阅读说明：本技术 细胞重复利用生产普鲁兰多糖的方法及应用 (Method for producing pullulan polysaccharide by cell recycling and application ) 是由 魏培莲 吕磊磊 陈林杰 肖功年 鲍文娜 柳永 刘士旺 于 2021-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种细胞重复利用发酵生产普鲁兰多糖的方法及应用,包括如下步骤：将出芽短梗霉种子液接种到发酵培养基进行发酵；发酵培养7d后,用盐酸或氢氧化钠调节发酵液中的pH值至稳定后,滴加絮凝剂和助凝剂,振荡混匀后静置分层,菌液分离,得到含有普鲁兰多糖的发酵液清液和絮凝沉淀的出芽短梗霉菌体,收集含有普鲁兰多糖的发酵液清液,将出芽短梗霉菌体用新鲜发酵液重新悬浮并继续发酵。本发明通过采用絮凝法回收并重复利用细胞发酵的方式进行普鲁兰多糖的发酵生产,提高普鲁兰多糖的产量；减少发酵生产过程中的种子培养基配制、种子培养及接种等环节,节约发酵时间,降低原料成本,并进一步提高生产效率。(The invention provides a method for producing pullulan polysaccharide by cell recycling fermentation and application thereof, comprising the following steps: inoculating the aureobasidium pullulans seed liquid to a fermentation culture medium for fermentation; after fermentation culture for 7 days, adjusting the pH value in the fermentation liquor to be stable by using hydrochloric acid or sodium hydroxide, dropwise adding a flocculating agent and a coagulant aid, shaking, uniformly mixing, standing, layering, separating bacterial liquid to obtain a fermentation liquor clear liquid containing pullulan polysaccharide and flocculation-precipitated Aureobasidium pullulan thallus, collecting the fermentation liquor clear liquid containing pullulan polysaccharide, resuspending the Aureobasidium pullulan thallus by using a fresh fermentation liquor, and continuing fermentation. According to the invention, the fermentation production of the pullulan is carried out by adopting a flocculation method to recover and repeatedly utilize a cell fermentation mode, so that the yield of the pullulan is improved; the links of seed culture medium preparation, seed culture, inoculation and the like in the fermentation production process are reduced, the fermentation time is saved, the raw material cost is reduced, and the production efficiency is further improved.)

细胞重复利用生产普鲁兰多糖的方法及应用

技术领域

本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种细胞重复利用生产普鲁兰多糖的方法及应用。

背景技术

普鲁兰多糖是一种无色、无味的右旋葡萄糖苷聚合物，呈粉末状，溶于水时散发出微微的甜味，具有无毒性、生物安全性、易降解性、良好的可食性和被膜性等显著优点，在医药、化妆品、环境和食品等领域有巨大应用潜力。由于具有反应条件温和、目标产物纯度高、污染小，微生物发酵法表现出更大的生产优势，具有巨大开发前景。出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）是一种“类酵母真菌”，是主要的普鲁兰多糖生产菌种。当前利用微生物发酵法高效生产普鲁兰多糖的策略主要是选育高产菌株、优化培养条件、控制代谢过程等，然而普鲁兰多糖未来需求空间很大，这些方法策略仍不能实现规模化生产普鲁兰多糖。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明设计的目的在于提供一种细胞重复利用生产普鲁兰多糖的方法及应用，该方法能够维持细胞连续发酵性能，降低产物抑制，节约发酵时间，降低生产成本，提高发酵产物的总产量。

本发明通过以下技术方案加以实现：

所述的细胞重复利用发酵生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）将预先制得的出芽短梗霉种子液接种到发酵培养基中进行发酵培养；

2） 发酵培养一周后，使用盐酸或氢氧化钠调节发酵液中的pH值；

3）发酵液中的pH稳定后，往发酵液中滴加絮凝剂和助凝剂，并进行振荡混匀；

4）将振荡混匀后的发酵液静置待菌液分层后，倾倒使菌液分离，得到含有普鲁兰多糖的发酵液清液和絮凝沉淀的出芽短梗霉菌体，收集含有普鲁兰多糖的发酵液清液提取普鲁兰多糖，将絮凝得到的出芽短梗霉菌体用新鲜培养基重新悬浮并继续发酵，继续制得普鲁兰多糖。

优选地，步骤1）中出芽短梗霉种子液的接种量为6%，种子液培养的时间为2-3天，培养条件为：培养温度28℃，摇床转速180r/min。

优选地，步骤1）中种子液制备用培养基包括如下重量百分含量的组分：葡萄糖5%，蛋白胨0.1%，酵母提取物0.1%，KH₂PO₄ 0.5%，MgSO₄•7H₂O 0.04%，NaCl 0.1%，水余量。

优选地，步骤1）中发酵培养基包括如下重量百分含量的组分：葡萄糖12%，NH₄NO₃0.1%，KH₂PO₄ 0.01%，KCl 0.05%，MgSO₄•7H₂O 0.02%，水余量，发酵培养条件为：培养温度28℃，摇床转速180r/min。

优选地，步骤2）中盐酸或氢氧化钠的浓度为2mol/L，发酵液pH值调节至5.0-5.5。

优选地，步骤3）中絮凝剂为1%醋酸溶液配制并高压灭菌的10g/L壳聚糖溶液，滴加量为0.03-0.04mL/mL；助凝剂为用超纯水配制并高压灭菌后的10g/L海藻酸钠溶液，滴加量为0.02-0.04mL/mL。

优选地，步骤3）中发酵液振荡混匀条件为28℃、180 r/min，时间为20-30min。

优选地，所述发酵液絮凝处理后细胞絮凝率的计算公式为：；普鲁兰多糖保留率的计算公式为：保留率。

所述的细胞重复利用发酵生产普鲁兰多糖的方法在普鲁兰多糖生产中的应有。

本发明通过采用絮凝法，回收并重复利用细胞发酵的方式进行普鲁兰多糖的发酵生产，在一个发酵周期结束后，通过絮凝处理回收菌体细胞，补充新鲜培养基重新悬浮并继续发酵，及时排出产物，降低了产物抑制，同时代谢废物也不断转移出去，避免对细胞生长造成毒害，有效提高了普鲁兰多糖的产量；本发明的细胞重复利用发酵生产普鲁兰多糖的方法，减少了发酵生产过程中的种子培养基配制、种子培养及接种等环节，节约了发酵时间，降低了原料成本，并进一步提高了生产效率。发酵液絮凝处理后细胞絮凝率在80%以上，普鲁兰多糖的保留率在95%以上，普鲁兰多糖产量提高45%以上。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，以更好地理解本技术方案。

实施例1

细胞重复利用发酵生产普鲁兰多糖的方法，包括以下步骤：

1）选取培养良好的斜面菌种挑取2环接种于种子培养基中，装液量为250mL三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，180 r/min培养2d；

上述的种子培养基为：葡萄糖 5%，蛋白胨 0.1%，酵母提取物 0.1%，KH₂PO₄ 0.5%，MgSO₄•7H₂O 0.04%，NaCl 0.1%，水余量；

2）发酵培养：将制备好的种子液以6%的比例接种至发酵培养基中，装液量为250mL三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，180 r/min培养7d；

3）向上述步骤2）发酵后的发酵液中逐滴滴加HCl，调节发酵液pH至5.1，分别逐滴加入2mL絮凝剂、2mL助凝剂，然后振荡混匀20min；

4）将上述步骤3）处理后的发酵液静置2h，倒出上清液，重新加入等体积新鲜的发酵培养基悬浮并继续发酵培养7d；

经测定，细胞絮凝率为84.8%，普鲁兰多糖保留率为96.1%，普鲁兰多糖产量提高了46.4%。

其中，细胞絮凝率计算公式为：；普鲁兰多糖保留率的计算公式为：保留率。

实施例2

本实施例同实施例1的方法步骤一样，区别仅在于在步骤3）中絮凝剂的滴加量为1.5mL。

该实施例最终经过测定，细胞絮凝率为80.3%，普鲁兰多糖保留率为95.1%，普鲁兰多糖产量提高了45.1%。

实施例3

本实施例同实施例1的方法步骤一样，区别仅在于在步骤3）中助凝剂的滴加量为1.5mL。

该实施例最终经过测定，细胞絮凝率为81.4%，普鲁兰多糖保留率为95.3%，普鲁兰多糖产量提高了45.9%。

实施例4

本实施例同实施例1的方法步骤一样，区别仅在于在步骤3）振荡混匀时间为30min。

该实施例最终经过测定，细胞絮凝率为83.7%，普鲁兰多糖保留率为95.6%，普鲁兰多糖产量提高了46.2%。