一种微生物发酵产普鲁兰多糖用培养基及其应用
阅读说明：本技术 一种微生物发酵产普鲁兰多糖用培养基及其应用 (Culture medium for producing pullulan through microbial fermentation and application of culture medium ) 是由 王圣 余文婷 张潇 于 2021-11-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种微生物发酵产普鲁兰多糖用培养基及其应用。该培养基包括水,碳源10～220g/L,氮源0.1～10g/L,镁源0.01～3 g/L,钾源0.01～3 g/L,磷酸盐源0.01～3g/L,通过将水,碳源,氮源,镁源,钾源,磷酸盐源混合后,再用pH调节剂调节pH至3～10。通过对化学合成物质等成分的严苛限制,可以保证生产的普鲁兰多糖产品没有任何危害人体的成分,且完全安全有益,提高有机普鲁兰多糖的产量,使其满足有机贴标的要求,同时有利于工业化放大生产,得到附加值更高的普鲁兰多糖,也有利于高附加值普鲁兰多糖衍生产品的开发。(The invention discloses a culture medium for producing pullulan through microbial fermentation and application thereof. The culture medium comprises water, 10-220 g/L of carbon source, 0.1-10 g/L of nitrogen source, 0.01-3 g/L of magnesium source, 0.01-3 g/L of potassium source and 0.01-3 g/L of phosphate source, and the pH value is adjusted to 3-10 by using a pH regulator after the water, the carbon source, the nitrogen source, the magnesium source, the potassium source and the phosphate source are mixed. By strictly limiting components such as chemical synthetic substances, the produced pullulan polysaccharide product can be ensured to have no components harmful to human bodies, is completely safe and beneficial, the yield of organic pullulan polysaccharide is improved, the organic pullulan polysaccharide meets the requirement of organic labeling, the industrial amplification production is facilitated, the pullulan polysaccharide with higher added value is obtained, and the development of a pullulan derivative product with high added value is facilitated.)
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种微生物发酵产普鲁兰多糖用培养基及其应用。
背景技术
普鲁兰多糖是一种出芽短梗霉发酵得到的胞外粘质多糖，具有优良的成膜性、水溶性、生物相容性以及可降解等特性，成为天然植物胶囊的优质原料。然而目前全球范围内该产品生产水平较低，现有技术生产的普鲁兰多糖方法转化率较低，发酵液成分复杂，且缺少符合有机贴标要求的发酵配方，因而生产成本较高，且附加值相对较低，滞后工业化进程。
CN103243135A公开了生产普鲁兰多糖的新培养基及发酵生产普鲁兰多糖的方法，培养基配方如下：碳源为蔗糖，蔗糖浓度为60-120g/L，氮源为尿素，尿素浓度为2-4g/L；无机盐为K2HPO4，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，NaCl：2-4g/L，K2HPO4浓度为3-10g/L，MgSO4·7H2O浓度为0.3-0.5g/L，FeSO4·7H2O浓度为25-100mg/L，pH6-7。此专利所用培养基成分明确，发酵后产物成分简单，降低了后续的提取生产成本；且所用成分来源广泛，易于采购且成本较低。但并不满足有机贴标的要求，含有对人体不利的成分。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微生物发酵产普鲁兰多糖用培养基及其应用，通过对化学合成物质等成分的严苛限制，可以保证生产的普鲁兰多糖产品没有任何危害人体的成分,且完全安全有益，提高有机普鲁兰多糖的产量， 使其满足有机贴标的要求，同时有利于工业化放大生产，得到附加值更高的普鲁兰多糖，也有利于高附加值普鲁兰多糖衍生产品的开发。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种微生物发酵产普鲁兰多糖用培养基，包括水，碳源10~220g/L，氮源0.1~10g/L，镁源0.01~3 g/L，钾源0.01~3 g/L，磷酸盐源0.01~3g/L，通过将水，碳源，氮源，镁源，钾源，磷酸盐源混合后，再用pH调节剂调节pH至3~10。
作为改进的是，所述碳源为葡萄糖，蔗糖，淀粉，乳糖，果糖，糊精或麦芽糖中一种或多种混合而成，浓度为60~160 g/L。
作为改进的是，所述氮源为浓缩乳清蛋白，酵母粉，碳酸氢铵，碳酸铵中一种或多种混合而成，浓度为2~5 g/L。
作为改进的是，所述镁源为氯化镁或硫酸镁中一种或两种混合而成，浓度为0.1~0.3 g/L。
作为改进的是，所述钾源为氯化钾，碘化钾，碳酸钾，柠檬酸钾，乳酸钾中一种或多种混合而成，浓度为0.3~0.7 g/L。
作为改进的是，所述磷酸盐源为磷酸氢钙和磷酸二氢钙中一种或两种混合而成，浓度为0.1~1g/L。
作为改进的是，所述pH调节剂为柠檬酸，乳酸，酒石酸，藻酸中一种或多种混合而成，调节培养基的pH为6.0~7.0。
上述培养基在发酵产普鲁兰多糖上的应用，具体步骤如下：
步骤1、一级种子培养
将表面湿润的菌种块接入种子培养基，按照10~50%的装液量分装至锥形瓶中，于20~35℃，转速150~260rpm下培养22~50h，得到一级种子液；
步骤2、二级种子培养
将一级种子液以0.1~12%（v/v）接入种子罐中的种子培养基，于20~35℃，转速80~400rpm，进气量0.5~2vvm，罐压0.1~0.8bar下培养22~50h得到二级种子液，根据发酵规模进行多级种子培养得到对应级种子液；
步骤3、发酵培养
将步骤2得到的对应级种子液以0.1~12%（v/v）的接种量接入发酵罐中，于20~35℃，转速80~400rpm，进气量0.5~2vvm，罐压0.1~0.8bar下培养48~120h得到发酵液；
步骤4、将发酵液经过8000rpm离心10min，取上清液加入两倍体积乙醇，再次8000rpm离心10min，取白色沉淀于105℃烘干至恒重得到普鲁兰多糖。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种微生物发酵产普鲁兰多糖用培养基及其应用，通过对化学合成物质等成分的严苛限制，可以保证生产的普鲁兰多糖产品没有任何危害人体的成分，且完全安全有益，并通过配方优化将有机普鲁兰多糖产量由26.7g/L提高至58g/L，使其满足有机贴标的要求，同时有利于工业化放大生产，得到附加值更高的普鲁兰多糖，也有利于高附加值普鲁兰多糖衍生产品的开发。
附图说明
图1为实施例1与不添加磷酸氢钙对普鲁兰多糖产量的影响。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
出芽短梗霉SWP35，保藏编号CGMCC NO.11602，本发明实施例中所用的出芽短梗霉SWP35购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
步骤1，一级种子培养
将表面湿润的出芽短梗霉SWP35接入种子培养基（种子培养基配方：葡萄糖 80g/L,乳清浓缩蛋白2.2g/L,磷酸氢钙0.7g/L,氯化镁0.1 g/L，碳酸钾0.5 g/L，将上述组分混合后，用浓度为0.7 g/L的柠檬酸进行pH调节，调节至7.0；按照20%的装液量分装至锥形瓶中，于28℃，转速230 rpm下培养36 h，得到一级种子液；
步骤2，二级种子培养
将一级种子液以0.5%（v/v）接入种子罐中的种子培养基，于28℃，转速350rpm，进气量1vvm，罐压0.5bar下培养42h得到二级种子液。以此类推，根据发酵规模进行多级种子培养；
步骤3，发酵培养
将步骤2的对应级种子液以8%（v/v）接入发酵罐中的发酵培养基（发酵培养基配方：蔗糖 130 g/L,乳清浓缩蛋白3g/L,磷酸氢钙0.7 g/L,氯化镁0.15 g/L，碳酸钾0.5 g/L，将上述组分混合后，用1.35 g/L 柠檬酸进行pH调节，调节至6.0；于28℃，转速400rpm，进气量1vvm，罐压0.5bar下培养96h得到发酵液；
步骤4，将发酵液经过8000rpm离心10min，取上清液加入两倍体积乙醇，再次8000rpm离心10min，取白色沉淀于105℃烘干至恒重得到普鲁兰多糖，多糖产量可达到58g/L。本实施例的对比例，为不添加磷酸氢钙进行发酵产普鲁兰多糖，结果如图1所示，从图1中可以看出，添加磷酸氢钙后,普鲁兰多糖产量明显高于未添加磷酸氢钙的样本。
实施例2
步骤1，一级种子培养
将表面湿润的出芽短梗霉SWP35接入种子培养基，（种子培养基配方：葡萄糖 60g/L,乳清浓缩蛋白2g/L,磷酸氢钙0.1g/L,氯化镁0.1 g/L，碳酸钾0.3 g/L，将上述组分混合后，用浓度为0.3g/L的柠檬酸进行pH调节，调节至6.5；按照10%的装液量分装至锥形瓶中，于20℃，转速150rpm下培养22h，得到一级种子液。
步骤2，二级种子培养
将一级种子液以0.1%（v/v）接入种子罐中的种子培养基，于20℃，转速80rpm，进气量0.5vvm，罐压0.1bar下培养22h得到二级种子液。以此类推，根据发酵规模进行多级种子培养。
步骤3，发酵培养
将步骤2的对应级种子液以0.1%（v/v）接入发酵罐中的发酵培养基（发酵培养基配方：蔗糖 60 g/L,乳清浓缩蛋白2g/L,磷酸氢钙0.1 g/L,氯化镁0.1 g/L，碳酸钾0.3 g/L，用0.3 g/L 柠檬酸进行pH调节，调节至6.5；于20℃，转速80rpm，进气量0.5vvm，罐压0.1bar下培养48h得到发酵液。
步骤4，将发酵液经过8000rpm离心10min，取上清液加入两倍体积乙醇，再次8000rpm离心10min，取白色沉淀于105℃烘干至恒重得到普鲁兰多糖，多糖产量可达到23g/L。
实施例3
步骤1，一级种子培养
将表面湿润的出芽短梗霉SWP35接入种子培养基（种子培养基配方：葡萄糖 100g/L,乳清浓缩蛋白5g/L,磷酸氢钙1g/L,氯化镁0.3 g/L，碳酸钾0.7 g/L，将上述组分混合后，用浓度为0.9 g/L的柠檬酸进行pH调节，调节至6.0；按照50%的装液量分装至锥形瓶中，于35℃，转速260rpm下培养50h，得到一级种子液。
步骤2，二级种子培养
将一级种子液以12%（v/v）接入种子罐中的种子培养基；于35℃，转速400rpm，进气量2vvm，罐压0.8bar下培养50h得到二级种子液。以此类推，根据发酵规模进行多级种子培养。
步骤3，发酵培养
将步骤2的对应级种子液以12%（v/v）接入发酵罐中的发酵培养基（发酵培养基配方：蔗糖 160 g/L,乳清浓缩蛋白5g/L,磷酸氢钙1 g/L,氯化镁0.1 g/L，碳酸钾0.3 g/L，将上述组分混合后，用1.35 g/L 柠檬酸进行pH调节，调节至7.0；于35℃，转速400rpm，进气量2vvm，罐压0.8bar下培养120h得到发酵液。
步骤4，将发酵液经过8000rpm离心10min，取上清液加入两倍体积乙醇，再次8000rpm离心10min，取白色沉淀于105℃烘干至恒重得到普鲁兰多糖，多糖产量可达到48g/L。
由图1所示，添加磷酸氢钙的配方，有机普鲁兰多糖产量均高于未添加的产量。与此同时，添加有磷酸氢钙成分的配方，随着蔗糖添加量的增加，产量先增后减，并于蔗糖添加量130g/L时，达到最大值58g/L。
综上所述，本发明一种微生物发酵产普鲁兰多糖用培养基及其应用，通过对化学合成物质等成分的严苛限制，可以保证生产的普鲁兰多糖产品没有任何危害人体的成分,且完全安全有益，提高有机普鲁兰多糖的产量， 使其满足有机贴标的要求，同时有利于工业化放大生产，得到附加值更高的普鲁兰多糖，也有利于高附加值普鲁兰多糖衍生产品的开发。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
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