一种提高春雷霉素发酵水平的生产方法
阅读说明：本技术 一种提高春雷霉素发酵水平的生产方法 (Production method for improving fermentation level of kasugamycin ) 是由 王卫富 马文艳 潘忠成 王梦飞 李蒲民 于 2021-09-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种提高春雷霉素发酵水平的生产方法,通过调整种子培养配方中的关键速效和迟效氮源比例,有效控制发酵过程的补料速率和溶氧,综合提高种子的质量稳定性和发酵中前期的菌丝生长质量、发酵中后期的环境平衡,实现菌丝代谢活力和发酵水平稳定性的提高。通过对一二级种子的质量控制和发酵工艺的优化,生产大罐的发酵效价由11500-12500u/ml,最高突破到23500u/ml,平均达到17500-21500u/ml,平均效价提高了46-52%,产量提高65-70%,有效的降低了春雷霉素的生产成本。(The invention relates to a production method for improving kasugamycin fermentation level, which effectively controls the material supplementing rate and dissolved oxygen in the fermentation process by adjusting the proportion of key quick-acting and slow-acting nitrogen sources in a seed culture formula, comprehensively improves the quality stability of seeds, the growth quality of hyphae in the early stage of fermentation and the environmental balance in the middle and later stages of fermentation, and realizes the improvement of the hypha metabolic activity and the fermentation level stability. Through the quality control of the first-level and second-level seeds and the optimization of the fermentation process, the fermentation titer of the large production tank is from 11500-.)
技术领域
本发明属于生物发酵的技术领域，具体涉及一种提高春雷霉素发酵水平的生产方法，该方法可以显著的提高春雷霉素的生物效价。
背景技术
春雷霉素（kasugamycin）是一种由小金色链霉菌（Streptomyces kasugaensis）产生的次级代谢产物，属于氨基糖苷类抗生素。春雷霉素广泛应用于农业，对水稻稻瘟病，大白菜黑腐病，黄瓜枯萎病等有显著的防治效果。春雷霉素作为一种绿色、低毒、低残留的农用抗生素类杀菌剂，符合现代环保要求，被中国绿色食品发展中心推荐为AA级绿色食品生产资料，被农业部列为无公害农产品生产推荐农药，被上海市列为蔬菜标准化工程首推杀菌剂。随着人们对农药安全意识的提高，春雷霉素高效、广谱、无公害的生物特性展示了越来越广泛的市场前景。由于其具有显著的抗植物病原真菌活性，在农业上广泛使用。其低毒、安全、高效、对环境友好，是目前最具推广前景的绿色农药之一，也是当前农作物病虫害防治中具有广阔发展前景的农药之一。
目前春雷霉素生产采用三级或四级发酵，现有的工艺条件下发酵正常水平在10000µg/L左右，最高水平不超过14500µg/L，生产过程控制相对粗放，没有把溶氧等关键表征参数作为主要控制参数。如何进一步提高小金色链霉菌在发酵过程中的效价水平，一方面需要加强在基础代谢方面研究，另一方面要同时在配方优化和工艺控制理论上做进一步创新。
中国专利申请CN107828702A公开了一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法，生产培养基的中添加麦芽糖 2.0～2.5%，鱼油 3.5～4.0%， 肌醇0.01%～0.05%，能够实现实验室的春雷霉素发酵效价提高到16000µg/L。
中国专利申请CN109486881A一种春雷霉素的发酵培养基及发酵工艺，生产培养基中添加麦芽糖：0.8～1 .5%，鱼油0.5～1 .0%，春雷霉素发酵滤渣50～60%。通过该培养基以及发酵工艺的控制，有效的实现利用春雷霉素发酵滤渣，提高春雷霉素发酵单位。
中国申请专利CN201810817178.3公开了一种提高春雷霉素生物效价方法，在基础培养基中添加生长因子和微量元素培养基进行培养，春雷霉素效价提高了19.7%，单罐产量提高了10 .8%。
通过改变培养基中营养配方，能够有效地提高小金色链霉菌的发酵水平，但在实际生产过程中，由于营养的改变，造成菌丝老化和物料质量的变化，生产稳定性较差，并不能完全实现发酵产量的大幅度提高。本发明在现有生产工艺的基础上，实现对代谢流的控制，最大限度的提高菌丝的生产效率，实现发酵水平的高突破。
发明内容
为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供一种提高春雷霉素发酵水平的生产方法，从提高种子活力和菌丝质量入手，改变种子和发酵培养基中的C/N比例，利用代谢流的控制理论，调整发酵代谢不同时期的营养利用效率，提高单罐生产效率，实现发酵效价的提高和生产产量、生产成本的大幅度突破。
为了实现发明目的，本发明采用如下技术方案： 一种提高春雷霉素发酵水平的生产方法，采用三级发酵工艺，包括以下步骤：
1）按照春雷霉素种子和发酵培养基的基本配方进行配料，补水定容后，pH自然；
2）一级种子培养基实消灭菌后，接种成熟的小金色链霉菌种子，按照一级种子罐的各项培养条件，培养周期内取样及镜检，监测菌丝形态变化、pH、菌浓等各项理化指标，待种子指标合格，按比例移入二级种子罐；
3）按照二级种子各项培养条件，培养周期内取样及镜检，监测菌丝形态变化、pH、菌浓等各项理化指标，待种子指标合格，按比例移入发酵罐；
4）按照发酵各项培养条件，按照恒定或不恒定速率补氨、补糖，按照工艺要求提糖控氨，稳定pH和溶氧在设定范围内恒定或有规律波动，在发酵进入生产稳定期，控制溶氧相对稳定，发酵后期监测发酵效价和产量曲线拐点，选择合适时间下罐。
进一步的，种子培养基的配方为：黄豆饼粉10.0～20.0g/L、酵母粉1.0-5.0g/L、鱼粉0.5-1.0g/L、氯化钠1.0-3.0g/L、硫酸铵3.0g/L、豆油10.0-30.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、GPE消泡剂0.01-0.03g/L。
进一步的，步骤1）中，发酵培养基的各物质比例，基本配方：黄豆饼粉20.0～40.0g/L、玉米浆10.0-30.0g/L或同样固含玉米浆干粉、氯化钠1.0-5.0g/L、植物性蛋白胨5.0-1.0g/L、豆油10.0-30.0g/L、磷酸二氢钾0.5-1.0g/L、GPE消泡剂0.03-0.05g/L。
进一步的，步骤2）中，接种成熟的小金色链霉菌种子为镜检菌丝舒展分枝成网摇瓶种子，或使用镜检孢子成熟的试管斜面或茄形瓶。
进一步的，步骤2）中，一级种子罐的培养条件：风量系数0.6-1.0，温度29.0-31.0℃，溶氧＞60%，转速200-450rmp，培养周期24-48h。
进一步的，步骤2）中，一级种子合格指标：pH在7.2-7.7之间，镜检菌丝舒展分枝、成疏散网状。
进一步的，步骤3）中，二级种子各项培养条件：风量系数0.6-1.0，温度29.0-31.0℃，溶氧＞10%，转速200-350rmp，培养周期18-36h。
进一步的，步骤3）中，二级种子合格指标：pH值在6.8-7.5之间，镜检菌丝分枝断裂、呈结实密网状。
进一步的，步骤4）中，发酵各项培养条件：风量系数0.5-0.8，温度26.0-30.0℃，溶氧＞60%，转速80-150 rpm，补氨后控制pH值为6.5-7.0。
进一步的，步骤4）中，发酵前期24-36h开始补糖、补氨，工业氨水流加速率全程控制在0.15-0.3kg/t.h-1，45-55%液糖最高流加速率1.4-1.8kg/t.h-1。
进一步的，步骤4）中，发酵中期90-120h利用补料速率和风量、转速条件控制溶氧在55-75%之间，发酵后期140h后溶氧控制在75-85%之间。
进一步的，步骤4）中，发酵后期每8h发酵产量涨势大于0.45kg/t，选择延长发酵周期，低于0.3kg/t，准备放罐，发酵时间控制在210-230h之间。
本发明还保护根据上述生产方法得到的发酵物料，其生产效价为17500-23500u/ml。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1）本发明提供一种提高春雷霉素发酵水平的生产方法，从提高种子活力和菌丝质量入手，利用代谢流的控制理论，通过溶氧控制，调整不同发酵时期的营养代谢效率，减缓发酵中后期的环境恶化，提高发酵后期的产抗速率，实现发酵效价的大幅度突破。
2）通过该发明提供的生产方法，实现菌丝代谢活力的稳定和发酵产率的稳定性提高，生产发酵平均效价由11500-12500u/ml，提高到17500-21500u/ml，试验最高突破23500u/ml，生产平均效价提高了46-52%，生产单罐产量提高65-70%，有效的降低了春雷霉素的生产成本。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚，本发明用以下具体实施例进行说明，但本发明绝非限于这些例子。
本发明所采用的春雷霉素含量检测方法为HPLE法。
实施例 1
1）一级种子培养基配方：黄豆饼粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、鱼粉1.0g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸铵3.0g/L、豆油10.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、GPE消泡剂0.01g/L，补水定容后pH6.2-6.4。
2）二级种子培养基配方：黄豆饼粉20.0g/L、酵母粉1.0g/L、鱼粉0.5g/L、氯化钠3.0g/L、硫酸铵3.0g/L、豆油30.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、GPE消泡剂0.03g/L，补水定容后pH6.2-6.4。
3）发酵培养基配方：黄豆饼粉20.0g/L、玉米浆30.0g/L、氯化钠2.0g/L、植物性蛋白胨5.0g/L、豆油30.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、GPE消泡剂0.03g/L，补水定容后pH5.9-6.2。
4）一级种子培养基实消灭菌后，接种成熟的小金色链霉菌种子为镜检菌丝舒展分枝成网的摇瓶种子。培养条件：风量系数0.6，温度30.0-31.0℃，转速250-300rmp，溶氧自然，培养周期24-30h。监测菌丝形态变化、pH、菌浓等各项理化指标，一级种子合格指标：pH在7.2-7.3之间，镜检菌丝舒展分枝、成疏散网状，按10%比例移入二级种子罐。
5）二级种子各项培养条件：风量系数0.6，温度29.0-30.0℃，转速250rmp，溶氧自然，培养周期18-24h。监测菌丝形态变化、pH、菌浓等各项理化指标，二级种子合格指标：pH在6.8-7.0之间，镜检菌丝分枝断裂、呈结实密网状，按12%比例移入发酵罐。
6）发酵培养条件：风量系数0.55，温度28.0℃，溶氧＞70%，转速80-120rmp，前期pH自然。发酵前期24-36h，pH下降至6.7左右，按照恒定速率0.15-0.20kg/t.h-1流加工业氨水，稳定发酵pH在6.5-6.7之间，3-5h内根据补氨情况，开始流加45-50%液糖，最高流加速率不超过1.8kg/t.h-1，发酵中期90-120h控制溶氧在55-75%之间，发酵后期140h后溶氧控制在75-85%之间。发酵后期每8h发酵产量涨势大于0.45kg/t，选择延长发酵周期，低于0.3kg/t，发酵效价和产量曲线拐点，发酵周期在210-230h之间，选择合适时间下罐，发酵下罐效价在19500-23500µg/L之间。
实施例 2
1）一级种子培养基配方：黄豆饼粉15.0g/L、酵母粉3.0g/L、鱼粉0.5g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸铵3.0g/L、豆油20.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、GPE消泡剂0.15g/L，补水定容后，pH6.2-6.4。
2）二级种子培养基配方：黄豆饼粉15.0g/L、酵母粉3.0g/L、鱼粉1.0g/L、氯化钠3.0g/L、硫酸铵3.0g/L、豆油20.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、GPE消泡剂0.03g/L，补水定容后，pH6.2-6.4。
3）发酵培养基配方：黄豆饼粉30.0g/L、玉米浆10.0g/L、氯化钠5.0g/L、植物性蛋白胨3.0g/L、豆油20.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、GPE消泡剂0.03g/L，补水定容后，pH5.9-6.2。
4）一级种子培养基实消灭菌后，接种成熟的小金色链霉菌种子为镜检孢子成熟的试管斜面，采用灭菌后无盐水或生理盐水洗涤菌体形成悬浊液。培养条件：风量系数0.8，温度29.0-30.0℃，转速300-350rmp，溶氧自然，培养周期40-48h，监测菌丝形态变化、pH、菌浓等各项理化指标，一级种子合格指标：pH在7.3-7.5之间，镜检菌丝舒展分枝、成疏散网状，按13%比例移入二级种子罐。
5）二级种子各项培养条件：风量系数1.0，温度28.0-29.0℃，转速200rpm，溶氧＞10%，培养周期30-36h。监测菌丝形态变化、pH、菌浓等各项理化指标，二级种子合格指标：pH在7.0-7.2之间，镜检菌丝分枝断裂、呈结实密网状，按10%比例移入发酵罐。
6）发酵各项培养条件：风量系数0.8，温度26.0℃，溶氧＞65%，转速120-150rpm，前期pH自然。发酵前期24-36h，pH下降至6.8-6.9之间，下降趋势出现拐点，开始流加45-50%液糖，初始流加速率0.2-0.3kg/t.h-1，同时按照恒定速率0.15-0.20kg/t.h-1流加工业氨水，稳定发酵pH在6.8-6.9之间，根据补氨量情况，逐渐提高液糖流加量，最高流加速率不超过1.8kg/t.h-1，发酵中期90-120h控制溶氧在65-75%之间，发酵后期140h后溶氧控制在80-85%之间。发酵后期每8h发酵产量涨势大于0.45kg/t，选择延长发酵周期，低于0.3kg/t，发酵效价和产量曲线拐点，发酵周期在210-230h之间，选择合适时间下罐，发酵下罐效价在17500-19500µg/L之间。
实施例 3
1）一级种子培养基配方：黄豆饼粉20.0g/L、酵母粉1.0g/L、鱼粉1.0g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸铵3.0g/L、豆油15.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、GPE消泡剂0.03g/L，补水定容后，pH6.2-6.4。
2）二级种子培养基配方：黄豆饼粉10.0g/L、酵母粉5.0g/L、鱼粉0.5g/L、氯化钠3.0g/L、硫酸铵3.0g/L、豆油10.0-30.0g/L、磷酸二氢钾2.0g/L、GPE消泡剂0.01-0.03g/L，补水定容后，pH6.2-6.4。
3）发酵培养基配方：黄豆饼粉40.0g/L、玉米浆干粉5.0、氯化钠1.0g/L、植物性蛋白胨1.0g/L、豆油15.0g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、GPE消泡剂0.05g/L，补水定容后，pH5.9-6.2。
4）一级种子培养基实消灭菌后，接种成熟的小金色链霉菌种子为镜检孢子成熟的茄形瓶种子斜面，采用灭菌后无盐水或生理盐水洗涤菌体形成悬浊液。培养条件：风量系数1.0，温度28.0-29.0℃，转速400-450rmp，溶氧自然，培养周期30-36h，监测菌丝形态变化、pH、菌浓等各项理化指标，一级种子合格指标：pH在7.5-7.7之间，镜检菌丝舒展分枝、成疏散网状，按10%比例移入二级种子罐。
5）二级种子各项培养条件：风量系数0.8，温度28.0-29.0℃，转速300-350rpm，溶氧自然，培养周期24-30h。监测菌丝形态变化、pH、菌浓等各项理化指标，二级种子合格指标：pH在7.0-7.2之间，镜检菌丝分枝断裂、呈结实密网状，按15%比例移入发酵罐。
6）发酵各项培养条件：风量系数0.65，温度30.0℃，初始转速105rpm，溶氧＞65%，前期pH自然。发酵前期13h左右pH涨至最高点，温度降至29℃，发酵24-36h，pH下降6.9-7.0，下降趋势出现拐点，温度降至28℃，开始流加45-50%液糖，初始流加速率0.2-0.3kg/t.h-1，pH降至6.8-6.9后，按照恒定速率0.15-0.20kg/t.h-1流加工业氨水，稳定发酵pH恒定，根据补氨量情况，逐渐提高液糖流加量，最高流加速率不超过1.8kg/t.h-1，发酵中期90-120h控制溶氧在70-80%之间，发酵后期140h后溶氧出现过高回升，降低转速和风量，控制溶氧在80%左右。发酵后期每8h发酵产量涨势大于0.45kg/t，选择延长发酵周期，低于0.3kg/t，发酵效价和产量曲线拐点，发酵周期在210h前，选择合适时间下罐，发酵下罐效价在17500-18500µg/L之间。
实施例 4（生产对照工艺）
1）一级种子培养基配方：黄豆饼粉20.0g/L、酵母粉1.0g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸铵3.0g/L、豆油15.0g/L、GPE消泡剂0.01g/L，补水定容后，pH6.2-6.4。
2）二级种子培养基配方：黄豆饼粉20.0g/L、玉米浆干粉3.0g/L、氯化钠1.0g/L、硫酸铵3.0g/L、豆油10.0g/L、GPE消泡剂0.03g/L，补水定容后，pH6.2-6.4。
3）发酵培养基配方：黄豆饼粉30.0g/L、氯化钠1.0g/L、豆油25.0g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、GPE消泡剂0.03g/L，补水定容后，pH5.9-6.2。
4）一级种子培养基实消灭菌后，接种成熟的小金色链霉菌种子为镜检孢子成熟的茄形瓶种子斜面，采用灭菌后生理盐水洗涤菌体形成悬浊液。培养条件：风量系数1.0，温度28.0℃，转速450rmp，溶氧自然，培养周期33h，镜检菌丝舒展分枝、成疏散网状，pH自然，按10%比例移入二级种子罐。
5）二级种子各项培养条件：风量系数0.8，温度28.0℃，转速350rpm，溶氧自然，培养周期24h，镜检菌丝分枝断裂、呈结实密网状，pH自然，按15%比例移入发酵罐。
6）发酵各项培养条件：风量系数0.7，温度28.0℃，转速恒定120-150rpm，前期pH自然。发酵24h后，pH下降至6.5-6.8，选择合适控制点，初始按照恒定速率0.10kg/t.h-1流加工业氨水，中期提高至0.15kg/t.h-1，发酵pH恒定。根据实际补氨量情况，在24-30h中间开始流加45-50%液糖，发酵60-85h，液糖最高流加提至1.5kg/t.h-1。发酵周期在185-195h，发酵效价在10500-12500µg/L之间，准备放罐。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。在不脱离本发明构思的前提下，对这些已描述的实施方式作出的若干替代或变型，都应当视为属于本发明的保护范围。
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