该溶剂选自包括水、盐溶液、有机溶剂和生物相关液体(biologically relevantfluid)的组。在本文中，溶剂是溶解或分散溶质(即，NSS)而产生溶液/分散体的物质。虽然在本发明的方法的背景下，大多数溶剂是水基的，但也可以适当地使用有机溶剂，例如用于储存NSS。术语“生物相关液体”是指与生命系统相关的溶剂，例如细胞培养物或生物体。因此，根据本发明的生物相关液体是细胞培养基、血清或血液。
在进一步的实施例中，NSS可以包括至少两个不同的组分。如上所述，NSS可理解为包括至少两个单独实体的系统，其中每个实体呈现出从小于1nm到微米的大小或具有在该长度尺度内的特征。术语“NDDS”是指纳米级药物输送系统，其中纳米级药物输送系统也是包含药物的NSS。从结构的角度来看，NSS可理解为包括脂质体、固体脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、树状聚合物、金属颗粒以及碳纳米管。这些颗粒中的每一类都可能由聚合物、金属和金属氧化物、脂质、蛋白质、DNA或其它有机化合物组成。此外，根据本发明的术语“NSS”应理解为指悬浮在溶剂中的纳米级系统。因此，其理化性质将由本发明的方法表征的NSS可包含颗粒基质和溶剂(介质)。颗粒基质可以包含一种或多种组分，例如载体组分、靶向部分、添加剂组分和药物组分(纳米级药物输送系统，NDDS)。在一个优选实施例中，NSS可以是这种复合聚合NDDS系统。在更优选的实施方案中，复合聚合物系统可包含可生物降解的聚合物和包封的药物。在进一步优选的实施方案中，复合聚合物系统可以包含靶向染料部分，并且当它可以包含稳定剂，优选表面活性剂时，也是优选的。例如，复合NSS可能由部分被靶向染料部分功能化的可生物降解的聚合物(如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA))组成，它可以携带包封的药物，并且可以通过由于制备过程而部分掺入NSS中的表面活性剂稳定在溶液中。
在一个特别优选的实施例中，可能必须针对NSS进行至少一种独立的AUC测量/抽样，并且优选地，必须针对溶剂进行一种独立的测量/抽样。例如，在给定的样品中，沉降系数可以使用特定吸收波长下的AUC(和/或使用光学干涉)来测量，以测定例如成分和浓度。根据这些测量结果，NSS大小可以使用流体动力学直径dh确定。因此，每个样品要进行的最小测量次数是一次AUC测量，这使得本发明的方法非常省时，同时无需校准且准确。在一个特别优选的实施例中，每个样品要进行的测量次数可以是两次加上至少一次相对于感兴趣的NSS而改变的测量/组分。例如，在要测定粘度的情况下，每个样品要进行的测量次数可以是两次，再加上可能需要的测量次数，其次数取决于改变为已知NSS的组分。
在进一步的实施方式中，NSS可以包括溶剂衍生的物理和/或化学改性(modification)。液体中包含的组分，例如，如蛋白质或其它物质等的生物液与NSS的相互作用，可能形成“电晕”(例如“蛋白质电晕”)，可能会影响NSS的完整性。这种“电晕”形式的改性可用于衡量特定NSS在生物液中的适用性。例如，NSS表面可以通过生物素-链霉亲和素-抗体(“抗体电晕”)的附着来修饰。也可以定量研究组分以电晕形式或通过粒子设计策略共价地与粒子的结合。还可以看到抗体与颗粒表面的相互作用以及对其在流体中的完整性的影响。
在进一步的实施例中，本发明的方法可以由计算机实施。具体地，步骤d)可以由计算机实施，所述计算机包括适于接收来自前一步骤，即步骤c)的数据的装置。计算机还可包括优选地通过多元回归分析，将一个或多个沉降系数值映射到多维沉降分析图上的装置。在特别优选的实施例中，步骤e)可以由计算机实施，包括从NSS样品的映射值推断NSS的理化性质的计算装置。
在第二方面，本发明涉及一种用于执行上述方法的系统，其中该系统包括以下的多维沉降分析图生成装置：用于生成与感兴趣的NSS相关的多维沉降分析图的装置；用于选择样本相关的沉降AUC参数的装置；测定样品中沉降系数值/参数的装置；将样本沉降系数值插入沉降分析图以获得NSS样品的映射值的装置；用于从NSS样品的映射值推断NSS样品(即，感兴趣的NSS样品)的理化性质的计算装置。
在第三方面，本发明涉及一种包括指令的计算机程序产品，当程序由计算机执行时，所述指令使计算机执行权利要求1的方法的步骤。
在第四方面，本发明涉及一种包括指令的计算机可读存储介质，当其由计算机执行时，所述指令使计算机执行权利要求1的方法的步骤。
参考以下附图和实施例将更全面地理解本发明。然而，不应将它们解释为限制本发明的范围。应当理解，本文描述的示例和实施例仅用于说明目的，并且本领域技术人员将根据其提出各种修改或改变，而此各种修改或改变包括在本申请的上下文和所附权利要求的范围内。
附图说明
图1示出了本发明的方法的流程图。在此,示出了示意性方案,其用于根据不同的参数和理化性质来表征未知的复合NSS。
在图2(a)-(c)中，示出了示意性方案，其举例说明了表征未知NSS和部分已知NSS样品所需的步骤(链接(links))。图2(a)示出了用于表征包含已知NSS的NDDS样品的示意性方案，然而，其与已确定的(“表征的”)NSS仅部分相同。图2(b)示出了表征对应于已确定的NSS但在溶剂方面不同的新NSS样品的示意性方案，而在图2(c)中，示出了新NDDS样品的示意性方案，其中药物和靶向部分与已知组分相同，而NDDS的基质以及添加剂和稳定组分未知。
图3示出了NDDS样品在环境条件下储存两周后(3(a))和在环境条件下储存10周后(3(b))的沉降速度曲线，其中通过在处的吸光度检测来跟踪沉降。在图3(a)和图3(b)的上部中，示出了将AUC加速至3,000rpm(黑线)后的沉降速度曲线，以及在将AUC加速至加速到10,000rpm之前的52分钟(黑色虚线)之后的沉降速度曲线。在10,000rpm下记录剩余的沉降速度曲线(灰色方块)。在图3(a)和图3(b)的底部中，示出了来自ls-g*(s)模型(实线)的相应残差图。
图4示出了在DMSO溶液(实线)中和在水中稀释(虚线)的靶向染料和药物的归一化UV光谱。染料的最大值从DMSO中的向下移动到95％水/5％DMSO中的药物的最大值从DMSO中的向下移动到95％水/5％DMSO中的
图5示出了NDDS1样品的沉降系数的微分分布(differential distributions)ls-g*(s)，这些样品在环境条件下储存0至12周，间隔2周，颗粒质量浓度为c＝6.31mg ml-1。对于光学检测，使用光学干涉检测系统(RI)(5(a))，并在和处跟踪吸光度。在实验中，储存的储备样品被稀释到NDDS1的浓度为c≈1.88mg ml-1。(a)-(c)中的实线表示在10,000rpm下的第一次测量，虚线表示在第一次实验实行后，振摇细胞后以10,000rpm进行的测量，目的是在每个细胞中重新建立浓度平衡。(d)表示对于在测量当天制备的NDDS1样品，在 下，颗粒(实心圆圈)和SN等于游离药物(空心圆圈)的RI强度和吸光度，以及在(实心三角形)下的RI强度和吸光度与制备的NDDS1溶液浓度的关系图。
图6示出了在类似NDDS1样品浓度为c≈1.88mg ml-1下，NDDS1样品在水中、培养基(CM)和添加血清的培养基(CMS)中沉降系数的微分分布ls-g*(s)。测量在10,000rpm下进行。
图7示出了在NDDS1存储时间内溶液中不同组分在下的UV信号强度图，该不同组分包括较大的未定义聚集体、持久性主要纳米颗粒(NP)群中的药物和上清液(SN)溶液中的药物(图7(a))，储存10周后系统崩溃(由虚线表示)。(b)表示在下对应于溶解在以下的水中的药物的吸光度图：溶解在纯水中(灰色方块，空心：第一次测量，实心：重复)和溶解在含有表面活性剂PVA的水中(灰色圆圈，空心：第一次测量，实心：重复)，该表面活性剂PVA用于NDDS1配方(圆圈)。还示出了完全降解的溶液在c＝1.26mg ml-1下，在T＝37℃的温度下储存7周并稀释至所示浓度范围(黑色实心圆圈)的检测器响应，而黑色实心方块对应于NP中包封的药物。
图8示出了向已降解的NDDS1溶液(实心圆圈)中添加药物，以及用于在 (空圆圈)下进行检测的相应波长下的回收率检查。
图9示出了在T＝4℃和T＝37℃下储存一晚后，使用光学干涉检测系统(RI)以及在和处跟踪吸光度的NDDS2(c＝0.83mg ml-1)的沉降系数的微分分布ls-g*(s)(9(a)，在c＝4.29mg ml-1下储存)。(b)示出了位于纳米颗粒(NP)和上清液(SN)中的药物的百分比值。
图10示出了在NDDS配方和不同存储条件后的不同时间尺度上，使用干涉式光学检测系统(RI)以及在和处跟踪UV吸光度的NDDS2(在c＝4.29mg ml-1下储存，在c＝0.83mg ml-1下测量)的沉降系数的微分分布ls-g*(s)。对于这些实验，AUC以10,000rpm旋转。(10(a))在4℃下储存1天和15天，(10(b))在37℃下储存1天和15天。以下的图示出了实验过程中，特别是上清液(SN)中以42,000rpm的速度沉淀的PVA的存在过程中记录的所有检测器强度。
图11示出了用于NDDS配方的PVA的RI信号强度。对于这些实验，沉降速度实验在42,000rpm的转子速度下和在T＝20℃的温度下进行24小时。ls-g*(s)模型已用于通过绘制与溶液浓度相关的干涉条纹(interference fringes)来确认RI检测器的线性度。
图12示出了在NDDS配方和储存在T＝4℃后的不同时间尺度上，使用干涉式光学检测系统(RI)以及在和处跟踪UV吸光度的NDDS2(在c＝4.29mg ml-1下储存，在c≈0.83mg ml-1下测量)的归一化的沉降系数的微分分布ls-g*(s)。(b)表示所有检测器在不同时间尺度下储存后的信号强度，(c)表示在人血清(40％水/60％血清，w/w)中以的波长发生沉淀时观察到的不同NDDS2群，以及(d)表示相对于NDDS2溶液浓度，在处沉降系数的微分分布ls-g*(s)下的面积。
图13示出了考虑到溶剂的密度和粘度以及颗粒的偏微比容，NDDS2(在c＝4.29mgml-1下储存，在c≈0.83mg ml-1下测量)在水中(实线)和人血清(虚线)中的固有沉降系数的微分分布ls-g*([s])。
图14示出了两个不同批次NDDS的固有沉降系数的微分分布ls-g*([s])：在水中测量，SDL_NP 4.1(虚线)和SDL_NP 4.2(黑线)。这些颗粒的靶向染料(例如DY635)的浓度不同，在SDL_NP 4.1中为33.7μg/mL，在SDL_NP 4.2中为2.6μg/mL。两个批次分别在c＝1mg/mL下测量，并且所述测量在T＝20℃、n＝7500rpm下进行20小时。
图15示出了在55w％人血清中，在λ＝369nm处进行吸光度检测的SDL_NP4.2在c＝0.498mg/mL(灰色虚线)、c＝0.746mg/mL(灰色线)、c＝1.068mg/mL(黑色虚线)、c＝1.531mg/mL(黑线)下的沉降系数的微分分布。用灰色粗虚线标出的沉降系数为27S左右的主要组分是55w％人血清，所述55w％人血清的沉降系数微分分布用黑色虚线表示。
图16A示出了在55w％人血清中，在λ＝635nm(GC-33)处进行吸光度检测的SDL_NP4.2在c＝0.498mg/mL(黑线)、c＝0.746mg/mL(黑色虚线)、c＝1.068mg/mL(灰线)、c＝1.531mg/mL(灰色虚线)下的沉降系数的微分分布。沉降系数约为27S时分布的主要成分是(55w％)人血清，如图14所示，用灰色粗虚线表示。为了进行比较，纯水中的c＝0.994mg/mL的SDL_NP4.2用黑色虚线表示。在图16B中，示出在λ＝635nm处测量的光密度相对于不同浓度(以mg/mL计)的相应的线性相关性。
具体实施方式
图1示出了示意性方案，其用于根据不同的参数和理化性质来表征未知的复合NSS。该示意性方案参考了本发明的方法的初始步骤，即生成多维沉降分析图。因此，术语“未知NSS”是指除了已知浓度的已知组分之外还包含基质(例如PLGA)的NSS，其中使用AUC方法尚不能表征完整系统和相应组分的理化性质。在该示例中，感兴趣的NSS是一个复合结构，包括以下组分：基质(未单独研究)、药物、靶向部分、稳定剂(表面活性剂)和可选的一种或多种添加剂。此外，NSS悬浮/溶解在溶剂中。在不同的NSS条件下(复杂参数：降解动力学，这取决于温度、pH等)，使用不同的测量参数，例如光学检测(在处描述为：吸收率、折射率)和转子速度(rpm)，对完整NSS和NSS的每个组分的浓度系列进行AUC。如上所述，密度是一个复杂参数(如参数“降解动力学”)，其与NSS的偏微比容成反比，并且可以例如通过使NSS在溶剂梯度中进行AUC直至与溶剂达到平衡的AUC沉降平衡技术得出。可替代地，颗粒的密度可以使用颗粒在(已知)不同密度和粘度的两种溶剂(例如，D2O/H2O的混合物)中的沉降系数来测定，并分别通过其倒数、密度计算偏微比容。溶剂和悬浮的NSS的粘度可以通过测量来确定；或者，它可以来自参考表等。对于未表征的NSS(“未知系统”)，完整的NSS及其主要成分必须进行AUC分析，以生成多维沉降分析图。为了完全表征示例性NSS，必须解析图1中以实线、虚线和点虚线(19个链接)表示的所有“链接”，其中对于例如降解动力学、密度和光学检测的参数，AUC的实验分辨率是必需的。从完整的NSS及其组分的AUC测量的稀释系列(例如NSS的沉降系数值/参数/浓度系列)生成多维图。根据测量结果，可以推导出NSS的理化性质，即与大小、质量和浓度、组分、完整性和稳定性以及NSS聚集体相关的特性。一旦导出，感兴趣的NSS就是已表征的NSS(“确定和验证”)。为了解析一侧的NSS及其组分与另一侧的参数之间的链接，只需要有限数量的AUC测量，即可以在一个AUC实验(“运行”)中解析多个链接。例如，降解动力学可以通过在不同的光学检测条件(吸光度、折射、发射)下同时测量样品来评估。
在图2(a)-(c)中的示意性方案举例说明了表征未知NSS和部分已知NSS样品所需的步骤。在完全未知的NSS的情况下，必须执行图1的示意性方案。
图2(a)示出了表征NSS样品，特别是NDDS样品的示意性方案，其中“NDDS”是指纳米级药物输送系统，其是另外包含药物的NSS。然而，所示出的NDDS样品与已确定的NDDS仅部分相同。特别是，NDDS包含与上述实施例(见图2(a))相同的主要组分，但在药物和靶向部分方面有所不同。为了确定该NDDS样品的理化性质，即为了表征或鉴定特定的NDDS，只需解析有限数量的链接(7个链接，显示为粗实线和粗虚线)。如图所示，必须解析新NDDS与一侧的药物成分和靶向部分以及密度、粘度和光学检测(在描述为：吸收和折射)这些参数之间的链接，使得所需的AUC测量值显着降低。通过将完整的NDDS及其可能成分(例如，药物、靶向部分)的沉降系数值/参数/浓度系列映射到多维沉降分析图上，可以高精度且及时地确定样品中所含NDDS的理化性质。
在图2(b)中，示出了用于表征基于金纳米棒的NSS(无载药量)样品的相同示意性方案。含有金纳米棒的样品在悬浮介质方面不同于已确定的金纳米棒NSS。例如，源自患者的NSS样品可能需要表征，需要对患者特异性介质(血液或其稀释液)进行表征，以从多维沉降分析图中推导出理化特性，这不包括患者特异性数据(出于普适性的原因)。为了表征样品，只需要解析将NSS及其组分与可选参数联系起来的6个链接，其中所述链接与基质(金纳米棒)和溶剂有关。因此，为了表征感兴趣的NSS样品，确定NSS样品的理化性质所需的单独AUC测量的数量得到明显限制。
相应地，图2(c)中的示意性方案举例说明了基于脂质体的NDDS样品(未知基质)，该基于脂质体的NDDS样品携带已知靶向部分并含有已知包封药物(＝NDDS)，但其在稳定组分(表面活性剂)方面以及关于添加剂组分方面有所不同。为了表征样品，只需要解析将实验参数与新系统和那些组分连接起来的8个链接，这与已确定和验证的NDDS(多维沉降分析图所基于的)不同。同样，为了表征包含感兴趣的NDDS的样品，确定NDD样品的理化性质所需的单独AUC测量的数量得到明显限制。
因此，一旦已确定并验证了基础的NSS系统及其组分，本发明的方法便能够对NSS样品进行精确且快速的表征。该系统还可用于方便地研究现有的已确定和验证的NSS系统的修改，其中修改仅涉及NSS的组分。这样，本发明的方法还可用于新的NSS种类的设计和测试。
实例
仪器
使用ProteomeLab XL-I分析型超速离心机(Beckman Coulter Instruments,Brea,CA)进行沉降速度实验，该分析型超速离心机使用具12mm光程长度的双扇区环氧树脂(epon)中心件。将细胞放置在An-50 Ti八孔转子中。通常，在将AUC加速到3,000rpm并加速52分钟后立即进行沉降速度曲线扫描。随后，将10,000rpm的转子速度用于NSS沉降速度实验。在实例中，42,000rpm的转子速度用于解析剩余的上清液(SN)，特别是PVA的更多细节，这也是通过42,000rpm的沉降速度实验进行研究。事实上，沉降方案可以通过选择1,000到60,000rpm或更高的速度来简单地适应单个NSS。用约440μl的样品水溶液填充细胞和用约420μl的H2O或D2O/H2O填充细胞作为参考。实验以10,000rpm的转子速度进行10小时，然后将细胞从离心机转子中取出，振摇并进行相同的程序。在第二轮离心之后，在一些实验中，将离心机加速到42,000rpm。所有沉降实验均在T＝20℃的温度下进行。用光学干涉(折射率(RI))和吸光度检测系统(在和下)以12分钟的时间间隔记录沉降曲线扫描。
使用DMA4100密度计(Anton Paar，Graz，Austria)在T＝20℃下测定用于沉降速度实验的溶剂、混合溶剂、含有和不含人血清的培养基以及人血清的密度。
溶剂、混合溶剂、不含(CM)和含人血清(CMS)的培养基以及人血清(HS)的粘度，根据其在颗粒稀释情况下的浓度，使用自动微粘度计(AMVn,Anton Paar,Graz,Austria)在T＝20℃下通过毛细管/球组合以50°的毛细管倾斜角进行测定。
数据分析
使用ls-g*(s)模型，即通过最小二乘边界建模和Tikhonov-Phillips正则化方法并通过假定非扩散物质，选择合适的扫描以使用SEDFIT进行数据评估。该模型使得沉降系数s具有明显的微分分布。分布的各自积分用于通过微分沉降系数分布的积分来估计沉降系数s和浓度c的信号(重量)平均值。
NSS或NDDS、VNSS或VNDDS的偏微比容，以及它们的密度或按照等人的描述确定(W.L.“Analytical Ultracentrifugation of Polymersand Nanoparticles”,Springer,Berlin,2006)。为此，测量了进行NDDS沉降速度实验的水和D2O/H2O的各自混合物的密度和粘度。使两种溶剂中的固有沉降系数[s]相等并解析为偏微比容νNDDS，得出以下等式：
其中s1是NDDS在水中稀释的沉降系数，η1是水的粘度，ρ1是水的密度。与用水稀释相比，用D2O稀释的目的是获得类似的NDDS溶液浓度。
NDDS
细胞培养基，Dulbecco’s MEM(DMEM，含有1.0g L-1D-葡萄糖)购自Biochrom(德国，柏林)。人血清购自Sigma Aldrich(从人类男性的AB型血浆中获得，来源于美国，无菌过滤)。
纳米级药物输送系统(NDDS)由SmartDyeLivery GmbH(德国，耶拿)提供。NDDS由聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)组成，该共聚物用靶向染料单元和包封药物功能化。所提供的溶液中的NDDS载体系统还包含用于NDDS配制过程的表面活性剂聚乙烯醇(PVA)。NDDS和用于NDDS配方的表面活性剂PVA是通过具有以下特征的材料转让协议(materials transferagreement)收到的：
NDDS1(示例1和示例2)由部分被靶向染料部分功能化的可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)组成，它携带包封的药物，并且通过由于其制备过程而部分掺入NDDS中的表面活性剂稳定在溶液中。NDDS1总浓度为6.31mg ml-1，总药物含量为167μg ml-1，总PVA浓度为1.90mg ml-1，总容积为30ml。
NDDS2(示例3和示例4)由部分被靶向染料部分功能化的可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)组成，它携带包封的药物，并且通过由于其制备过程而部分掺入NDDS中的表面活性剂稳定在溶液中。NDDS2总浓度为4.29mg ml-1，总药物含量为162μg ml-1，总PVA浓度为1.28mg ml-1，总容积为30ml。
示例1：AUC的概念适用性
图3示出了在NDDS1的处监测的沉降速度实验期间的初始扫描和沉降曲线的变化，代表包封的药物(图4)。实验在10,000rpm下进行16小时。NDDS1在室温下储存两周(图3(a))以及在相同条件下储存10周(图3(b))，并稀释至大约c≈1.26mg ml-1的浓度。使用ls-g*(s)方法，即通过最小二乘边界建模和Tikhonov-Phillips正则化方法并通过假定非扩散物质，对实验曲线(灰色方块)进行分析。该模型使得沉降系数s具有明显的微分分布，代表沉降种类的群体(见下文)。在这两种情况下，以实线(上部)显示的沉降速度曲线的数值解很好地代表了实验，从各自的残差图(下部)可以看出，仅显示几个百分点的波动。从图3也可以清楚地看出，NDDS1群迁移到细胞底部后的剩余吸光度(A)，与在相同储存条件下仅储存两周相比，在室温下储存10周的NDDS1的剩余吸光度(A)更大。同样，也可以看到聚集体。在NDDS1的相同储存条件下，两周不存在这些聚集体(见图3中的黑色实线和虚线)。
刚刚描述这组的实验是在制备和纯化后(几乎没有储存)新鲜接收的NDDS1下，以及在室温下以c＝6.31mg ml-1的浓度储存两周后接收的NDDS1下，通过多重检测(即，在两种波长下的RI和吸光度)进行的。新鲜的样品和储存的样品在c＝0.63–1.88mg ml-1的浓度范围内进行适当稀释，以及进行(i)通用RI检测，(ii)在波长 下的吸光度检测，代表包封药物(图3、图4)，和(iii)在波长下的吸光度检测，代表靶向染料功能的分析(图4)。在第15天，将一份以浓度c＝1.26mg ml-1制备的NDDS1样品在T＝37℃下储存。
AUC实验的优点是保留了封闭扇形单元容积中的质量平衡。图5示出了在两周的储存步骤中，从新鲜制备的NDDS1样品开始，c≈1.88mg ml-1的颗粒的沉降系数的微分分布ls-g*(s)的变化。进行RI检测(图5(a))以及在下的吸光度检测，代表包封药物(图5(b))，以及在下的吸光度检测，代表靶向染料功能(图5(c))。实线代表在10,000rpm的第一次沉降循环中的实验，之后将细胞从离心机转子中取出并振摇，以实现沉降物质的重新悬浮。之后，在完全相同的条件下进行另一次沉降速度实验，然后进行相应的沉降分析(虚线)。所有实线和虚线都非常相似，表明在特定存储时间使用溶液获得的结果具有可重复性。事实上，RI和吸光度检测的所有曲线在沉降系数的平均分布ls-g*(s)以及它们的存储时间趋势方面都显示出相似的外观。实验是可重复的，还表明10,000rpm的沉降不会显着影响颗粒完整性和NDDS1的估计信号强度(参见实线和虚线)。还表明，在室温下两天(进行实验的时间尺度)，在守恒质量平衡下溶液性质的变化几乎无法追踪。更明显的是，药物和靶向染料位于沉降颗粒群中，因为吸光度检测的分布(图5(b)和(c))与通用RI检测(图5(a))的分布几乎相同。另一个有趣的观察结果是NDDS1在室温下储存两周后平均沉降系数明显增加。在所有检测模式中，进一步储存主要降低了沉降系数微分ls-g*(s)曲线下的表观面积(见下文)。图5(d)清楚地表明，所有检测器都与NDDS1浓度呈线性对应，所有检测器包括通过RI观测NDDS1群，在 下观测NDDS1中的包封药物，以及在下观测位于NDDS1中的靶向染料。还证实了在下存在少量游离药物保留于上清液(SN)中。这些结果清楚地支持了当分散在水中时，以非常重复的方式对NSS的单个浓度、包封药物和NSS的靶向染料功能进行定量评估的创造性想法。
通常，溶液中的NSS由流体动力学等效球的大小来描述，即它们的流体动力学直径：dh，NSS。基于实心球概念，dh，NSS可通过以下关系获得：(来自沉降速度实验)，其中υNDDS是NSS的偏微比容，以及是由溶剂粘度η0和溶剂密度定义的固有沉降系数。在一阶近似中，υNSS与NSS密度成反比，并且是NSS大小估计所需要的。它是通过仅在水中稀释的颗粒NSS群的沉降速度实验来估计的，但是也可以通过在己确定其密度和粘度的D2O中稀释的颗粒NSS群的沉降速度实验来估计。NDDS1的偏微比容为υNDDS＝0.76cm3g-1，因此它们的密度的值接近己知的PLGA体积密度。
图6示出了ls-g*(s)分布，其来自在水中进行的沉降速度实验，以及来自在初始NDDS1制备后在没有和具有人血清(10wt％)(CMS)的培养基(CM)中进行的沉降速度实验。在处使用吸光度检测证明了研究用于NDDS1群的这些溶液条件的可行性(图6)。沉降系数的微分分布ls-g*(s)在整体吸光度强度降低时转移到稍大的值，与CM的值相比，CMS的值更大。同样，与单独的CM不同，即使在用于NDDS1沉降的10,000rpm的这种相对较低的速度下，也可以看到来自血清蛋白的低于10S的较小沉降系数的独特群体。与在水中稀释相反，在CM和CMS中进行沉降实验后，振摇溶液会增加完全溶液(complete solution)重建的难度。可能，CM中的蛋白质成分(如胰岛素)和CMS中的蛋白质成分与人血清白蛋白支持NDDS对细胞底部离心的固结。对NDDS1特性的了解以及NDDS的偏微比容υNDDS在不同流体中不发生变化的假设也表明CM和CMS中的颗粒平均略大，之后再次确认的另一批NDDS的观察结果涉及在人血清(HS)中进行的实验。总而言之，考虑到定量考量，已经证明多重检测概念对于观察NDDS群的沉降非常有用，各个检测器(RI和A)对浓度具有理想的线性度(图5(d))。同时，其表明沉降速度实验，以及NDDS群在更现实的条件(如CM和CMS介质)下的各自行为是可行的。
示例2：定量获取粒子完整性和降解
本发明人进一步关注用于治疗目的的包封药物。图7示出了处的信号强度在三个月的时间尺度上的演变，包括每次沉降速度实验后的重复测量(由小符号表示)。为此，利用图5(b)的积分分布(ls-g*(s))，表示NDDS1中的药物，以及剩余的SN(例如图3和图5(d))。图7中的几个特征是显而易见的。最初，与NDDS1相比，在SN中观察到的游离药物量很低。储存后，NDDS1中的药物量随着SN中游离药物的增加而显着减少。例如，NDDS1在环境温度下储存两周后，20％的药物已进入颗粒周围的液体，同时颗粒实体的信号强度降低了20％。还观察到在NDDS1储存的前两周没有聚集体(另参考图3(a))，但颗粒大小明显增加，可在ls-g*(s)分布中看到，转变为更大的沉降系数值(图5(a)-(c))。允许在室温下进一步不受控制的NDDS1降解，使得在环境下储存4周后观察到聚集体。这些在储存10周时出现非常明显(另参考图3(b))。将与药物相关的所有信号(聚集体、NDDS、SN)相加显示，在长达10周的储存期间，复合降解溶液中的定量恢复，即质量平衡的整体正确性，而最关键的系统组分(即，药物)没有明显损失。储存10周后，观察到NDDS悬浮液底部的固体物质，其即使剧烈涡旋和摇晃也无法重新悬浮。在NDDS1存储的这个时间尺度上，降解使大量NDDS1失去特性(identity)，通过形成不溶性的、不确定的物质从溶液中沉淀析出。值得注意的是，通过纳米沉淀形成的NDDS位于亚稳态区域，该亚稳态区域由于溶液中配方的变化，特别是通过降解，可能会通过聚合物从溶液中沉淀形成水不溶性聚合的聚合物组分而接近NDDS的能量最小值。
为了验证图7(a)所隐含的表观定量情况，以及药物显示出较差的水溶性的看法，进行了额外的对照实验。目标是在添加和不添加用于NDDS1制剂的表面活性剂聚乙烯醇(PVA)的情况下将药物溶解在水中。在这两种情况下，在处，AUC细胞中的信号强度对浓度的反应较差(图7(b))。这伴随着在填充AUC细胞之前在烧瓶底部沉淀的固体药物材料的目视观察。这些实验还表明，在图3(a)和图7(b)中，SN中游离药物在处的显著高的信号强度源于药物溶解度的提高。这种情况的唯一可能来源是PLGA降解产物的存在，PLGA是一种聚合物，看起来非常适合通过纳米沉淀包封疏水性药物。虽然NDDS中的药物与浓度呈线性对应，但对于完全降解的样品，在T＝37℃的温度下以c＝1,26mg ml-1的浓度储存7周，也观察到了这一点，如下文所述。对浓度的响应非常相似(NDDS中的药物与完全降解溶液中的药物，图7(b))表明在处两种情况下药物的吸收率相似。将溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的药物加入到已知药物浓度的溶液中(图8)，同时保持每个加标样品(spiked sample)中DMSO与水的比例恒定，显示出加标量药物的定量回收。记录的信号强度实际上合并在已建立的信号强度-浓度的关系中(图8)。
因此，图7(a)是现存药物(在聚集体中，包封在NDDS1或SN中)的定量表示，即，已经证明了在(i)潜在聚集体、(ii)NDDS1、(iii)周围液体(即，SN)中的游离药物以及(iv)对颗粒降解的机理洞察(mechanistic insight)中定量地获取载药的机会。这种情况也可能与NDDS1大小的第一次轻微增加，然后在相似密度下平均大小进一步减少(即，它们的降解)有关。所有这些洞察都是由多重检测AUC的单一仪器基础提供的。
示例3：储存条件研究
通过用于所述发明目的的AUC定量效用的关于NDDS1的上述实验，另一批NSS(NDDS2)用于获得不同的洞察。制备后，将该样品在T＝4℃和T＝37℃的不同温度下，以及c＝4.29mg mL-1的浓度下储存。还显示了检测器响应的知识，以允许在处对位于NDDS和周围液体中的药物浓度进行定量估计(图7)。 的波长的出现代表了靶向染料(图4和图5)，而通用RI检测广泛适用于支持所有观察到变化的沉降NDDS群的观察。
图9(a)清楚地表明，在冰箱中在T＝4℃和T＝37℃下储存一晚的NDDS2等分试样的溶液外观已经不同，即储存在T＝37℃下的NDDS2群显示出比储存在T＝4℃下更大的平均沉降系数。这与以下情况一致：在储存和潜在降解时，沉降系数和表观流体动力学直径dh，NDDS的平均值增加，如NDDS1所示。位于NDDS2和SN中的药物百分比的估计如图9(b)所示。结果也再次证实了这批NDDS2伴随着药物从NDDS的释放及其在储存一夜后存在于周围液体中，在T＝37℃更是如此，而在T＝4℃时则不然。
图10使用了所有检测器响应，并且示出了即使在T＝4℃下NDDS2储存15天后，来自RI和UV检测器的单个信号在和仍保持不变，包括SN中的游离药物(图10(a)下部)。因此，这样的条件适用于NSS的长期储存，而不会影响其完整性和载药量。经过16h的沉降实验，观察NDDS2群，AUC加速到42,000rpm，允许进一步细化应包含PVA作为用于NDDS配方的较小胶体物质的现存SN。在这种情况下，可能来自PVA的类似的RI强度在T＝4℃时很明显。用于配制NDDS2并溶解在水中的不同浓度PVA的对照实验明显地支持了这一考虑(图11)。已建立的信号强度-浓度关系允许测量SN中的PVA聚合物浓度，反之亦然，也可以测量与NDDS相关的PVA量。
在T＝37℃下储存15天(图10(b))确实导致严重降解。通过RI信号强度的显着降低、NDDS2群中在处的吸光度及其在SN中的明显观察(图10(b)，下部)，可以清楚地识别出这种降解，结果与NDDS1颗粒的结果非常一致(图5)。随着RI强度和在处的吸光度的显着降低，与NDDS2中在处测量的染料相关的信号强度也降低，这种情况再次与NDDS1的情况相当(图5C)。虽然药物的最大吸光度与其位置无关(在NDDS、聚集体和SN中，参见图7b)，但观察到NDDS2中染料信号的明显损失，而其在SN中没有明显表现。虽然染料在DMSO中的最大吸光度位于但观察到溶剂致变色波长下移到在水中的最大吸光度位于(图4)。这支持了NDDS降解后染料信号的明显损失。
此外，在NDDS2沉降后以42,000rpm的速度旋转离心机，清楚地表明SN中存在的PVA浓度增加(图10b，下部)，这种情况与假设它在配制过程中部分掺入颗粒并充当表面活性剂的情况一致。当NDDS暴露于含蛋白质的介质时，它还可以通过防止聚集并产生类似隐形(stealth-like)效应来保持整体NDDS的完整性(见下文)。在NDDS2降解的适当过程中，额外的PVA进入自由溶液状态。
示例4：人血清实验
图12(a)突出了NDDS2在T＝4℃下以15天的时间尺度储存的归一化的沉降系数分布ls-g*(s)在所有检测模式(RI、在和下的吸光度)中几乎无法区分，这也得到非常相似的绝对信号强度的支持(图12(b))。
9天后，在T＝4℃下储存的NDDS2样品用人血清稀释，使得液相和血清的比例(40/60，w/w)保持相同但NDDS2浓度不同。不出所料，观察到光密度的整体增加。尽管如此，在的波长下，允许追踪NDDS群的波长实际上与和RI检测的波长相同(NDDS1的图5和NDDS2的图10)，用于观察NDDS2群。有意思的是，如图12(c)所示，增加的NDDS2浓度对应于处的更高信号强度。同时，较小沉降系数的分布相当不明确。即使在10,000rpm的相对较低的速度下，这些也可能与相当大的血清成分的沉降有关。ls-g*(s)分布的积分使得浓度依赖性再次高度线性化(图12(d))。血清沉降物中的所有NDDS2群都比水中的NDDS2群稍慢。与水相比，人血清的粘度增加充分证明了这一点。凭借手头的液体介质各自的密度和粘度，发明人能够建立固有的沉降尺度[s]，其中，(见图13)。υ是在cm3g-1中的NDDS的偏微比容(见上文)。
事实上，NDDS2的固有沉降系数的微分分布ls-g*([s])转移到稍大的值，但对分布宽度有一定影响。根据ls-g*(s)分布的重均沉降系数计算出的流体动力学直径分别计算出，在水中，dh＝17nm，在人血清中，dh＝18nm。这些结果表明，虽然颗粒没有失去其完整性，但它们的表观流体动力学有效尺寸仅略有增加。HS中NDDS2完整性的维持看来源于NSS配方中使用的PVA的“类似隐形”效应。这些创造性的方法和实验结果证明了在最接近预期的现实生活条件的条件下(即在人体体液中)对医用NSS进行原位和定量评估的机会和本发明。
使用两个不同批次的NDDS对人血清进行进一步研究：SDL_NP 4.1和SDL_NP4.2，它们首先在水中进行表征，然后在人血清中进行原位表征。在T＝20℃和n＝7500rpm的AUC下制备和测量纳米颗粒浓度介于0.5至1.5mg/mL之间的样品，其中该样品包含总体55w％的人血清，并在处进行折射率和吸光度检测，即与水中的实验相同。首先，两个不同批次NDDS(SDL_NP 4.1和SDL_NP 4.2)的固有沉降系数的微分分布ls-g*([s])在水中测量/测定。这些颗粒的靶向染料DY635的浓度不同，在SDL_NP 4.1中为33.7μg/mL，在SDL_NP 4.2中为2.6μg/mL。
更多的表征在表1中总结如下：
表1：NDDS的SDL_NP 4.1与SDL_NP 4.2NDDS表征。
两个批次分别在c＝1mg/mL下测量，并且测量在T＝20℃、n＝7500rpm下进行20小时(图14)。显然，根据折光率检测器，与具有较低DY635浓度的样品相比，具有较高DY635浓度的样品的沉降系数的微分分布的分布更为广泛。这种情况定性地证实了关于两个样品分散度增加的DLS结果，由增加的PDI反映(表1)。根据DLS，SDL_NP 4.1的PDI为0.079，反映在AUC结果中的分布相对较窄，而SDL_NP 4.2的PDI为0.138(根据DLS)表明分布较广。此外，基于DLS的Z平均(Z-Average)结果(表1)的两种纳米颗粒之间的16.9nm尺寸差异反映在AUC结果中微分沉降系数分布的不同最大值。因此，与SDL_NP4.1相比，SDL_NP4.2的分布转移到更高的平均沉降系数。
图15示出了SDL_NP 4.2在不同浓度下沉降系数的微分分布，所述不同浓度即c1＝0.498mg/mL、c2＝0.746mg/mL、c3＝1.068mg/mL、c4＝1.531mg/mL，其在55w％人血清中测量以及在λ＝369nm处进行吸光度检测。为每个浓度的SDL_NP 4.2获得的沉降系数的差异分布揭示了以约27S为中心的分布，其可能代表人血清成分。对纯55w％人血清的测量也通过在27S处出现的分布峰值进行确认。此外，每个浓度在50S到300S之间出现了更广泛的分布。此外，通过从λ＝396nm记录的沉降速度获得的指定峰值最大值的分布中，仅略可观察到不同浓度的样品。由于背景光密度相对较高，必须选择新的波长，以便在NSS纳米粒子的研究中提供足够的信号强度(相对于背景)。由于靶向染料(DY635)在λ＝635nm处有特定的吸光度最大值，因此确定由折射率和吸光度测量测定的分布在携带DY635的纳米粒子中紧密重叠，表明沉降系数的微分分布类似。SDL_NP 4.2在上述四种不同浓度下沉降系数的微分分布在55w％人血清中测量，以及在λ＝369nm处进行吸光度检测，所述不同浓度即c1＝0.498mg/mL、c2＝0.746mg/mL、c3＝1.068mg/mL、c4＝1.531mg/mL。结果示出在图16A中，显示了使用吸光度检测可区分不同的纳米颗粒浓度。吸光度强度随着浓度的增加而升高。通过将每个样品的纳米颗粒浓度(从增加的检测器响应中看出)与λ＝635nm处的相应测量光密度作图，可以确定信号强度的线性度及其浓度依赖性(图16B)。与图15相比，由于人血清成分，在大约27S处观察到一个峰值，而覆盖30S至400S之间的沉降系数的分布对应于所分析的纳米颗粒。通过在λ＝635nm处使用吸光度检测，55w％人血清中的纳米颗粒得到了令人满意的分离。在生物流体中检测到不同的纳米颗粒浓度，反映了这些药物输送系统(即，NSS)的应用条件。测量结果进一步揭示了在含人血清的介质中分析的纳米颗粒的完整性和可比性，这对于医学/药学应用至关重要。特别是，55w％人血清与水中样品的微分沉降系数分布的比较建立了表观相似性，从而可以在未来的测试接近应用现实的纳米颗粒悬浮液的稳定性条件。此外，关于表观微分沉降系数分布，纳米粒子SDL_NP4.1和SDL_NP4.2的相同性质的证明也表明，具有较低染料浓度的例如所述DY635的纳米粒子将在人血清中表现出相同的完整性。
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