具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。

在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。

在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例

为解决现有的用于测定抗甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，在超声混匀的仪器上使用时，精密度较差导致临床样本测定异常的技术问题，第一方面，本发明实施例提供一种磁珠，包括：包被有活化官能团的磁珠；以及TG抗原，通过与所述活化官能团反应包被在磁珠上。

通过TG抗原包被在包被有活化官能团的磁珠上，使在超声混匀的仪器上测定抗甲状腺球蛋白抗体时，精密度和准确度较现有的测定抗甲状腺球蛋白抗体的试剂更优。

其工作原理为：当所述磁珠与溶液中的Anti-TG抗体混合时，TG抗原与 Anti-TG抗体进行特异性反应结合，从而将溶液中的Anti-TG抗体固定在磁珠上，再加入ALP标记鼠抗人IgG抗体与Anti-TG抗体结合，形成了TG抗原-Anti-TG 抗体-ALP标记鼠抗人IgG抗体复合物，再加入发光底物，酶结合物催化发光底物发射光子，使用仪器测量这些光子，光子的数量与样本中Anti-TG的浓度成正比。通过浓度-相对发光值(RLU)的校准曲线，即可计算出样本中Anti-TG的浓度。

进一步的，所述包被有活化官能团的磁珠为链霉亲和素磁珠、环氧基磁珠、羧基磁珠或甲苯磺酰基磁珠。

进一步的，所述包被有活化官能团的磁珠为甲苯磺酰基磁珠。

进一步的，1mg包被有活化官能团的磁珠对应的TG抗原的包被质量为20ug。

第二方面，本发明实施例提供一种所述磁珠的制备方法，包括：

将所述磁珠与硼酸缓冲液混合配制成混合液；

将所述混合液涡旋、超声处理后，磁力吸附移走上清液，得到处理后的第一磁珠；

将处理后的第一磁珠与硼酸缓冲液混合、涡旋、孵育混匀，磁力吸附移走上清液，得到第二磁珠；

将硼酸缓冲液与TG抗原混合加入第二磁珠中，进行涡旋、滚动混匀得到混匀液；

将混匀液与磷酸钾水溶液混合、涡旋、滚动孵育、移走上清液得到第三磁珠；

将第三磁珠与含有牛血清白蛋白的Tris-Hcl缓冲液滚动混匀，磁力吸附移走上清液，得到TG抗原包被的甲苯磺酰基磁珠。

进一步的，所述硼酸缓冲液中硼酸浓度为0.1mol/L；磷酸钾水溶液中磷酸钾的浓度为3mol/L。

进一步的，所述含有牛血清白蛋白的Tris-Hcl缓冲液为含质量分数为 0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液。

第三方面，本发明实施例提供一种磁珠用于测定抗甲状腺球蛋白抗体的用途。

第四方面，本发明实施例提供一种用于测定抗甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，包括所述磁珠。

进一步的，所述试剂盒还包括酶工作液。

实施例1

一种用于测定抗甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，包括TG抗原包被的链霉亲和素磁珠和酶工作液。

所述TG抗原包被的链霉亲和素磁珠为：

A、取0.25mg TG抗原，用0.02M PBS(pH7.4)缓冲液5L进行2～8℃透析过夜。

B、取出透析好的TG抗原于适当容器，准确量取体积并记录，将TG抗原稀释为0.2mg/mL备用。

C、称取1.0mg的BNHS，用217μL DMSO充分溶解，配制成10mmol/L的 BNHS溶液。

D、按照BNHS与TG抗原的质量比例20：1，将BNHS溶液加入到B所得的TG抗原稀释液中，充分混匀后室温反应30min。(即1.0mg的抗体加入 10mmol/L BNHS溶液13.3μL；0.25mg加入配置好的10mmol/L BNHS溶液3.3μL)

E、取1mol/LTris缓冲液进行终止反应，加入1mol/LTris缓冲液于反应液中。加入Tris的体积为上述反应液终体积的百分之一，充分混匀，室温反应10min。

F、取出终止后的反应液装入透析袋，用0.02M PBS(pH值为7.4)缓冲液 5L进行2～8℃透析过夜。

G、将透析好的生物素抗体取出，并准确量取体积，加入等体积的丙三醇，贴签，并记录浓度，于-20℃保存，备用。

H、将生物素标记好的生物素抗体包被链霉亲和素磁珠，包被量为20μg/mg，获得TG抗原包被的链霉亲和素磁珠。用1％BSA的缓冲液Buffer稀释后，备用。

实施例2

一种用于测定抗甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，包括TG抗原包被的环氧基磁珠和酶工作液。

所述TG抗原包被的环氧基磁珠的制备方法为：

A.取6mg的环氧基磁珠到一支干净的管中加入0.3mL超纯水，使环氧基磁珠的浓度为20mg/mL；

B.涡旋15S，并置于水浴超声5min两次；

C.置于磁力架吸附1min，移走上清；

D.重复步骤B、C；

E.抗原用量：加入TG抗原质量为120ug(TG抗原浓度为1mg/mL,即加入体积为0.12mL的抗原)；

F.0.1M PBS的体积：加入0.18mL 0.1M PBS；

G.将E的TG抗原和F的PBS溶液混合并充分混匀，加入D所得溶液中涡旋5s；

H.向G所得溶液中加入0.2mL的3M硫酸铵溶液，涡旋混匀5s,并在37℃条件下滚动反应3h；

I.反应完成后置于磁力架吸附1min，移走上清液；

J.0.3mL100mM甘氨酸溶液(pH值为11.3)涡旋5s,置于磁力架吸附1min，移走上清液；

K.0.3mL200mM甘氨酸溶液(pH值为2.8)涡旋5s,置于磁力架吸附1min，移走上清液；

L.加入0.3mL含0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液，室温滚动反应10min后置于磁力架吸附1min，移走上清液；

M.加入0.3mL含0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液，37℃滚动反应24h后置于磁力架吸附1min，移走上清液；获得TG抗原包被的环氧基磁珠；用1％BSA的缓冲液对TG抗原包被的环氧基磁珠稀释后备用。

实施例3

一种用于测定抗甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，包括TG抗原包被的羧基磁珠和酶工作液。

所述TG抗原包被的羧基磁珠的制备方法，包括：

A.取5mg的羧基磁珠到一支干净的管中加入1mL 15mM MES缓冲液pH值为6.0；

B.涡旋15S，并置于滚动混运仪混匀10min；

C.重复步骤B；

D.准确称取10mgEDC加入1mL预冷水充分溶解混匀；

E.取0.08mL D所得溶液加入到0.92mL15mM MES缓冲液(pH值为6.0) 充分混匀；

F.向C所得溶液中加入E所得溶液使羧基磁珠的终浓度为5mg/mL，涡旋10s，并滚动混匀30min；

G.置于磁力架吸附1min，移走上清液；

H.抗原用量：加入1mg/mL的TG抗原100uL即抗原质量为0.1mg；

I.加入150uL15mM MES缓冲液(pH值为6.0)将TG抗原稀释至0.4mg/mL, 充分混匀；

J.将I所得溶液加入G所得溶液中，涡旋10s,并滚动孵育3h后，置于磁力架吸附1min，移走上清液；

P.向J所得溶液中加入1mL含0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液，使羧基磁珠浓度为5mg/mL，滚动反应10min后置于磁力架吸附1min，移走上清液；

K.重复P两次；

L.向K所得溶液中加入1mL含0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液，使磁珠浓度为5mg/mL在37℃条件下滚动反应24h，置于磁力架吸附1min，移走上清液；

M.获得TG抗原包被的羧基磁珠；用1％BSA的缓冲液对TG抗原包被的羧基磁珠稀释后备用。

实施例4

一种用于测定抗甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，包括TG抗原包被的甲苯磺酰基磁珠和酶工作液。

一种用于测定抗甲状腺球蛋白抗体的试剂盒，包括TG抗原包被的甲苯磺酰基磁珠和酶工作液。

A.取6mg的甲苯磺酰基磁珠到一支干净的管中加入1.2mL0.1M硼酸缓冲液(pH值为9.5)，使磁珠的浓度为5mg/mL；

B.涡旋30s，并置于水浴超声5min两次；

C.置于磁力架吸附3min，移走上清；

D.加入1.2mL0.1M硼酸缓冲液pH 9.5，涡旋30S，并滚动孵育混匀5min；

E.置于磁力架吸附3min，移走上清；

F.重复E；

G.抗原用量：加入1mg/mL浓度的TG抗原的用量为120ug，需要使用0.1M 硼酸缓冲液(pH值为9.5)的用量为80uL；

I.将G的抗原和硼酸缓冲液混合并充分混匀，加入到F所得溶液中涡旋5s 后滚动混匀5min；

J.加入66.6uL3M磷酸钾水溶液，迅速涡旋5s并放置37℃滚动孵育24h；

K.向J所得溶液中加入1.2mL含0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液滚动混匀10min；

L.置于磁力架吸附，移走上清液；

M.重复K、L两次；

N.向M所得溶液中加入1.2mL含0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液,在37℃滚动孵育24h；

O.置于磁力架吸附，移走上清液；获得TG抗原包被的甲苯磺酰基磁珠；用1％BSA的缓冲液对TG抗原包被的甲苯磺酰基磁珠稀释后备用。

对比实验

实验一：链霉亲和素磁珠、环氧基磁珠、羧基磁珠及甲苯磺酰基磁珠等四种磁珠在包被同等量的TG抗原的情况下，试剂盒灵敏度比较实验。

实验材料：BNHS，DMSO，丙三醇，0.02M PBS(pH值为7.4)缓冲液， 1mol/LTris缓冲液，TG抗原，EDC，0.1M硼酸缓冲液，3mol/L硫酸铵溶液，3mol/L 磷酸钾水溶液，100mmol/L甘氨酸溶液pH11.3和200mmol/L甘氨酸溶液pH值为2.8，含0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液，15mmol/LMES缓冲液pH6.0,超纯水，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记鼠抗人IgG抗体，裸磁珠，Anti-TG校准品cal-1,cal-6(Cal-1到Cal-6的浓度为0，1，5，20，40，80IU/mL)，底物液，清洗液，沃文特生物全自动化学发光免疫分析仪LA2000。

采用实施例1，实施例2，实施例3，实施例4的方法，将上述四种不同结合方式的磁珠，酶工作液共同组成试剂盒，测定Anti-TG校准品cal-1至cal-6，观察不同磁珠的测定曲线及灵敏度，并测定样本S1-S40，与罗氏值进行比较。

反应模式为：先加入校准品50μL，磁珠50μL，37℃共同孵育10min后，加入清洗液在磁场中清洗分离三次，再加入酶工作液100μL37℃孵育10min，加入清洗液在磁场中清洗分离三次后，加入底物液37℃孵育5min后，于全自动化学发光测定仪上检测。实验结果如表1所示。

表1

实验结论：从实验结果来看，四种磁珠组成试剂盒均能与Anti-TG校准品有较好的反应性，同等包被量的TG抗原包被的四种磁珠从灵敏度来看甲苯磺酰基磁珠>环氧基磁珠＝羧基磁珠>链霉亲和素磁珠，链霉亲和素磁珠信号较其他三种磁珠低一半左右，是由于该磁珠最大包被量在10ug/mg，所以即使包被量是 20ugTG抗原包被1mg磁珠但是实际包被到链霉亲和素磁珠的TG抗原是10ugTG 抗原包被1mg磁珠，但是四种磁珠的试剂盒曲线均能满足使用要求。

实验二：四种不同连接方式的磁珠试剂盒精密度验证实验。

参考人抗甲状腺球蛋白抗体行业标准(YY/T 1594-2018)有关精密度验证实验的方法将四种磁珠配制试剂盒分别检测Anti-TG校准品Cal-2和Cal-4各10次计算其相对偏差(CV)，CV越小证明精密度越好；用四种磁珠配制试剂盒连续测试Cal-4水平50测试，观察试剂此50测试的信号，通过信号的趋势来判断各磁珠上TG抗原的脱落情况。

实验材料：BNHS，DMSO，丙三醇，0.02M PBS(pH值为7.4)缓冲液， 1mol/LTris缓冲液，TG抗原，EDC，0.1M硼酸缓冲液，3mol/L硫酸铵溶液，3mol/L 磷酸钾水溶液，100mmol/L甘氨酸溶液pH11.3和200mmol/L甘氨酸溶液pH值为2.8，含0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液，15mmol/LMES缓冲液pH6.0,超纯水，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记鼠抗人IgG抗体，裸磁珠，Anti-TG校准品cal-1,cal-6(Cal-1到Cal-6的浓度为0，1，5，20，40，80IU/mL)，底物液，清洗液，沃文特生物全自动化学发光免疫分析仪LA2000。

反应模式参照实验一。实验结果如表2和表3所示。

表2

表3

实验结论：表2实验结果表明，四种磁珠的精密度为甲苯磺酰基磁珠＝环氧基磁珠＝羧基磁珠>链霉亲和素磁珠；从表3结果来看，随着测试进行，链霉亲和素磁珠和羧基磁珠信号有明显降低到趋势，而甲苯磺酰基磁珠和环氧基磁珠信号无明显降低趋势，说明磁珠上抗原的脱落量为链霉亲和素磁珠>羧基磁珠>甲苯磺酰基磁珠＝环氧基磁珠。

实验三：四种磁珠配制试剂盒，临床样本测试情况。

实验材料：BNHS，DMSO，丙三醇，0.02M PBS(pH值为7.4)缓冲液，1mol/LTris缓冲液，TG抗原，EDC，0.1M硼酸缓冲液，3mol/L硫酸铵溶液，3mol/L 磷酸钾水溶液，100mmol/L甘氨酸溶液pH值为11.3和200mmol/L甘氨酸溶液 pH2.8，含0.5％BSA的Tris-Hcl缓冲液，15mmol/LMES缓冲液pH6.0,超纯水，含有1％BSA的缓冲液Buffer，ALP标记鼠抗人IgG抗体，裸磁珠，Anti-TG校准品cal-1,cal-6(Cal-1到Cal-6的浓度为0，1，5，20，40，80IU/mL)，样本S1-S40，底物液，清洗液，沃文特生物全自动化学发光免疫分析仪LA2000。

反应模式参照实验一。实验结果如下表4。

表4

实验结论：实验结果表明，四种磁珠检测临床样本，链霉亲和素磁珠检测临床样本测试越靠后，测得的浓度呈现偏低的趋势，环氧基磁珠及羧基磁珠均测试出异常样本且测值偏高，因为使用的是相同的抗原抗体，说明测值偏高是磁珠的非特异性吸附带来的，只有甲苯磺酰基磁珠测值与罗氏测值最接近且无异常样本，说明甲苯磺酰基磁珠的非特异性吸收最少。

实验四：甲苯磺酰基磁珠热加速实验，观察试剂盒的稳定性。

实验方法：将制备好的甲苯磺酰基磁珠等体积分成两份装入试剂盒，一份于 2-8℃保存，一份于恒温培养箱中37℃保存。将两种磁珠与酶工作液配合测定 Anti-TG校准品。分别于第三天和第六天观察校准品的发光信号，计算信号保留率，验证试剂盒的稳定性。

实验结果如表5。

表5

实验结论：甲苯磺酰基磁珠经过37℃热处理3天和6天信号保留率仍然较高，说明试剂稳定性较好。

综上四个实验可以得出：表明Anti-TG测定试剂盒在使用甲苯磺酰基磁珠时，精密度和临床样本测试较其他几种常用的磁珠有明显的提高，其临床符合率更高，准确性更高，在市场上更具有优势。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。