具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例提供了一种从鲜蒜中提取含硫物质和大蒜素的方法，包括以下步骤：

S1、大蒜素提取液制备：鲜蒜去皮清洗后粉碎成蒜泥，并采用提取溶剂提取后过滤，得到大蒜素提取液；

S2、内源酶转化：在不同温度和pH条件下，转化所述大蒜素提取液，得到含有含硫物质和大蒜素的反应液；

S3、含硫物质和大蒜素的制备：所述含有含硫物质和大蒜素的反应液通过大孔树脂后，利用不同的洗脱剂依次进行洗脱，并分别收集大孔树脂洗脱液，再经浓缩干燥处理后，制得所述含硫物质和大蒜素；

其中，所述含硫物质包括S-烯丙基-L-半胱氨酸和S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸。

在上述技术方案中，本发明提出了一种从鲜蒜中提取含硫物质和大蒜素的方法，该方法利用鲜蒜内含不同GGT转化酶(即谷氨酰转肽酶)，在不同的温度和pH条件下的活力不同、转化前体不同的原理，通过调节温度、pH等条件，分别将大蒜内的GSAC，GS1PC，GSAMC进行转化，进而得到含有S-烯丙基-L-半胱氨酸、S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸和大蒜素的反应液，再经树脂吸附、洗脱、干燥等处理后，最终制备得到三种高附加值的大蒜提取物产品。

在一优选实施例中，在所述内源酶转化步骤中，S-烯丙基-L-半胱氨酸的转化条件为25-35℃、pH＝4-5，保温2-6h，S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸的转化条件为55-65℃、pH＝5.5-7.5，保温1-3h。

在上述优选实施例中，本发明在鲜蒜内含不同GGT转化酶(即谷氨酰转肽酶)，在不同的温度和pH条件下的活力不同、转化前体不同的原理下，通过大量筛选试验，最终优化得到一整套适用于S-烯丙基-L-半胱氨酸和S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸的转化体系，利用该转化体系转化得到的物质具有品质好、纯度高等特点。

在一优选实施例中，在所述大蒜素提取液制备步骤中，所述提取溶剂为pH＝6.0-7.0的纯化水，所述提取溶剂与鲜蒜的重量比为(5-10):1。

在一优选实施例中，在所述含硫物质和大蒜素的制备步骤中，大孔树脂为高比表面积树脂，其比表面积为1000-1200m²/g。

在上述优选实施例中，本发明在进行含硫物质和大蒜素的制备过程中，选用高比表面积树脂的原因在于：传统氨基酸类分离主要采用阴阳离子交换树脂，但是阴阳离子交换树脂无法吸附大蒜素类硫代亚磺酸酯；由于普通大孔吸附树脂的比表面积不足，导致其吸附含硫物质和大蒜素不充分。而使用高比表面积的活性树脂吸附更充分，不仅能同时吸附含硫物质和大蒜素，还能有效减少树脂用量，并且后续仅通过不同浓度酒精溶液即可实现分离。由此可见，与传统阴阳离子交换树脂相比，本发明实施例选择高比表面积的树脂能有效减少再生过程中酸碱的消耗，同时节约了再生的时间，提高了效率。

在一优选实施例中，在所述含硫物质和大蒜素的制备步骤中，所述含有含硫物质和大蒜素的反应液通过大孔树脂的流速为2-6柱体积/小时。

在一优选实施例中，在所述含硫物质和大蒜素的制备步骤中，当洗脱产物为S-烯丙基-L-半胱氨酸时，所用洗脱剂为5-50％乙醇水溶液，洗脱体积为2-6柱体积，洗脱速度为1-3柱体积/小时。

在上述优选实施例中，在洗脱S-烯丙基-L-半胱氨酸时，选用5-50％乙醇水溶液作为洗脱剂的原因在于：相较于甲醇和丙酮，乙醇的气味和毒性相对比较小，乙醇极性相对甲醇和丙酮小，洗脱强度更大，能有效减少乙醇有机溶剂的用量。S-烯丙基-L-半胱氨酸在树脂中被吸附，根据极性相似相溶，5-50％乙醇水溶液能有效将S-烯丙基-L-半胱氨酸充分解析。

在一优选实施例中，在所述含硫物质和大蒜素的制备步骤中，当洗脱产物为S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸时，所用洗脱剂为5-50％乙醇水溶液，洗脱体积为2-6柱体积，洗脱速度为1-3柱体积/小时。

在上述优选实施例中，在洗脱S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸时，选用5-50％乙醇水溶液作为洗脱剂的原因在于：相比于甲醇和丙酮，乙醇的气味和毒性相对比较小，乙醇极性相对甲醇和丙酮小，洗脱强度更大，能有效减少乙醇有机溶剂的用量，S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸在树脂中被吸附，根据极性相似相溶，5-50％乙醇水溶液将S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸充分解析。

在一优选实施例中，在所述含硫物质和大蒜素的制备步骤中，当洗脱产物为大蒜素时，所用洗脱剂为70-95％乙醇水溶液，洗脱体积为2-6柱体积，洗脱速度为1-3柱体积/小时。

在上述优选实施例中，在洗脱大蒜素时，选用70-95％乙醇水溶液作为洗脱剂的原因在于：相比于甲醇和丙酮，乙醇的气味和毒性相对比较小，乙醇极性相对甲醇和丙酮小，洗脱强度更大，能有效减少乙醇有机溶剂的用量。70-95％乙醇水溶液能将大蒜素充分解析，同时实现了大孔树脂的再生。同时，乙醇水溶液的浓度也是至关重要的，乙醇水溶液浓度过低，不能将大蒜素解析或使用的有机溶剂消耗将显著增加，乙醇水溶液浓度过高，后续生产放大实现难度增加。

本发明还提供了一种利用上述任一优选实施例所述的从鲜蒜中提取含硫物质和大蒜素的方法制备得到的含硫物质，所述含硫物质包括S-烯丙基-L-半胱氨酸和S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸；

其中，所述S-烯丙基-L-半胱氨酸的产品纯度为42.88％-44.14％，S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸的产品纯度为62.23％-63.42％。

本发明又提供了一种利用上述任一优选实施例所述的从鲜蒜中提取含硫物质和大蒜素的方法制备得到的大蒜素，所述大蒜素的产品纯度为62.2％-68.4％。

为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的从鲜蒜中提取的含硫物质和大蒜素及其提取方法，下面将结合具体实施例进行描述。

实施例1

本实施例提供了一种从鲜蒜中提取含硫物质和大蒜素的方法，包括如下步骤：

(1)大蒜素提取液制备：鲜蒜去皮清洗后粉碎成蒜泥，向蒜泥中加入5倍体积的pH＝6.0-7.0的纯化水进行提取，得到提取液，所得提取液经板框过滤后，获得大蒜素提取液；

(2)内源酶转化：大蒜素提取液于25℃、pH＝4条件下，保温2h进行大蒜内天然GSAC向S-烯丙基-L-半胱氨酸(以下简称SAC)的转化，调整转化条件，大蒜素提取液于55℃、pH＝6条件下，保温2h进行大蒜内GSAMC向S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸(以下简称SAMC)的转化，得到含有含硫物质和大蒜素的反应液；

(3)所述含有含硫物质和大蒜素的反应液经LX-68高比表面积树脂后，控制含有含硫物质和大蒜素的反应液流速为2柱体积/小时，SAC、SAMC和大蒜素吸附在高比表面积树脂上，使用10％乙醇水溶液对LX-68高比表面积树脂进行洗脱，洗脱速度为2柱体积/小时，洗脱5柱体积，收集富含SAMC的洗脱液，经浓缩干燥处理后，得到高含量的SAMC产品；

(4)使用30％乙醇水溶液对LX-68高比表面积树脂进行洗脱，洗脱速度为2柱体积/小时，洗脱4柱体积，收集富含SAC的洗脱液，经浓缩干燥处理后，得高含量SAC产品；

(5)使用70％乙醇水溶液对LX-68高比表面积树脂进行洗脱，洗脱速度为2柱体积/小时，洗脱4柱体积，收集富含大蒜素的洗脱液，经浓缩干燥处理后，得高含量大蒜素产品。

实施例2

本实施例提供了一种从鲜蒜中提取含硫物质和大蒜素的方法，包括如下步骤：

(1)大蒜素提取液制备：鲜蒜去皮清洗后粉碎成蒜泥，向蒜泥中加入10倍体积的pH＝6.0-7.0的纯化水进行提取，得到提取液，所得提取液经板框过滤后，获得大蒜素提取液；

(2)内源酶转化：大蒜素提取液于30℃、pH＝5条件下，保温4h进行大蒜内天然GSAC向SAC的转化，调整转化条件，大蒜素提取液于55℃、pH＝6.5条件下，保温3h进行大蒜内GSAMC向SAMC的转化，得到含有含硫物质和大蒜素的反应液；

(3)所述含有含硫物质和大蒜素的反应液经LSA-10高比表面积树脂后，控制含有含硫物质和大蒜素的反应液流速为4柱体积/小时，SAC、SAMC和大蒜素吸附在LSA-10高比表面积树脂上，使用20％乙醇水溶液对LSA-10高比表面积树脂进行洗脱，洗脱速度为3柱体积/小时，洗脱4柱体积，收集富含SAMC的洗脱液，经浓缩干燥处理后，得到高含量的SAMC产品；

(4)使用40％乙醇水溶液对LSA-10高比表面积树脂进行洗脱，洗脱速度为3柱体积/小时，洗脱4柱体积，收集富含SAC的洗脱液，经浓缩干燥处理后，得高含量SAC产品；

(5)使用95％乙醇水溶液对LSA-10高比表面积树脂进行洗脱，洗脱速度为1柱体积/小时，洗脱2柱体积，收集富含大蒜素的洗脱液，经浓缩干燥处理后，得高含量大蒜素产品。

实施例3

本实施例提供了一种从鲜蒜中提取含硫物质和大蒜素的方法，包括如下步骤：

(1)大蒜素提取液制备：鲜蒜去皮清洗后粉碎成蒜泥，向蒜泥中加入8倍体积的pH＝6.0-7.0的纯化水进行提取，得到提取液，所得提取液经板框过滤后，获得大蒜素提取液；

(2)内源酶转化：大蒜素提取液于35℃、pH＝4条件下，保温6h进行大蒜内天然GSAC向SAC的转化，调整转化条件，大蒜素提取液于65℃、pH＝6.5条件下，保温2.5h进行大蒜内GSAMC向SAMC的转化，得到含有含硫物质和大蒜素的反应液；

(3)所述含有含硫物质和大蒜素的反应液经XDA-200B高比表面积树脂后，控制含有含硫物质和大蒜素的反应液流速为4柱体积/小时，SAC、SAMC和大蒜素吸附在XDA-200B高比表面积树脂上，使用20％乙醇水溶液对XDA-200B高比表面积树脂进行洗脱，洗脱速度为3柱体积/小时，洗脱4柱体积，收集富含SAMC的洗脱液，经浓缩干燥处理后，得到高含量的SAMC产品；

(4)使用40％乙醇水溶液对XDA-200B高比表面积树脂进行洗脱，洗脱速度为3柱体积/小时，洗脱4柱体积，收集富含SAC的洗脱液，经浓缩干燥处理后，得高含量SAC产品；

(5)使用95％乙醇水溶液对XDA-200B高比表面积树脂进行洗脱，洗脱速度为1柱体积/小时，洗脱2柱体积，收集富含大蒜素的洗脱液，经浓缩干燥处理后，得高含量大蒜素产品。

对比例1

本对比例提供了一种S-烯丙基-L-半胱氨酸的提取方法，具体为：

(1)将洗净后的大蒜在5-50℃、pH5-10的条件下浸泡1-3d，浸泡液为0-50mmol/L的CaCl₂溶液，浸泡液的量以淹没蒜头为准；

(2)浸泡处理后的大蒜磨碎，与CaCl₂溶液形成均相反应体系；

(3)15-50℃、pH＝5-10、20-500rpm的条件下酶反应2-12h，即得富S-烯丙基-L-半胱氨酸的大蒜制品。

对比例2

本对比例提供了一种大蒜中具有浓厚味含硫物质的提取方法，具体为：

(1)称取完整无损的大蒜头，按照重量体积比1:2-10的比例加入蒸馏水；

(2)80℃-100℃加热10-60分钟，然后用组织捣碎机捣碎；

(3)继续80℃-100℃加热10-60分钟，然后5000r/min离心30分钟；

(4)取上清液，旋转蒸发浓缩到原来体积的1/4倍-1/7倍；

(5)浓缩后用强酸性的阳离子交换树脂进行分离；

(6)分离液用旋转蒸发仪浓缩到原来体积的1/4倍-1/7倍；

(7)取上清液冷冻干燥，得到灰白色粉末即所述大蒜中具有浓厚味的含硫物质；所述大蒜中具有浓厚味的含硫物质包括S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜、S-烯丙基-L-半胱氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、S-丙烯基-L-半胱氨酸、γ-L-谷氨酰基-S-烯丙基-L-半胱氨酸。

SAC、SAMC和大蒜素收率测定

本发明对上述实施例以及对比例制备得到的SAC、SAMC和大蒜素进行了收率的测定，具体测试方法及测定结果如下所示：

测试方法：

(1)大蒜素产品收率的检测方法：采用NY/T 2643-2014大蒜及制品中算蒜素的测定，具体如下：

色谱柱：C18，250mm*4.6mm，5μm，或相当规格色谱柱；

流动相：乙腈和1％甲酸溶液，梯度洗脱程序见表1；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：245nm。

表1大蒜素收率测定实验的梯度洗脱程序

(2)SAC、SAMC产品收率的检测方法如下：

色谱柱：C18，250mm*4.6mm，5μm，或相当规格色谱柱；

流动相：乙腈和水溶液，梯度洗脱程序见表2；

流速：1.0ml/min；

柱温：40℃；

检测波长：214nm

进样量：20μL。

表2 SAC、SAMC收率测定实验的梯度洗脱程序

测试结果，如表3-5所示：

表3各实施例所得SAC的收率测定结果

表4各实施例所得SAMC的收率测定结果

表5各实施例所得大蒜素的收率测定结果

由表3-5所示数据可知，鲜蒜上柱前SAC、SAMC、大蒜素含量分别为20ug/g鲜蒜、2ug/g鲜蒜、24mg/g鲜蒜，由于上述物质含量过低，上柱收率、产品含量以及干燥收率等数据均无法测得，而利用本发明实施例1-3所提供的提取方法制备得到的SAC产品的上柱收率高达81％左右，产品含量为42.88％-44.14％、干燥收率约为0.461％-0.504％；SAMC产品的上柱收率高达82％左右，产品含量为62.23％-63.42％，干燥收率约为0.164％-0.195％；大蒜素产品的上柱收率高达56％左右，产品含量为62.2％-68.4％，干燥收率为1.996％-2.197％，由此可见，利用本发明实施例提供的提取方法能够实现SAC、SAMC以及大蒜素的联合制备，且所得产品的收率高、品质佳。

内源酶转化条件筛选试验

本发明实施例为了优化得到一整套适用于鲜蒜内SAC和SAMC的转化体系，对转化条件进行了筛选试验，具体的试验方法及试验结果如下所示：

(1)SAC转化条件筛选试验：

实验条件：温度选择25℃、40℃、60℃、80℃，pH选择2、4、6、8，转化时间选择2h、3h、4h、5h、6h；

实验方法，具体包括以下步骤：

A1、鲜蒜去皮清洗后粉碎成蒜泥，向蒜泥中加入10倍体积的pH＝6.0-7.0的纯化水进行提取，得到提取液，所得提取液经板框过滤后，获得大蒜素提取液；

A2、参照上述实验条件设定的各项参数进行内源酶转化的多因素实验，并分别得到反应液；

A3、反应液通过大孔树脂后，利用洗脱剂进行洗脱，并收集大孔树脂洗脱液，再经浓缩干燥处理后，制得提取物产品，并测试提取物产品含量，具体测试结果见下表。

表6 SAC转化条件筛选试验结果统计

(2)SAMC转化条件筛选试验：

实验条件：温度选择25℃、40℃、60℃、80℃，pH选择2、4、6、8，转化时间选择1h、2h、3h；

实验方法，具体包括以下步骤：

A1、鲜蒜去皮清洗后粉碎成蒜泥，向蒜泥中加入10倍体积的pH＝6.0-7.0的纯化水进行提取，得到提取液，所得提取液经板框过滤后，获得大蒜素提取液；

A2、参照上述实验条件设定的各项参数进行内源酶转化的多因素实验，并分别得到反应液；

A3、反应液通过大孔树脂后，利用洗脱剂进行洗脱，并收集大孔树脂洗脱液，再经浓缩干燥处理后，制得提取物产品，并测试提取物产品含量，具体测试结果见下表。

表7 SAMC转化条件筛选试验结果统计

由上述筛选试验以及表6-7所示试验数据可知，当转化温度为25-35℃，pH为4-5，保温2-6h时，从天然GSAC转化为SAC的效果理想，例如，当温度为25℃，pH为4，保温时间为6h时，转化效率达到最佳，SAC的含量可高达2360ug/g鲜蒜；当转化温度为55-65℃，pH＝5.5-7.5，保温1-3h时，从天然GSAMC转化为SAMC的效果理想，例如，当温度为60℃，pH为6，保温时间为3h时，转化效率达到最佳，SAMC的含量可高达1450ug/g鲜蒜。

由此可见，利用本发明实施例提供的从鲜蒜中提取含硫物质和大蒜素的方法制备得到的SAC、SAMC和大蒜素产品品质好、收率高，能够解决现有的提取方法存在操作步骤繁琐、耗时较长以及无法实现多种物质联合制备的技术问题；本发明实施例还在鲜蒜内含不同GGT转化酶(即谷氨酰转肽酶)，在不同的温度和pH条件下的活力不同、转化前体不同的原理下，通过大量筛选试验，最终优化得到一整套适用于S-烯丙基-L-半胱氨酸和S-烯丙基-巯基-L-半胱氨酸的转化体系，本发明在大蒜提取物联合制备领域具有广阔的应用前景。