链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的制备方法及应用
阅读说明：本技术 链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的制备方法及应用 (Preparation method and application of streptozochytrium induced resistance protein LiiP1 ) 是由 邱德文 彭智超 王世豪 程远岭 于 2021-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种链壶菌诱抗蛋白质LiiP1作为饲料添加剂的应用。本发明还公开了一种链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的制备方法,包括以下步骤：步骤A、挑取少量链壶菌菌体接种到摇瓶液体培养基中进行种子发酵和振荡培养；步骤B、将种子摇瓶接入发酵罐进行至少2级发酵；步骤C、发酵完成后加入缓冲液保护诱抗蛋白,然后进行破壁；步骤D、将菌体细胞破壁的粗蛋白液中的蛋白酶灭活、粗蛋白液浓缩并添加载体填料助剂,造粒烘干,得到链壶菌诱抗蛋白质。本发明通过从患病大闸蟹体内分离相关真菌并制成相关饲料添加剂颗粒剂,可提升大闸蟹抗病功能,提升其对各种细菌疾病的抵抗能力,减少病害的发生,提高成活率。(The invention discloses an application of streptozochytrium induced resistance protein LiiP1 as a feed additive. The invention also discloses a preparation method of the streptozochytrium induced resistance protein LiiP1, which comprises the following steps: a, selecting a small amount of streptomyces thallus, inoculating the streptomyces thallus into a shake flask liquid culture medium, and performing seed fermentation and shaking culture; b, inoculating the seed shake flask into a fermentation tank for at least 2-stage fermentation; step C, adding a buffer solution to protect the induced protein after fermentation is completed, and then breaking the wall; and D, inactivating protease in the crude protein liquid obtained by breaking the cell walls of the thalli, concentrating the crude protein liquid, adding a carrier filler aid, granulating and drying to obtain the streptozochytrium induced resistance protein. According to the invention, relevant fungi are separated from the bodies of the diseased hairy crabs and prepared into relevant feed additive granules, so that the disease resistance of the hairy crabs can be improved, the resistance of the hairy crabs to various bacterial diseases is improved, the occurrence of diseases is reduced, and the survival rate is improved.)
技术领域
本发明涉及一种诱抗蛋白质饲料添加剂的制备生产工艺以及相关用途，具体涉及一种链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的制备方法及作为饲料添加剂在提升阳澄湖大闸蟹抗病促生的应用。
背景技术
诱抗蛋白质饲料添加剂是指通过在大闸蟹饲料中添加链壶菌诱抗蛋白质来提高大闸蟹的抗病性和促进大闸蟹的生长。目前喂养大闸蟹饲料普遍为渔民自己配置的食料，主要还是以小鱼小虾的粉料，缺乏较科学的配方，配料中蛋白质和维生素的含量比较低，易造成大闸蟹营养不足，生长缓慢，免疫力低易感染疾病，而且肉质中所含营养成分未达到应有的标准。
目前市面上长期使用喹乙醇结果引起的慢性中毒, 屡见鱼体内脏器发生坏死、充血、腹腔积水等症状, 也有人发现动物体细胞出现染色体畸变、致突作用。2001年国家推出一种动物促长剂喹烯酮, 以替代喹乙醇药物。实践表明它添加于饲料投喂畜禽后,可显著抗出血病、腹泻等疾病和促进动物生长,其生长率可超过10%以上,但在鱼虾生长上不如畜禽明显。加之其成本较昂贵不利于推广普及。
针对大闸蟹常见细菌疾病没有特效药。养殖户无药可用，只能进行一些物理方法，基本对策为清理池塘底泥，整体换水，水体用生石灰，漂白粉等进行水体消毒。用药多为抗生素类产品如磺胺类药物，土霉素，呋喃西林等。抗生素的目的主要是治疗细菌感染性疾病、预防细菌感染性疾病的发生(使用剂量低于治疗剂量)及作为饲料添加剂促进动物生长(其使用剂量一般为治疗剂量的1/10～1/5)。但是长期使用抗生素可诱导耐药菌的出现，尤其在大闸蟹中长期使用低于治疗剂量的抗生素(如预防剂量和促生长剂量)会加速耐药细菌的出现。耐药菌一旦在大闸蟹中出现并传播，将使大规模大闸蟹成为庞大的耐药基因储藏库。研究表明，蟹肉中的耐药菌可以通过直接或间接方式传递给食用者、最终消费者——人类，严重威胁人类临床感染的治疗。
人体经常摄入低剂量的抗生素残留物，会逐渐在体内蓄积而导致各种器官发生病变。抗生素的残留对机体的影响主要表现在变态反应、过敏反应、免疫抑制、致畸、致癌、致突变等作用，这些操作对大闸蟹品质及环境造成了严重影响。
随着行业发展的需求，养殖业者和饲料厂都把眼光转向了寻找绿色安全的促生长剂饲料添加剂。目前市面上出现了两大类饲料添加剂:第一类是壳寡糖类产品，该类产品作为虾蟹饲料添加剂代替原来的虾头壳粉，随能达到提高虾蟹对壳多糖消化利用率，在一定程度上可促进虾蟹生长发育、增强免疫力，提高成活率，但该项目采用国外引进高技术生产工艺，且原料来源是虾头壳粉，原料来源受限，生产成本较高；第二类是微生物制剂饲料添加剂，该类产品具有效果的是含一定数量微生物及其代谢产物的产品。其成份包括菌体、酶、蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素以及促生长因子等，该产品一直在广泛宣传，也具有一定的促生长及提高抗病性能力，但是行业内却始终无法明确起重要有效成分，无法制定相关标准，难以实现有效成分的工业化生产，加之大量活体微生物释放到水域中难以控制其繁殖，在某种程度上会破坏水体生态平衡，影响大闸蟹生长。
我国农业部近期已明确表示，计划全面禁止在动物饲料中添加抗生素，完全消除动物性产品的抗生素残留是一种必然的趋势。农业部将全面推行无公害食品计划，推广新型饲料添加剂。
因此，针对大闸蟹养殖过程中遇到的种种病害以及阻碍生长影响因素，迫切需要一套安全可靠的解决方案，经研究认为要以预防为主、药物防治为辅，推行大闸蟹科学养殖技术，搭配优良食料配方，使用新型饲料添加剂，调节大闸蟹从幼苗到成蟹生长过程中吸收营养元素，来提高自身免疫抗性，维护大闸蟹的生长环境。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的制备方法及应用。链壶菌诱抗蛋白质LiiP1可以提高大闸蟹生物体自身的免疫能力和促进大闸蟹的生长，提高生物体识别和消灭外来侵入的任何异物（病毒、细菌等）、处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种链壶菌诱抗蛋白质LiiP1作为饲料添加剂的应用。
本发明还提供了一种链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的制备方法，包括以下步骤：
步骤A、挑取少量链壶菌菌体接种到摇瓶液体培养基中进行种子发酵和振荡培养；
步骤B、将种子摇瓶接入发酵罐进行至少2级发酵；
步骤C、发酵完成后加入0.5M Tris HCl缓冲液保护诱抗蛋白，然后进行破壁；
步骤D、将菌体细胞破壁的粗蛋白液中的蛋白酶灭活、粗蛋白液浓缩并添加载体填料助剂，造粒烘干，得到链壶菌诱抗蛋白质。
本发明的作用机理如下：通过本发明中链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的制备方法可以从链壶菌中提取出来诱抗蛋白质LiiP1。由于大闸蟹隶属于节肢动物门甲壳纲，进化程度较低，免疫系统简单，链壶菌诱抗蛋白质通过被大闸蟹取食摄入体内后，利用其在pH4~11范围内都很稳定的特点，通过贲门胃与幽门胃被运输至中肠，而后与大闸蟹的体液接触，刺激大闸蟹的体液免疫因子，提高超氧化物歧化酶POD的表达，诱导其产生各种生物活性分子，如抗菌因子、细胞激活因子、溶菌酶等，提高大闸蟹的抗菌能力，并促进其取食。本发明的制备方法在制得LiiP1的同时还能得到其他链壶菌代谢产物，如多种维生素、氨基酸以及螯合态微量元素，可以在传统饲料的基础上更好的为受诱抗蛋白质LiiP1影响的大闸蟹提供营养，促进大闸蟹生长，提高蟹肉品质。
本发明的有益效果是：1、用微生物分泌诱抗蛋白质LiiP1代替抗生素，从大闸蟹生理基因表达上改变其应激反应，提高抗性，用安全无污染的方法改善大闸蟹生长状况，改善品质，降低染病率，提高成活率，2、链壶菌诱抗蛋白质LiiP1通过添加其饲料中饲喂大闸蟹后可以提升阳澄湖大闸蟹抗病促生的应用，可以有效提升澄湖大闸蟹抗病与促进生长，并且高效、健康、环保；3、该诱抗蛋白质是通过生物工程发酵产生的产品，除有效成分诱抗蛋白外还富含水产动物所必需的维生素、氨基酸和螯合态微量元素，可补充饲料营养成份的不足，提高饲料利用率，改善饲料口感，提高饲料适口性，促进水产动物正常发育和快速生长，加之诱抗蛋白进入大闸蟹体内后可诱抗其自身免疫系统，从而起到增强抗病能力的作用，同时，诱抗蛋白通过又到大闸蟹免疫系统使其自身分泌消化酶提高饲料原料的消化吸收率，从而提高饲料的营养价值，起到促生长作用；4、制备工艺实现了工业化生产，通过链壶菌的高效繁殖，可获取大量有效成分诱抗蛋白，降低了生产成本，同时该工艺在整个生产过程中无三废产生，属于环保型工艺。
下面结合附图对本发明进行详细说明。
附图说明
图1是本发明中链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的制备方法的流程图；
图2是本发明的链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的应用二中实施例1的超氧化物歧化酶（SOD）活力对比图；
图3是本发明链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的应用二中实施例1的大闸蟹肉质营养含量对比图。
具体实施方式
参见附图1，本发明还提供了一种链壶菌诱抗蛋白质LiiP1的制备方法，包括以下步骤。
步骤A、挑取少量菌体接种到摇瓶液体培养基中进行种子发酵和振荡培养。
详细地，在本步骤中摇瓶液体培养基的配方以质量百分比计包括酵母粉4.5-5.5，牛肉膏2.5-3.5，糖0.5-1.0，硫酸铵0.1-0.2，其余为水。振荡培养条件为在180rpm-200rpm、25-30℃的条件下振荡培养至少40h。
步骤B、将种子摇瓶接入发酵罐进行至少2级发酵。
第1级发酵包括以下步骤：将种子摇瓶接入50L发酵罐进行发酵，其中培养基装液量为65%、灭菌温度121℃，30min，发酵培养温度为25-30℃，PH为6.5-7.0，发酵时间36h；第2级发酵包括以下步骤：菌种经过50L发酵罐发酵后接入500L发酵罐进行发酵，其中培养基装液量70%、灭菌温度121℃，30min，发酵培养温度为25-30℃，PH为6.5-7.0，发酵时间为25-30h （优选25h）。
第1级发酵时培养基的配方以质量百分比计包括酵母粉4.5-5.5，牛肉膏2.5-3.5，糖0.5-1.0，硫酸铵0.1-0.2，其余为水。
第2级发酵时培养基的配方以质量百分比计包括酵母粉4.5-5.5，牛肉膏2.5-3.5，糖0.5-1.0，硫酸铵0.1-0.2，其余为水。进行第2级发酵时，在发酵液OD值在0.6-0.8时加入蛋白质产生诱导剂（加入的蛋白质产生诱导剂的质量所占培养基的配方质量的0.05-0.1%）。
蛋白质产生诱导剂可以是IPTG、乳糖、丙酮酸中的一种或几种的组合。
如需大规模发酵可进行3级发酵。
步骤C、发酵完成后加入0.5M Tris HCl缓冲液保护诱抗蛋白质，然后进行破壁。
步骤D、将菌体细胞破壁的粗蛋白液中的蛋白酶灭活，将粗蛋白液浓缩并添加载体填料助剂，造粒烘干。详细地，将粗蛋白液加热至90℃使蛋白酶变性失活后于薄膜蒸发仪中浓缩，加入载体和填料后对其充分搅拌混匀，然后通过圆盘造粒机制成直径3mm小圆粒，最后对其适度烘干去除多余水分。烘干温度为40-50℃。
本发明还提供了一种链壶菌诱抗蛋白质LiiP1作为饲料添加剂的应用，特别是应用于阳澄湖大闸蟹幼苗苗体，以提高大闸蟹抗病性和促进大闸蟹生长的能力。上述的链壶菌诱抗蛋白质添加剂指的是链壶菌培养分离的诱抗蛋白质添加入大闸蟹饲料中。具体应用步骤如下。
（1）、将链壶菌诱抗蛋白质LiiP1：饲料=1:500-1000倍比例加入大闸蟹饲料中。
（2）、用含有诱抗蛋白质的大闸蟹饲料对阳澄湖大闸蟹幼苗进行饲喂，总计饲喂3次，每次间隔期为5-7天。
应用一：通过饲喂处理提升大闸蟹幼苗苗体的抗病性，提高成活率的作用。
大闸蟹幼苗苗体进行饲料处理以提高抗病性，其包括以下步骤：
（1）、将链壶菌中培养分离出的诱抗蛋白质，以蛋白质：饲料为1:500-1000倍比例加入大闸蟹饲料中；；
（2）、用含有诱抗蛋白的大闸蟹饲料对阳澄湖大闸蟹幼苗进行饲喂处理，一天饲喂一次，共饲喂3次，间隔期为5-7天。
含诱抗蛋白质饲料添加剂的饲料饲喂处理可以是在大闸蟹的全生育期施用，但经过我们的观察和长期研究，对大闸蟹幼苗苗体进行饲喂处理的效果更好，大闸蟹幼苗苗体优选为80-120只/斤的幼苗。
实施例1：将链壶菌中培养分离出的诱抗蛋白质，以蛋白质饲料添加剂1:500-1000倍比例加入大闸蟹饲料中；用含有诱抗蛋白的大闸蟹饲料对的阳澄湖大闸蟹进行饲喂处理，以普通饲料作对照，每个处理用50只螃蟹。饲喂饲料120小时后向饲养槽中加入致病菌，在加入致病菌24h，48h，72h，96h后，分别统计大闸蟹剩余存活个体数，处理后的实验结果如下表所示：
其中，免疫保护率=（对照组死亡率－免疫组死亡率）/对照组死亡率。
结果与分析：由上表可见，链壶菌诱抗蛋白能够显著增强大闸蟹自身的抗病性，应用本发明方法处理后的大闸蟹面对相关病原菌侵害时能够表现出明显的抗病性，免疫保护率达到65%。
应用二：通过投喂大闸蟹带有链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂的饲料饲喂大闸蟹可提升大闸蟹的抗病性。
进一步的，通过将带有链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂的饲料饲喂大闸蟹可提升大闸蟹的抗病性，投喂时间至少提前于疫病高发期 3～4天，每天投喂2次共投喂6次，其中链壶菌诱抗蛋白质添加剂与饵料的比例为1-500：1000（本实施例为1：1000）。饲喂处理同样可以是在大闸蟹的全生育期施用，但经过观察和长期研究，在周边地区发生相应病害前使用的效果更好。
上述的含链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂的饲料饲喂大闸蟹之所以具有提高大闸蟹抗病能力的效果，在研究中发现，饲喂大闸蟹链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂后一定时间内，阳澄湖大闸蟹血清溶菌酶、超氧化物酶歧化酶（SOD），均有所升高，同时，测得的免疫保护率64%，证明饲喂链壶菌诱抗蛋白质的确能够增强阳澄湖大闸蟹的抗病能力。吞噬作用在甲壳动物免疫防御中具有极为重要的意义，在吞噬前、吞噬过程中和吞噬后，各种抗氧化酶、氧化酶和水解酶都发挥着重要的作用，其中关键性的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶，过氧化物酶等，而SOD是关键的抗氧化酶之一，是超氧自由基的天然消除剂，可以清除体内多余的自由基，使自由基的形成与消除处于一种动态平衡中，从而免除其对生物分子的损伤等.此外，SOD还具有抗菌、抗病毒、抗衰老等作用，已有研究发现，SOD活性与生物的免疫水平密切相关。因此，SOD可作为机体非特异性免疫指标，来评判免疫刺激剂对机体非特异性免疫力的影响。
实施例1：将链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂通过混合饲料投喂，进而检测大闸蟹血清SOD活性，检测大闸蟹抗病性。
将健康阳澄湖大闸蟹转塘河蟹养殖场，规格为50g左右，饲养于实验室中120cm*80cm*80cm的水族箱内，箱内放入适量的水草、瓦片等，每一水族箱内放养15只，每组三只水族箱；水温25-28℃,暂养一周后开始实验。每天09:00和16：30各投喂1次，投喂量约为蟹体重的3%（含蛋白量3%）连续投喂3天。以普通饲料作对照，每个处理用50只螃蟹。在投喂3天后向水族箱内加入大量致病菌，加入致病菌24h，48h，72h，96h后，分别统计大闸蟹剩余存活个体数处理后的实验结果如下表所示：
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血清的制备分别取投喂普通饲料的和投喂链壶菌诱抗蛋白质12，24，36，48，72，96，120，144h后的大闸蟹，自第二关节处折断取血淋巴，置于Eppendorf离心管中4℃过夜，然后低速离心使血清析出。
超氧化物酶歧化酶SOD活力的测定参照邓碧玉等的连苯三酚自氧化法进行。如图2所示，超氧化物酶歧化酶（SOD）活力：大闸蟹经投喂链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂的饲料后，不同时间采样测得的超氧化物酶歧化酶（SOD）的活性分别为117（12h），163（24h），211（36h），244（48h），263（72h），251（96h），218（120h），176（144h），对照组均值为114.5。超氧化物酶歧化酶（SOD）的活性随着受免时间的延长而逐渐升高，至72h时达到最大，随后逐渐减弱，经t检验（P<0.05），差异显著。
应用三：通过投喂大闸蟹带有链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂的饲料饲喂大闸蟹可促进大闸蟹生长，利于提前大闸蟹上市时间，改善肉质。
实施例1投喂链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂以1:500-1000倍比例加入到大闸蟹饲料中混合投喂，检测大闸蟹肉质部分营养含量。如图3所示，取同批次幼苗蟹100只，用试验组诱抗蛋白添加剂混合饲料喂养和普通饲料喂养对照组大闸蟹各50只，试验周期为大闸蟹整个养殖期，依据国家对于大闸蟹肉质营养成分标准测定方法，对其进行肉质部分营养成分测定，得出均值如图3所示，根据对比得出结果表明链壶菌诱抗蛋白对于大闸蟹肉质营养成分有显著提高效果，改善大闸蟹品质，具有更好的经济价值。
从扣蟹到成蟹，螃蟹需要经过五次蜕壳才能达到上市标准，每蜕一次壳，螃蟹才会翻倍增长，所以加速大闸蟹生长蜕壳是促进生长关，因此如何促进螃蟹生长蜕壳，使螃蟹提前成熟、提前上市、获得高回报，就需要从生长过程中，喂养过程来解决问题。实验组使用蛋白添加剂饲料喂养，对照组喂养普通饲料，实验组从同批次大闸蟹中随机检测公蟹母蟹各500只随机抽查，对照组检测公蟹母蟹各500只，得出如下表所示，结果对比表明，链壶菌诱抗蛋白饲料添加剂能够有效促进大闸蟹生长，由于大闸蟹不同规格的市场价值有很大差异，链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂能给蟹农带来很好的经济价值。
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上述技术方案主要列举了幼蟹、成蟹饲喂法等应对大闸蟹抗性病上的应用，但经过实验和观察，链壶菌诱抗蛋白对提高大闸蟹的应激能力、提高大闸蟹应对不良环境能力提升其成活率也有显著效果，对于促进大闸蟹生长速度以及改善品质有明显效果。因此，链壶菌诱抗蛋白质LiiP1饲料添加剂在提高大闸蟹应对其他疾病以及促生长上具有普适性，是一种极具应用潜力和研究价值的阳澄湖大闸蟹抗病性很好的饲料添加剂。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
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