一种用于同时提高前胡提取物祛痰和平喘作用的制备方法
阅读说明：本技术 一种用于同时提高前胡提取物祛痰和平喘作用的制备方法 (A method for simultaneously improving expectorant and antiasthmatic effects of radix Peucedani extract ) 是由 刘景萍 刘全国 陈克领 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于同时提高前胡提取物祛痰和平喘作用的制备方法,包括以下步骤：取前胡中药材破碎,磨粉,过筛,得前胡粉,置于乙醇溶液中发酵,得到发酵混合物；将发酵混合物置于微波提取,过滤,得到微波提取液和滤渣,将微波提取液浓缩,得微波提取浓缩液；将滤渣置于乙醇溶液加热提取滤过,滤液合并,减压回收乙醇,浓缩,得回流提取浓缩液；将上述浓缩液混合,加入到大孔树脂中,采用乙醇溶液梯度洗脱；将最后收集的洗脱液减压浓缩,减压干燥,得到目标前胡提取物。采用本发明制备方法得到前胡提取物,提高白花前胡甲素、乙素和香豆素转移率,明显提高前胡提取物祛痰和平喘作用。(The invention provides a preparation method for simultaneously improving expectorant and antiasthmatic effects of radix peucedani extract, which comprises the following steps: crushing radix Peucedani, grinding into powder, sieving to obtain radix Peucedani powder, and fermenting in ethanol solution to obtain fermented mixture; placing the fermented mixture in microwave extraction, filtering to obtain microwave extract and filter residue, and concentrating the microwave extract to obtain microwave extract concentrated solution; extracting the residue with ethanol under heating, filtering, mixing filtrates, recovering ethanol under reduced pressure, and concentrating to obtain concentrated solution; mixing the above concentrated solutions, adding into macroporous resin, and gradient eluting with ethanol solution; and concentrating the finally collected eluent under reduced pressure, and drying under reduced pressure to obtain the target peucedanum praeruptorum extract. The peucedanum praeruptorum dunn extract obtained by the preparation method of the invention improves the transfer rate of praeruptorin A, B and coumarin, and obviously improves the effects of eliminating phlegm and relieving asthma of the peucedanum praeruptorum dunn extract.)
技术领域
本发明涉及天然药物领域，特别涉及一种用于同时提高前胡提取物祛痰和平喘作用的制备方法。
背景技术
前胡为伞形科植物白花前胡Peucedanum praeruptorum Dunn的干燥根，具有宣散风热、降气祛痰的功效，主含挥发油及白花前胡素甲、乙、丙、丁、戊等多种香豆素，另含微量紫花前胡苷。前胡水、醇提取液均能增加小鼠呼吸道分泌，解除多种药物引起的豚鼠支气管平滑肌和家兔小肠平滑肌的痉挛，能明显增加小鼠呼吸道酚红排出量，具有祛痰效果，对组胺性哮喘有平喘作用。现有方法未能对有效成分充分提取，不利于充分发挥前胡药材提取物的功效。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种用于同时提高前胡提取物祛痰和平喘作用的制备方法，显著提高有效成分提取，尤其提高白花前胡甲素、乙素和香豆素转移率，明显提高前胡提取物祛痰和平喘作用。
本发明的技术方案是这样实现的：一种用于同时提高前胡提取物祛痰和平喘作用的制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理：取前胡中药材破碎，磨粉，过筛，得前胡粉，置于质量浓度为60-70％乙醇溶液中，在35-40℃温度下发酵80-100min，得到发酵混合物；
(2)一次提取：将步骤(1)发酵混合物置于微波提取，过滤，得到微波提取液和滤渣，将微波提取液浓缩，得微波提取浓缩液；
(3)二次提取：将步骤(2)的滤渣置于质量浓度为60-70％乙醇溶液加热提取2-3次，每次回流0.8-1.2h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，浓缩，得回流提取浓缩液；
(4)梯度洗脱：将步骤(2)和(3)的浓缩液混合，加入到大孔树脂中，先使用40-50wt％乙醇溶液洗脱，再用80-90wt％乙醇溶液洗脱，最后收集60-70wt％乙醇溶液洗脱液；
(5)将最后收集的洗脱液减压浓缩，减压干燥，得到目标前胡提取物。
优选地，步骤(2)，所述微波提取工艺：先于300-400W功率条件下提取40-50min，再于550-650W功率条件下提取20-30min。
优选地，步骤(1)，所述前胡粉和乙醇溶液的质量体积比kg/L为1：2-3。
优选地，步骤(2)，所述微波提取浓缩液的固含量为50～60％。
优选地，步骤(3)，每次加热提取乙醇溶液使用量为滤渣重量的4-6倍。更优选地，所述加热提取的次数为3次，第1次乙醇溶液使用量为滤渣重量的6倍，第2次乙醇溶液使用量为滤渣重量的5倍，第3次乙醇溶液使用量为滤渣重量的4倍。
优选地，步骤(3)，所述回流提取浓缩液的固含量为50～60％。
优选地，步骤(4)，所述梯度洗脱的洗脱液流速为8-10mL/min。
优选地，步骤(4)，所述大孔树脂用量为前胡粉重量的0.8-1.2倍。
优选地，步骤(5)，所述减压浓缩至相对密度为1.25-1.30的清膏，浓缩温度为60℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明制备方法采用一定条件预发酵，特定程序微波提取联合回流提取，最后采用一定程序进行梯度洗脱，得到前胡提取物，显著提高有效成分提取，尤其提高白花前胡甲素、乙素和香豆素转移率，明显提高前胡提取物祛痰和平喘作用。
其中，本发明采用特定条件进行预发酵，利于后续活性成分的提取，提高提取物祛痰和平喘作用；采用本发明优选功率程序进行提取，对前胡活性成分进行充分提取，前胡甲素转移率、前胡乙素转移率和总香豆素转移率明显提高，其提取物祛痰和平喘作用明显提高；本发明优选乙醇浓度，较好地对滤渣中前胡活性成分有效提取，前胡甲素转移率、前胡乙素转移率和总香豆素转移率明显提高，其提取物祛痰和平喘作用明显下降；采用本发明优选洗脱程序，提高洗脱效果，其提取物祛痰和平喘作用明显提高。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
前胡提取物的制备方法，具体步骤为：
(1)预处理：取前胡中药材破碎，磨粉，过100目筛，得前胡粉，置于质量浓度为65％乙醇溶液中，前胡粉和乙醇溶液的质量体积比kg/L为1：2.5，在38℃温度下发酵90min，得到发酵混合物；
(2)一次提取：将步骤(1)发酵混合物置于微波提取，先于350W功率条件下提取45min，再于600W功率条件下提取25min，过滤，得到微波提取液和滤渣，将微波提取液浓缩至固含量为55％，得微波提取浓缩液；
(3)二次提取：将步骤(2)的滤渣置于质量浓度为65％乙醇溶液加热提取3次，第1次乙醇溶液使用量为滤渣重量的4倍，第2次乙醇溶液使用量为滤渣重量的5倍，第3次乙醇溶液使用量为滤渣重量的6倍，每次回流1h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，浓缩至固含量为55％，得回流提取浓缩液；
(4)梯度洗脱：将步骤(2)和(3)的浓缩液混合，加入到大孔树脂中，大孔树脂用量为前胡粉重量的1倍，先使用10个柱体积的45wt％乙醇溶液洗脱，再用10个柱体积的85wt％乙醇溶液洗脱，最后收集65wt％乙醇溶液洗脱液，洗脱液流速为9mL/min；
(5)将最后收集的洗脱液减压浓缩成相对密度为1.25(60℃)的清膏，减压干燥，得到目标前胡提取物。
实施例2
前胡提取物的制备方法，具体步骤为：
(1)预处理：取前胡中药材破碎，磨粉，过100目筛，得前胡粉，置于质量浓度为60％乙醇溶液中，前胡粉和乙醇溶液的质量体积比kg/L为1：3，在35℃温度下发酵100min，得到发酵混合物；
(2)一次提取：将步骤(1)发酵混合物置于微波提取，先于300W功率条件下提取50min，再于550W功率条件下提取30min，过滤，得到微波提取液和滤渣，将微波提取液浓缩至固含量为50％，得微波提取浓缩液；
(3)二次提取：将步骤(2)的滤渣置于质量浓度为60％乙醇溶液加热提取3次，第1次乙醇溶液使用量为滤渣重量的4倍，第2次乙醇溶液使用量为滤渣重量的5倍，第3次乙醇溶液使用量为滤渣重量的6倍，每次回流0.8h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，浓缩至固含量为50％，得回流提取浓缩液；
(4)梯度洗脱：将步骤(2)和(3)的浓缩液混合，加入到大孔树脂中，大孔树脂用量为前胡粉重量的0.8倍，先使用10个柱体积的40wt％乙醇溶液洗脱，再用10个柱体积的80wt％乙醇溶液洗脱，洗脱液流速为8mL/min，最后收集60wt％乙醇溶液洗脱液，洗脱液流速为8mL/min；
(5)将最后收集的洗脱液减压浓缩成相对密度为1.25(60℃)的清膏，减压干燥，得到目标前胡提取物。
实施例3
前胡提取物的制备方法，具体步骤为：
(1)预处理：取前胡中药材破碎，磨粉，过100目筛，得前胡粉，置于质量浓度为70％乙醇溶液中，前胡粉和乙醇溶液的质量体积比kg/L为1：2，在40℃温度下发酵80min，得到发酵混合物；
(2)一次提取：将步骤(1)发酵混合物置于微波提取，先于400W功率条件下提取40min，再于650W功率条件下提取20min，过滤，得到微波提取液和滤渣，将微波提取液浓缩至固含量为60％，得微波提取浓缩液；
(3)二次提取：将步骤(2)的滤渣置于质量浓度为70％乙醇溶液加热提取3次，第1次乙醇溶液使用量为滤渣重量的4倍，第2次乙醇溶液使用量为滤渣重量的5倍，第3次乙醇溶液使用量为滤渣重量的6倍，每次回流1.2h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，浓缩至固含量为60％，得回流提取浓缩液；
(4)梯度洗脱：将步骤(2)和(3)的浓缩液混合，加入到大孔树脂中，大孔树脂用量为前胡粉重量的1.2倍，先使用10个柱体积的50wt％乙醇溶液洗脱，再用10个柱体积的90wt％乙醇溶液洗脱，最后收集70wt％乙醇溶液洗脱液，洗脱液流速为10mL/min；
(5)将最后收集的洗脱液减压浓缩成相对密度为1.30(60℃)的清膏，减压干燥，得到目标前胡提取物。
实施例4
前胡提取物的制备方法，具体步骤为：
(1)预处理：取前胡中药材破碎，磨粉，过100目筛，得前胡粉，置于质量浓度为60％乙醇溶液中，前胡粉和乙醇溶液的质量体积比kg/L为1：2，在35℃温度下发酵80min，得到发酵混合物；
(2)一次提取：将步骤(1)发酵混合物置于微波提取，先于320W功率条件下提取40min，再于580W功率条件下提取20min，过滤，得到微波提取液和滤渣，将微波提取液浓缩至固含量为55％，得微波提取浓缩液；
(3)二次提取：将步骤(2)的滤渣置于质量浓度为70％乙醇溶液加热提取3次，第1次乙醇溶液使用量为滤渣重量的4倍，第2次乙醇溶液使用量为滤渣重量的5倍，第3次乙醇溶液使用量为滤渣重量的6倍，每次回流1h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，浓缩至固含量为55％，得回流提取浓缩液；
(4)梯度洗脱：将步骤(2)和(3)的浓缩液混合，加入到大孔树脂中，大孔树脂用量为前胡粉重量的1倍，先使用10个柱体积的50wt％乙醇溶液洗脱，再用10个柱体积的80wt％乙醇溶液洗脱，最后收集65wt％乙醇溶液洗脱液，洗脱液流速为10mL/min；
(5)将最后收集的洗脱液减压浓缩成相对密度为1.25(60℃)的清膏，减压干燥，得到目标前胡提取物。
对比例1
与实施例1主要区别在于步骤(1)中，置于质量浓度为50％乙醇溶液发酵120min。具体地，预处理：取前胡中药材破碎，磨粉，过100目筛，得前胡粉，置于质量浓度为50％乙醇溶液中，前胡粉和乙醇溶液的质量体积比kg/L为1：2.5，在38℃温度下发酵120min，得到发酵混合物。
对比例2
与实施例1主要区别在于步骤(2)中，直接于500W功率条件下提取60min。具体地，一次提取：将步骤(1)发酵混合物置于微波提取60min，设置微波功率为500W，过滤，得到微波提取液和滤渣，将微波提取液浓缩至固含量为55％，得微波提取浓缩液。
对比例3
与实施例1主要区别在于步骤(3)中，调整提取溶剂乙醇溶液浓度及其用量。具体地，二次提取：将步骤(2)的滤渣置于质量浓度为80％乙醇溶液加热提取3次，每次加热提取乙醇溶液使用量为滤渣重量的5倍，每次回流1h，滤过，滤液合并，减压回收乙醇，浓缩至固含量为55％，得回流提取浓缩液。
对比例4
与实施例1主要区别在于步骤(4)中，调整洗脱程序。具体梯度洗脱步骤为：将步骤(2)和(3)的浓缩液混合，加入到大孔树脂中，大孔树脂用量为前胡粉重量的1倍，先使用10个柱体积的55v/v％乙醇溶液洗脱，最后收集75v/v％乙醇溶液洗脱液，洗脱液流速为9mL/min。
一、有效成分检测
将实施例1-4以及对比例1-4制得的前胡提取物(均采用同一批次前胡中药材制备)检测有效成分白花前胡甲素、白花前胡乙素、总香豆素含量。依据《中国药典》采用HPLC法检测白花前胡甲素、白花前胡乙素含量，采用Dikma Diamonsil-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，检测波长为321nm；采用分光光度法于348nm处测定总香豆素含量。并计算有效成分转移率，转移率＝提取物中有效成分含量(mg)/原药材中有效成分含量(mg)×100％。
结果如下：
上述结果表明，与对比例1-4比较，实施例1-4前胡甲素转移率、前胡乙素和总香豆素转移率均明显提高。
对比例1降低发酵乙醇溶液浓度，延长发酵时间，其发酵效果有所下降，不利于后续活性成分的提取；对比例2没有采用本发明优选功率程序进行提取，微波提取效果明显下降，未能对前胡活性成分充分提取，前胡甲素转移率、前胡乙素转移率明显下降，而且香豆素转移率也下降；对比例3没有采用本发明优选乙醇浓度，回流提取效果下降，不能较好地对滤渣中前胡活性成分有效提取，前胡甲素转移率、前胡乙素转移率下降明显，且香豆素转移率也下降明显；对比例4没有采用本发明优选洗脱程序，洗脱效果下降。
二、小鼠试验
(1)祛痰效果试验
采用小鼠酚红法以气管酚红排泌量为指标评价前胡提取物祛痰作用。
选用经筛选合格的ICR小鼠90只，体重18-22g，随机分为9组，每组10只，雌雄各半。每只每天按照4.50g/kg给药，连续灌胃5d，末次给药后30min，腹腔注射5％酚红溶液0.1mL/10g，30min后立即处死动物，剥离气管，放入2mL生理盐水的试管中，再加1mmol的NaOH0.1mL，震荡混匀弃去气管。用721型分光光度计，波长546nm测OD值。用酚红作标准曲线，计算酚红含量(μg/mL)，与空白对照组(给予同量去离子水)比较，进行统计学处理。结果如下：
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
结果显示，与空白对照组对比，实施例1-4前胡提取物祛痰作用明显提高。
(2)平喘效果试验
选用经筛选合格的豚鼠90只，体重180-200g，随机分为9组，每组10只，雌雄各半。每只每天按照4.50g/kg口服给药，每天1次，连续3天，对照组给予同量去离子水。于末次给药后40分钟，将每只动物分别置于喷雾装置内，浓度为0.2％的磷酸组胺溶液用诱咳引喘仪匀速喷入18秒，记录豚鼠引喘潜伏期。将各组所得平均值与对照组平均值比较，进行统计学检验。
结果如下：
与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
结果显示，与空白对照组对比，实施例1-4前胡提取物显著地延长豚鼠引喘潜伏期。
综上，对比例1降低发酵乙醇溶液浓度，延长发酵时间，其发酵效果有所下降，不利于后续活性成分的提取，其提取物祛痰和平喘作用均有所下降；对比例2没有采用本发明优选功率程序进行提取，微波提取效果明显下降，未能对前胡活性成分充分提取，其提取物祛痰和平喘作用均明显下降；对比例3没有采用本发明优选乙醇浓度，回流提取效果下降，不能较好地对滤渣中前胡活性成分有效提取，其提取物祛痰和平喘作用均明显下降；对比例4没有采用本发明优选洗脱程序，洗脱效果下降，其提取物祛痰和平喘作用均明显下降。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。