具体实施方式

如本文所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”包含复数参考物，除非内容另有明确规定。

就在说明书或权利要求中使用术语“包含(include)”、“具有(have)”等来说，此术语旨在以类似于术语“包括(comprise)”在权利要求中用作过渡词时被解释为“包括”的方式为包含性的。

词语“示例性”在本文中用于表示用作实例、示例或说明。本文描述为“示例性”的任何实施方案不一定被解释为比其它实施方案优选或有利。

“细胞系统”是任何提供异位蛋白表达的细胞。其包含细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。其包含原核细胞和真核细胞。其还包含基于细胞组分(例如核糖体)的蛋白质的体外表达。

“编码序列”应赋予本领域普通技术人员其普通和习惯的含义，并且不限于用于指代编码特定氨基酸序列的DNA序列。

“生长”或“培养”细胞系统包含提供允许细胞繁殖和分裂的适当培养基。其还包含提供资源，使得细胞或细胞组分可以转译和制造重组蛋白。

“酵母”是真核单细胞微生物，被归类为真菌界的成员。酵母是从多细胞祖先进化而来的单细胞生物，但对本发明有用的一些物种是能够通过形成称为假菌丝(pseudohyphae/false hyphae)的连接的出芽细胞串来发展多细胞特征的酵母。

术语“互补”应赋予本领域普通技术人员其普通和习惯的含义，并且用于但不限于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明技术还包含分离的核酸片段，所述核酸片段与所附序列表中报道的完整序列以及那些基本上相似的核酸序列互补。

术语“核酸”和“核苷酸”应赋予本领域普通技术人员其相应的普通和习惯的含义，并且用于但不不限于指代脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其单链或双链形式的聚合物。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地包含其保守修饰或简并的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指示的序列。

术语“分离的”应赋予本领域普通技术人员其普通和习惯的含义，并且当在分离的核酸或分离的多肽的上下文中使用时，用于但不限于指代通过人手脱离其天然环境而存在并因此不是自然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽可以纯化的形式存在或可以存在于非天然环境中，例如，存在于转基因宿主细胞中。

本文使用的术语“孵育(incubating/incubation)”是指混合两种或更多种化学或生物实体(例如化合物和酶)并允许其在有利于生产香草醛的条件下相互作用的过程。

术语“简并变体”是指具有与参考核酸序列相差一个或多个简并密码子取代的残基序列的核酸序列。简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。核酸序列及其所有简并变体将表达相同的氨基酸或多肽。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”应赋予本领域普通技术人员其相应的普通和习惯含义；这三个术语有时可互换使用，并且勇于但不限于指代氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，不管其大小或功能如何。尽管“蛋白质”通常是参考相对较大的多肽使用，并且“肽”通常是参考较小的多肽使用，但是这些术语在本领域中的使用是重的叠并且是变化的。除非另有说明，否则如本文所用的术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白质。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中当涉及多核苷酸产物时可互换使用。因此，示例性多肽包含多核苷酸产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和上述的其它等效物、变体和类似物。

术语“多肽片段”和“片段”，当用于参考多肽时，应赋予本领域普通技术人员其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指代与参考多肽本身相比其中氨基酸残基缺失，但剩余的氨基酸序列通常与参考多肽中的相应位置一致的的多肽。这样的缺失可以发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端，或者两者兼而有之。

术语多肽或蛋白质的“功能片段”是指作为全长多肽或蛋白质的一部分的肽片段，并且具有与全长多肽或蛋白质基本相同的生物学活性或执行与全长多肽或蛋白质相同的功能(例如进行相同的酶促反应)。

可互换使用的术语“变体多肽”、“修饰的氨基酸序列”或“修饰的多肽”是指与参考多肽相差一个或多个氨基酸，例如一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。一方面，变体是“功能变体”，其保留了参考多肽的一些或全部能力。

术语“功能变体”进一步包含保守取代的变体。术语“保守取代的变体”是指具有与参考肽相差一个或多个保守氨基酸取代，并维持所述参考肽的一些或全部活性的氨基酸序列的肽。“保守氨基酸取代”是用功能相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的实例包含用一个非极性(疏水)残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)取代另一个；用一个带电荷或极性(亲水性)的残基取代另一个，例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、苏氨酸和丝氨酸之间；用一个碱性残基(例如赖氨酸或精氨酸)取代另一个；或用一个酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一个；或用一个芳香族残基(例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代另一个。预计此类取代对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点几乎没有影响。短语“保守取代的变体”还包含其中残基被化学衍生的残基置换的肽，条件是所得肽维持如本文所描述的参考肽的一些或全部活性。

与本发明技术的多肽相关的术语“变体”还包含具有与参考多肽的氨基酸序列至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％且甚至100％一致的氨基酸序列的功能活性多肽。

术语“同源”在其所有语法形式和拼写变化中是指具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系，包含来自超家族的多核苷酸或多肽和来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白质(Reeck等人，CELL 50:667,1987)。这种多核苷酸或多肽具有序列同源性，如其序列相似性所反映的，无论是在同一性百分比上，还是在保守位置上存在特定氨基酸或基序。例如，两个同源多肽可以具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少900、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、甚至100％一致的氨基酸序列。

“合适的调节序列”应赋予本领域普通技术人员其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指代位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或转译的核苷酸序列。调节序列可包含启动子、转译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。

“启动子”应赋予本领域普通技术人员其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指代能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'处。启动子可完全来源于天然基因，或由来源于自然界中所发现的不同启动子的不同元素构成，或甚至包含合成DNA区段。本领域的技术人员应理解，不同启动子可引导基因在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或响应于不同的环境条件来表达。导致基因在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下，调节序列的确切边界尚未完全确定，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制之下)，则所述启动子述编码序列可操作地连接。编码序列可以有义或反义方向可操作地连接至调节序列。

本文所用的术语“表达”应赋予本领域普通技术人员其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指代源于本发明技术的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。“过表达”是指基因产物在转基因或重组生物中的产量超过正常或非转化生物中的产量水平。

“转化”应赋予本领域普通技术人员其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指代将多核苷酸转移到靶细胞中。可以将转移的多核苷酸并入靶细胞的基因组或染色体DNA中，从而产生遗传稳定的遗传，或者可以独立于宿主染色体进行复制。含有转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“转化的”或“重组的”。

当在本文中与宿主细胞结合使用时，术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”应赋予本领域普通技术人员其相应的普通和习惯的含义，并且用于但不限于指代宿主生物的细胞，诸如植物或微生物细胞，其中已引入异源核酸分子。所述核酸分子可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或者所述核酸分子可以作为染色体外的分子存在。这种染色体外的分子可以自动复制。转化的细胞、组织或受试者被理解为不仅包含转化过程的终产物，而且还包含其转基因子代。

当在本文中与多核苷酸结合使用时，术语“重组”、“异源”和“外源”应赋予本领域普通技术人员其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指代多核苷酸(例如，DNA序列或基因)源自特定宿主细胞的外源，或者如果来自相同来源，则从其原始形式进行修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包含特定宿主细胞内源的基因，但是已经通过例如使用定点诱变或其它重组技术进行修饰。所述术语还包含天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，所述术语是指与细胞外源或异源，或与细胞同源，但在宿主细胞内通常不存在所述元件的位置或形式的DNA区段。

类似地，当在本文中与多肽或氨基酸序列结合使用时，术语“重组”、“异源”和“外源”是指多肽或氨基酸序列源自特定宿主细胞外源，或如果来自相同来源，则从其原始形式进行修饰。因此，重组DNA区段可以在宿主细胞中表达以产生重组多肽。

“蛋白质表达”是指基因表达后产生的蛋白质。其由DNA转录为信使RNA(mRNA)之后的阶段组成。然后将mRNA转译成多肽链，最终将其折叠成蛋白质。DNA通过转染存在于细胞中，即一种故意将核酸引入细胞的过程。所述术语通常用于真核细胞中的非病毒方法。其可以指代其它方法和细胞类型，尽管其它术语是优选的：“转化”更常用于描述细菌、非动物真核细胞(包含植物细胞)中的非病毒DNA转移。在动物细胞中，转染是优选术语，因为转化也用于指在这些细胞中进展到癌变状态(致癌作用)。转导通常用于描述病毒介导的DNA转移。对于本申请，转化、转导和病毒感染包含在转染的定义下。

术语“质粒”、“载体”和“基因盒”应赋予本领域普通技术人员其相应的普通和习惯的含义，并且用于但不限于指代通常携带基因的额外染色体元件，所述基因携带不是细胞中央代谢的一部分，通常以环状双链DNA分子的形式存在。这些元件可以是源自任何来源的单链或双链DNA或RNA的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，为线性或环状的，其中许多核苷酸序列已被连接或重组为独特的结构，该结构能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列以及适当的3'未转译序列引入到细胞中。“转化基因盒”是指含有外源基因并且除外源基因外还具有促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达基因盒”是指含有外源基因并且除外源基因外还具有允许所述基因在外源宿主中增强表达的元件的特定载体。

如本文所使用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分(例如核苷酸或氨基酸)的比对窗口中不变的程度。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性部分”是两个比对序列所共有的相同组分的数量除以参考序列片段中的组分总数，即整个参考序列或参考序列的较小定义部分。

如本文所使用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当两个序列最佳比对时(在比较窗口中，适当的核苷酸插入、缺失或间隔合计少于参考序列的20％)，与测试(“受试者”)多核苷酸分子(或其互补链)相比，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员熟知的，并且可以通过诸如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法等工具，并且优选地通过这些算法的计算机化实施(如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，可作为Wisconsin(Accelrys Inc.,Burlington,MA)的一部分获得)来进行。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性部分”是两个比对序列所共有的相同组分的数量除以参考序列区段中的组分总数，即整个参考序列或参考序列的较小定义部分。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其一部分或与更长的多核苷酸序列的比较。为了本发明的目的，“同一性百分比”也可以使用用于转译的核苷酸序列的BLASTX版本2.0和用于多核苷酸序列的BLASTN版本2.0来确定。

优选使用序列分析软件包^TM(第10版；威斯康星州麦迪逊市的Genetics ComputerGroup,Inc.)的“Best Fit”或“Gap”程序来确定序列同一性的百分比。“Gap”利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY)48:443-453,1970)来找到使匹配数最大并使间隙数最小的两个序列的比对。“BestFit”使用Smith和Waterman的局部同源算法(Smith和Waterman,应用数学进展(ADVANCES INAPPLIED MATHEMATICS),2:482-489,1981,Smith等人，核酸研究(NUCLEIC ACIDSRESEARCH)11:2205-2220,1983)来进行两个序列之间的最佳相似性区段的最佳比对并插入间隙以使匹配数最大。同一性百分比最优选使用“BestFit”程序确定。

确定序列同一性的有用方法还公开在基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中，所述程序可从马里兰州贝塞斯达市国立卫生研究院国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)20894公开获得；见BLAST手册，Altschul等人，NCBI,NLM,NIH；Altschul等人，分子生物学杂志(J.MOL.BIOL.)215:403-410(1990)；BLAST程序的2.0或更高版本允许在比对中引入间隙(缺失和插入)；对于肽序列，BLASTX可用于确定序列同一性；；并且，对于多核苷酸序列，BLASTN可用于确定序列同一性。

如本文所用，术语“基本序列同一性百分比”是指如下序列同一性百分比：至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％同一性、至少约90％序列同一性，或者甚至更大的序列同一性，例如约98％或约99％序列同一性。因此，本发明的一个实施方案是具有与本文所述的多核苷酸序列至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％同一性、至少约90％序列同一性、或甚至更大的序列同一性(例如约98％或约99％序列同一性)的多核苷酸分子。具有本发明的活性基因的多核苷酸分子能够引导香草醛的产生，并且与本文提供的多核苷酸序列具有相当大百分比的序列同一性，并且包含在本发明的范围内。

同一性是指序列比对后一对序列之间相同的氨基酸部分(可以仅使用序列信息或结构信息或一些其它信息来完成，但通常仅基于序列信息即可)，并且相似性是基于使用一些相似性矩阵的比对而分配的分数。相似性指数可以是以下BLOSUM62、PAM250或GONNET中的任何一种，或者是本领域技术人员用于蛋白质序列比对的任何矩阵。

同一性是两个子序列之间的对应程度(序列之间没有间隙)。25％或更高的同一性意味着功能的相似性，而18至25％意味着结构或功能的相似性。请记住，两个完全不相关或随机序列(大于100个残基)可以具有高于20％的同一性。相似性是两个序列进行比较时的相似程度。这取决于序列的同一性。

编码核酸序列

本发明涉及编码如本文所述的木质二苯乙烯-α,β-双加氧酶的核酸序列，其可以用于进行所需的基因工程操作。本发明还涉及与本文具体公开的序列具有一定程度“同一性”的核酸。例如，本发明的各方面涵盖与SEQ ID NO.1至少60％同一性、与SEQ ID NO.1至少65％同一性、与SEQ ID NO.1至少70％同一性、与SEQ ID NO.1至少75％同一性、与SEQ IDNO.1至少80％同一性、与SEQ ID NO.1至少85％同一性、与SEQ ID NO.1至少90％同一性、与SEQ ID NO.1至少95％同一性、或与SEQ ID NO.1至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，用于编码适用于本发明的木质二苯乙烯-α,β-双加氧酶的核酸序列可以具有与SEQID NO.1相同的核酸序列。

本发明还涉及编码木质二苯乙烯-α,β-双加氧酶的核酸序列，其具有与SEQ IDNO.2至少60％同一性、与SEQ ID NO.2至少65％同一性、与SEQ ID NO.2至少70％同一性、与SEQ ID NO.2至少75％同一性、与SEQ ID NO.2至少80％同一性、与SEQ ID NO.2至少85％同一性、与SEQ ID NO.2至少90％同一性、与SEQ ID NO.2至少95％同一性、或与SEQ ID NO.2至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，木质二苯乙烯-α,β-双加氧酶可具有与SEQ ID NO.2相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明可以涉及编码任何前述酶的功能等效物的核酸序列。

根据本发明的构建体

在一些方面，本发明涉及构建体，如用于表达木质二苯乙烯-α,β-双加氧酶的表达载体。

在一个实施方案中，表达载体包含用于在各种宿主细胞中表达本文所述的重组多肽(即，FfLSD)的那些遗传元件。宿主细胞中用于转录和转译的元件可以包含启动子、蛋白质复合物的编码区和转录终止子。

本领域普通技术人员将了解可用于制备表达载体的分子生物学技术。如上所述，用于并入本发明技术的表达载体中的多核苷酸可以通过诸如聚合酶链反应(PCR)的常规技术制备。在分子克隆中，载体是一种DNA分子，用作将外来遗传物质人工携带到另一个细胞中的运载体(vehicle)，其可以被复制和/或表达(例如质粒、粘粒、λ噬菌体)。含有外源DNA的载体被认为是重组DNA。载体的四种主要类型是质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。其中最常用的载体是质粒。所有工程改造的载体的共同点是复制起点、多克隆位点和选择标记。

已经开发了许多分子生物学技术，以通过互补的粘性末端将DNA可操作地连接到载体。在一个实施方案中，互补均聚物束可以添加到核酸分子中，以插入到载体DNA中。然后，载体和核酸分子通过互补均聚物尾部之间的氢键结合而形成重组DNA分子。

在替代的实施方案中，含有一个或多个限制性位点的合成连接子用于将本发明技术的多核苷酸可操作地连接至表达载体。在实施方案中，通过限制性核酸内切酶消化产生多核苷酸。在实施方案中，用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理核酸分子，所述酶以3'-5'-核酸外切活性去除突出的3'-单链末端，并以聚合活性填充凹陷的3'-末端，从而产生钝端DNA区段。然后在能够催化钝末端DNA分子(诸如噬菌体T4 DNA连接酶)连接的酶的存在下，将钝末端区段与大量摩尔过量的连接子分子一起孵育。因此，反应产物是在其末端带有聚合物连接子序列的多核苷酸。然后将这些多核苷酸用适当的限制酶切割，并连接至已经用产生与所述多核苷酸的末端相容的末端的酶切割的表达载体。

或者，可以利用具有连接非依赖性克隆(LIC)位点的载体。然后可以将所需的PCR扩增的多核苷酸克隆到LIC载体中，而无需限制性消化或连接(Aslanidis和de Jong,核酸研究18 6069-74,(1990)，Haun等人，生物技术(BIOTECHNIQUES)13,515-18(1992)，其中每一个通过引用的方式并入本文中)。

在一个实施方案中，为了分离和/或修饰感兴趣的多核苷酸以插入到所选择的质粒中，使用PCR是合适的。可以设计用于序列的PCR制备的适当引物，以分离核酸分子的所需编码区，添加限制性核酸内切酶或LIC位点，将编码区置于预期阅读框中。

在实施方案中，使用PCR适当的寡核苷酸引物制备用于并入本发明技术的表达载体的多核苷酸。扩增编码区，而引物本身被并入扩增的序列产物中。在实施方案中，扩增引物含有限制性核酸内切酶识别位点，其允许将扩增的序列产物克隆到适当的载体中。

可以通过常规转化或转染技术将表达载体引入植物或微生物宿主细胞。用本发明技术的表达载体对适当细胞的转化是通过本领域已知的方法实现的，并且通常取决于载体和细胞的类型。合适的技术包含磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、化学穿孔或电穿孔。

可以通过本领域众所周知的技术鉴别成功转化的细胞，即含有表达载体的那些细胞。例如，可以培养用本发明技术的表达载体转染的细胞以产生本文所述的多肽。可以通过本领域众所周知的技术检查细胞是否存在表达载体DNA。

宿主细胞可以含有先前描述的表达载体的单个拷贝，或者可以含有表达载体的多个拷贝。

在一些实施方案中，所述转化细胞是植物细胞、藻类细胞、并非炭疽菌的真菌细胞或酵母细胞。在一些实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：油菜植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞、大豆植物细胞和矮牵牛植物细胞。

微生物宿主细胞表达系统和表达载体，其含有引导外源蛋白高水平表达的调节序列，这是本领域技术人员众所周知的。这些中的任何一种都可以用于构建载体以在微生物宿主细胞中表达本发明技术的重组多肽。然后可以将这些载体通过转化引入适当的微生物中，以允许本发明技术的重组多肽的高水平表达。

可用于转化合适的微生物宿主细胞的载体或基因盒是本领域众所周知的。通常，载体或基因盒含有引导相关多核苷酸的转录和转译的序列、选择标记以及允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含具有转录起始控制的多核苷酸的5'区和控制转录终止的DNA片段的3'区'。优选的是，两个控制区均源自与转化的宿主细胞同源的基因，尽管应理解，此类控制区不必源自被选作宿主的特定物种的天然基因。

终止控制区也可以源自微生物宿主天然的各种基因。对于本文所述的微生物宿主，可以任选地包含终止位点。

优选的宿主细胞包含那些已知具有从异丁香酚产生香草醛的能力的细胞。例如，优选的宿主细胞可以包含大肠杆菌属和假单胞菌属的细菌。

香草醛的发酵生产

异丁香酚通过涉及丙烯基苯侧链氧化的环氧化物-二醇途径代谢成香草醛(图1)。发明人惊奇地发现，与先前报道的细菌IEM和LSD相比，来自真菌藤仓镰刀菌(Fusariumfujikuroi)(FfLSD)的推定的木质二苯乙烯-α,β-双加氧酶在异丁香酚向香草醛的生物转化中显示出惊人的高活性。更具体地，通过工程改造具有FfLSD基因的宿主菌株并在包含异丁香酚的混合物中培育工程改造的宿主菌株，发明人能够以高于14g/L的效价实现香兰素生产，转化率高于90％。在不使用其它粗酶和/或亚因子的情况下获得了高滴度和高转化率。

宿主细胞的培育可以在常见营养物质存在下在水性培养基中进行。例如，合适的培养基可以含有碳源、有机或无机氮源、无机盐和生长因子。对于培养基，葡萄糖可以是优选的碳源。酵母提取物可以是一种有用的氮源。可以添加磷酸盐、生长因子和微量元素。

可以在生物反应器中制备培养液并对其灭菌。然后可以将根据本发明的工程改造的宿主菌株接种到培养液中，以开始生长期。生长期的适当持续时间可为约5至40小时，优选约10至35小时，且最优选约10至20小时。

在生长期结束后，发酵液的pH值可以转变为8.0或更高的pH值，并且可以将底物异丁香酚加入到培养物中。合适的底物加入量为0.1至40g/L发酵液，优选约0.3至30g/L。底物可以固体材料形式或以水溶液或悬浮液形式加入。所述总量的底物可以在一个步骤中、在两个或更多个加料步骤中加入或以连续方式加入。

生物转化期从底物加料开始并持续约5至50小时，优选10至40小时，最优选15至30小时，即直到所有底物都转化为产物和副产物为止。

在生物转化期终止之后，可以通过任何公知的方法(例如离心或膜过滤等)将生物质与发酵液分离以获得无细胞发酵液。

可以使用例如水不混溶的有机溶剂、植物油或任何固体萃取剂，例如树脂，优选中性树脂，将萃取相添加到发酵液中。发酵液可以进一步经灭菌或巴氏杀菌。在一些实施方案中，可以浓缩发酵液。可以使用例如连续的液-液萃取过程或分批萃取过程从发酵液中选择性地萃取香草醛。

本发明的优点尤其包含在相同培养基中进行生长期和随后的生物转化期的能力。这高度简化了生产过程，使所述过程高效且经济，从而可以将规模扩大到工业生产水平。

本领域技术人员将认识到，通过本文所述的方法生产的香草醛组合物可以进一步纯化并与如上所述的芳香和/或调味消耗品以及膳食补充剂、药用组合物、药妆品混合，以用于营养以及医药产品中。

在考虑以下非限制性实施例的情况下，将更充分地理解本公开。应当解，这些实施例虽然指示了本发明技术的优选实施方案，但仅通过说明的方式给出。通过以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明技术的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明技术进行各种更改和修改，以使其适应各种用途和条件。

实施例

细菌菌株、质粒和培养条件。

DH5a和BL21(DE3)的大肠杆菌菌株购自Invitrogen。大肠杆菌菌株W3110是从耶鲁大学的大肠杆菌遗传资源中心(http://cgsc2.biology.yale.edu/)获得的。质粒pET28a购自EMD Millipore(美国马萨诸塞州比勒利卡)。质粒pUVAP由发明人使用SEQ ID NO.3并基于图2中所示的图谱构建，用于基因克隆和基因表达目的。

DNA操作。

所有DNA操作均按照标准程序进行。限制酶，即T4 DNA连接酶，购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)。所有PCR反应均根据制造商的指导使用新英格兰生物实验室的Phusion PCR系统进行。

实施例1：靶基因的鉴别

从藤仓镰刀菌的基因组中鉴别出具有1569bp的完整ORF(开放阅读框)和XM_023575505.1的NCBI参考序列的推定基因。其推导的蛋白质，即FFUJ-11801，被注释为木质二苯乙烯α,β-双加氧酶(维曼(Wiemann)等人2013)。ORF编码具有522个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:2)，理论分子量为59kDa，且计算的等电点(pI)为6.26。相应的核苷酸由GeneUniversal Inc.公司(美国新泽西州纽瓦克)在密码子优化后合成以便在大肠杆菌中表达(SEQ ID NO:1)。

生物信息学分析表明，FfLSD表现出与先前报道的来自假单胞菌属的LSD的同一性较低。具体地，生物信息学分析表明FfLSD仅与来自少动假单胞菌(Pseudomonaspaucimohilis)TMYI009的LSD具有35％的同一性。关于异丁香酚单加氧酶(IEM)，FfLSD仅显示出与PnIEM(一种来自硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)的IEM)36％的同一性。

实施例2：质粒的构建

将FfLSD的开放阅读框(ORF)克隆到pET28a的Nde I/Xho I限制位点，以使重组蛋白在N端具有6XHis标签，便于提取和纯化。通过在5'端引入Nde I限制位点并在3'端引入Xho I位点，用表1中的一对引物f FfLSD-NdeI-F和FfLSD-Xho I-R1扩增FfLSD的ORF。用NdeI和Xho I消化后，将PCR片段连接到表达载体pET28a的Nde I和Xho I的限制位点，并转化为DH5α感受态细胞，生成FfLSD-pET28质粒(图3)。测序确认后，质粒准备转化为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

为了在发酵罐中产生用于将异丁香酚生物转化为香草醛的大肠杆菌菌株，将FfLSD的开放阅读框克隆到pUVAP载体的Nde I/Not I位点(图2)，以生成FfLSD-pUVAP的表达载体(图4)，其采用相同的上述程序，除了使用的引物是FfLSD-Nde-F和FfLSD-NotI-R2之外。具有此构建体的所表达的FfLSD没有His标签。

表1.用于构建FfLSD表达载体的引物

实施例3：用开发的构建体转化大肠杆菌细胞。

用标准化学转化方案将FfLSD-pET28a的构建体引入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，以生产菌株FfLSD-BL21。菌株FfLSD-BL21用于表达重组蛋白以进行功能表征。

用标准化学转化方案将FfLSD-pUVAP质粒引入大肠杆菌W3110感受态细胞中，生成FfLSD-W3110菌株，类似地，用pUVAP质粒开发FfLSD-W-对照的对照菌株。菌株FfLSD-W3110和FfLSD-W-对照用于将异丁香酚全细胞生物转化为香草醛。

实施例4：FfLSD在大肠杆菌中的异源表达和重组蛋白的纯化

使大肠杆菌菌株FfLSD-BL21的单个菌落在具有100mg/L卡那霉素(kanamycin)的5mL LB培养基中于37℃生长过夜。将此菌种培养物转移到具有100mg/L氨苄青霉素(ampicillin)的200mL LB培养基中。细胞在37℃以250rpm生长至OD600为0.6至0.8，然后添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)，使最终浓度为0.5mM，并将生长温度变为16℃。在IPTG诱导16小时后，通过在4℃以4000g离心15min来收集大肠杆菌细胞。将所得团块重新悬浮于5mL的100mM Tris-HCl、pH 7.4、100mM NaOH、10％甘油(v/v)中，并在冰上超声处理2min。将混合物在4℃以4000g离心20min。按照制造商的方案，用来自Clonetech Inc.的His60 Ni Superflow树脂纯化上清液中的重组蛋白。通过SDS-PAGE检查重组蛋白的纯化(图5)。

实施例5：体外酶测定

FfLSD的活性分别由两种底物4,4'-二羟基-3,3'-二甲氧基二苯乙烯和异丁香酚确定。为了测量对4,4'-二羟基-3,3'-二甲氧基二苯乙烯的活性，在含有适量酶溶液的2.5ml的50mM Tris-HCI缓冲液(PH 8.5)中于30℃测定活性。通过添加溶解在10μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中的底物使最终浓度为200μM来开始酶反应。用HPLC分析检测反应产物香草醛。

纯化的蛋白质没有显示出对4,4'-二羟基-3,3'-二甲氧基二苯乙烯的活性。当与4,4'-二羟基-3,3'-二甲氧基二苯乙烯一起孵育时，未通过HPLC分析观测到香草醛的产生。

还用异丁香酚通过测量香草醛的形成来测量活性。反应混合物含有10mM异丁香酚、100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、10％(v/v)乙醇和适量的酶，总体积为1ml。通过添加异丁香酚作为乙醇溶液来开始反应，在30℃下进行往复振动(每分钟160次)10min，并用1ml甲醇停止反应。在21,500离心后，通过HPLC分析上清液以测定异丁香酚、香草醛、香草醇。将在沸水中处理5分钟的FfLSD酶用作阴性对照。

图6示出使用纯化的FfLSD(上图)和阴性对照(下图)通过实验中的上清液获得的HPLC色谱图。如图所示，纯化的FfLSD显示出对异丁香酚的高活性。几乎所有添加到反应混合物中的异丁香酚都转化为香草醛(上图)。如所预期，阴性对照(下图)没有产生香草醛。

实施例6：用摇瓶在体内将异丁香酚生物转化为香草醛

使FfLSD-W3110和FfLSD-W-对照的大肠杆菌W3110菌株作为菌种培养物分别在具有含50μg/L氨苄青霉素的3ml LB的LB培养基中于37℃生长过夜。将0.2mL的菌种培养物接种到125mL摇瓶中包含5g/L酵母提取物和50μg/L氨苄青霉素的20mL M9培养基中。使细胞在摇床转速为250rpm的摇床中于30℃生长6小时，然后添加400μl的20％异丁香酚(v/v于二甲亚砜(DMSO)中)至烧瓶中。在首次添加12小时和24小时之后，再向培养物中添加两次200μl的20％异丁香酚(v/v于DMSO中)。分别以指定的时间间隔从烧瓶中取出100μl的培养混合物，并通过涡旋与900μl甲醇充分混合，然后在20,000g下离心15min。将所得的50μL上清液放入HPLC样品小瓶中进行HPLC分析。实验一式三份进行。

图7比较了大肠杆菌菌株FfLSD-W3110与大肠杆菌菌株FfLSD-W-对照的香草醛产量。如图7所示，具有FfLSD的菌株在培养基中将异丁香酚转化为香草醛，而对照菌株未产生香草醛。

实施例7：在发酵罐中将异丁香酚生物转化为香草醛

开发了一种发酵工艺，以使用FfLSD-W3110菌株在发酵罐中以天然异丁香酚为底物生产天然香草醛。具体来说，将1mL的FfLSD-W3110甘油储备液接种到在500mL烧瓶中的100mL菌种培养基(含有5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl和50mg/L氨苄青霉素的Luria-Bertani培养基)。将菌种在摇床转速为200rpm的摇床中于37℃培育8小时，然后转移到5升发酵罐中具有Luria-Bertani培养基中加10g/L初始葡萄糖、50mg/L氨苄青霉素的3升发酵培养基中。

5升香草醛发酵罐工艺有两个阶段：细胞生长阶段和生物转化阶段。细胞生长阶段是从经过发酵时间(EFT)0小时到约EFT 16.5小时。发酵参数设置如下：空气流量：0.6vvm；通过使用4N NaOH控制pH值不低于7.1。生长温度设置为30℃，且搅拌速度设置为300至500rpm。溶解氧(DO)级联搅拌以保持在30％以上。生长时间约为16至17小时。

生物转化阶段是从EFT 16.5小时到46.5小时。发酵参数设置如下：空气流量：0.4vvm。用4N NaOH控制pH值不低于8.0，并且温度为30℃。搅拌速度设置为250至500rpm，并且通过级联搅拌将DO保持在30％以上。在EFT 16.5小时以0.6g/L的加料速率加入异丁香酚，然后在EFT 27.5小时将速率降低至0.4g/L，直到EFT 44小时，并且在EFT 46-47小时完成发酵阶段。

以指定的时间间隔从发酵罐中取出培养混合物。用Vanquish Ultimate 3000系统进行异丁香酚、香草醛和香草醇的HPLC分析。在Dionex Acclaim 120 C18柱(粒径3μm；150×2.1mm)上通过反相色谱分离中间物，梯度为0.2％(体积/体积)三氟酸(洗脱剂A)和乙腈，含在10至40％(体积/体积)洗脱剂B的范围内的0.2％(体积/体积)(洗脱剂B)，流速为0.6ml/min。为了定量，所有中间物均使用外部标准进行校准。通过其保留时间以及相应的光谱来鉴别所述化合物，这些光谱是用系统中的二极管阵列检测器鉴别的。

图8示出了在从EFT 16.5小时到46.5小时的生物转化阶段，香草醛的产生量相对于异丁香酚的剩余量和香草醇的产生量。如图8所示，香草醛生产效价达到14g/L以上，异丁香酚的转化率为90％以上。

从前述描述中显而易见的是，本公开的某些方面不受本文提供的实例的特定细节的限制，并且因此可以预期，本领域技术人员将想到其它修改和应用或其等同物。因此，意图是权利要求书应涵盖不脱离本公开的精神和范围的所有此类修改和应用。

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尽管为了理解的目的已经通过图示和示例的方式详细地描述了前述发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，可以实施某些改变和修改。因此，本说明书和实施例不应被解释为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求限定。

感兴趣序列

SEQ ID NO.1：FfLSD的核酸序列

ATGAGCGCACCGGAAGAACATCATGGTCTGAAAAGCAAATGGCCTCAGGCATTTGATCTGGCAGGTAGCAATAGCCCGTGTCGTATTGAAGGTGAAATTGGTGATCTGGTTGTTCTGGGTGAAATTCCGCCTGCAATTGATGGCACCTTTTATCGTGTTATGTGTGATCCGTTTGTTCCGCCTCATCCGGATAATGTTCCGCTGGATGGTGATGGTCATGTTAGCGCATTTCGTATCTATAATGGTCGCGTGGACATGAAAATCAAATATGTTGAAACCGAGCGCTACAAACTGGAACGTAAAGCAGGTAAAGCACTGTTTGGTCTGTATCGTAATCCGTTTACACATCATCCGTGTGTTCGTGCAGCAGTTGATAGCACCGCAAATACCAATATGGTTTATTGGGCAGATCGTCTGCTGGCACTGAAAGAAAGCGCACTGCCGTATGAAATGCATCCTGATACACTGGAAACCCTGTGTTATGATCCTTTTGGTGGTCAGGTTAAAGCAAAAGCATTTACCGCACATCCGAAAATCGATCCGTTTAGTGATGAACTGGTTGTGTATGGTTATGAAGCAAAAGGTCTGGCAACCCGTGATATTGTGATTTATAGCCTGGATAAAAACGGCATCAAACACGATGAACAGTGGATTGAAAGCCCGTGGTGTGCACCGATTCATGATTGTGTTATTACCCCGAACTTTATCGTTCTGATTCTGTGGCCGTTTGAAGCAAGCGTTGAACGTATGAAAGCCGGTAAACAGCATTGGGCATGGGATTATAGTCTGCCTGCAACCTTTATTGTTGTTCCGCGTCGTAAAACCAGCAAAATTCCGGCAAGCTGGAAACAGGGTGAACATCGTGTGTATCATTGGAAAAACTGCATGAACATTCATGCCGGTAGCGCATGGGAAGAAGATAACGGTAAACTGTATCTGGAAACCAGCCGTGTTCATGATAATGCCTTTCCGTTTTTTCCTCCGGTTGATGGTCGTATGCCTGCACCGGATGCAAAAGCAGATTTTGTTCGTTGGGAAATTGATCTGAATGCACCGAGCGGCACCCAGATGGCAGATCCGGAAGTTATTCTGGATGTTCCGAGCGAATTTCCGCGTATTGATGAACGTTTTATGACCAAACGTAACGAGTACCTGTTTCTGAATGTGTTTATTCCGGAAACCAGTCAAGGTGGCACCAACATTTTTCATGGCCTGAATGGTCTGGCCATGCATAATCATAGCACCGGTGAAACCAAATGGTTTTTTGCCGGTAAAGATAGCCTGGTTCAAGAACCGATCTTTATTCCGCGTACCGCAGATGCTCCGGAAGGTGATGGTTGGGTTATTGCAATGCTGGAACGTCGTGTTGCAAATCGTAGCGAACTGGTGGTTCTGGATACCCGTGAATTTGAAAAACCGGTTGCATTTATTCAGCTGCCGATGCATCTGAAAGCACAGGTTCATGGTAATTGGATTGATAGTCGTACCCGTGCAAGCACCGAAGCAATTGTTCGTCAGATTGGTGAAGTTAAAGTTAGCGCACGTGGTGCACTGGAACCGCTGGCATAA

SEQ ID NO.2FfLSD的氨基酸序列

MSAPEEHHGLKSKWPQAFDLAGSNSPCRIEGEIGDLVVLGEIPPAIDGTFYRVMCDPFVPPHPDNVPLDGDGHVSAFRIYNGRVDMKIKYVETERYKLERKAGKALFGLYRNPFTHHPCVRAAVDSTANTNMVYWADRLLALKESALPYEMHPDTLETLCYDPFGGQVKAKAFTAHPKIDPFSDELVVYGYEAKGLATRDIVIYSLDKNGIKHDEQWIESPWCAPIHDCVITPNFIVLILWPFEASVERMKAGKQHWAWDYSLPATFIVVPRRKTSKIPASWKQGEHRVYHWKNCMNIHAGSAWEEDNGKLYLETSRVHDNAFPFFPPVDGRMPAPDAKADFVRWEIDLNAPSGTQMADPEVILDVPSEFPRIDERFMTKRNEYLFLNVFIPETSQGGTNIFHGLNGLAMHNHSTGETKWFFAGKDSLVQEPIFIPRTADAPEGDGWVIAMLERRVANRSELVVLDTREFEKPVAFIQLPMHLKAQVHGNWIDSRTRASTEAIVRQIGEVKVSARGALEPLA

SEQ ID NO.3质粒pUVAP的核酸序列

GGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCATCGTTTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCAACTATAAGAAGGAGATATACATATGGCGGATCCGAATTCGGCGCGCCAGATCTCAATTGGATATCGGCCGGCCGACGTCGGTACCGCGGCCGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGGTAACGAATTCAAGCTTGATATCATTCAGGACGAGCCTCAGACTCCAGCGTAACTGGACTGCAATCAACTCACTGGCTCACCTTCACGGGTGGGCCTTTCTTCGGTAGAAAATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCATCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGTGATTACATTTGGGCCCTCATCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCATTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAAGTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACTTTCTGCTATGGAGGTCAGGTATGATTTAAATGGTCAGTATTGAGCGATATCTAGAGAATTCGTC