一种细菌和植物来源的融合囊泡、制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种细菌和植物来源的融合囊泡、制备方法及其应用 (Fusion vesicle derived from bacteria and plants, preparation method and application thereof ) 是由 谢海燕 庄婉茹 王云锋 黄利利 聂伟东 于 2021-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种细菌和植物来源的融合囊泡、制备方法及其应用,涉及生物医学技术领域。所述融合囊泡包含由细菌外膜囊泡和植物类囊体膜融合而成的混合膜结构,其中,所述细菌为革兰氏阴性细菌,所述植物类囊体为菠菜的类囊体。本发明的融合囊泡结合了细菌外膜囊泡和植物类囊体膜的特性,囊泡结构均一,可高效、迅速地到达肿瘤,肿瘤靶向性高且蓄积时间较长；在肿瘤的治疗方面具有显著的效果。(The invention provides a fusion vesicle derived from bacteria and plants, a preparation method and application thereof, and relates to the technical field of biomedicine. The fusion vesicle comprises a mixed membrane structure formed by fusing a bacterial outer membrane vesicle and a plant thylakoid membrane, wherein the bacteria are gram-negative bacteria, and the plant thylakoid is a thylakoid of spinach. The fusion vesicle combines the characteristics of the bacterial outer membrane vesicle and the plant thylakoid membrane, has uniform vesicle structure, can efficiently and quickly reach the tumor, has high tumor targeting property and long accumulation time; has obvious effect on the treatment of tumors.)
技术领域
本发明涉及生物医学
技术领域
，尤其是涉及一种细菌和植物来源的融合囊泡、制备方法及其应用。背景技术
肿瘤作为一类威胁人类健康的重大疾病，受到人们的广泛关注。随着对肿瘤微环境及肿瘤发生、发展、耐药和转移等过程的深入了解，临床上已经有多种抗肿瘤药物用于对肿瘤的诊断和化疗治疗中，但是由于肿瘤靶向性不佳，肿瘤内蓄积能力较差，严重损伤正常细胞和组织，毒副作用强，同时小分子药物代谢较快，容易被肝肾清除，血药浓度低，抗肿瘤效果不尽如人意。因此，如何高效地将抗肿瘤药物递靶向递送到肿瘤，提高药物在肿瘤部位的富集，降低其在正常组织中的浓度，成为制药领域研究的热点。
近年来，以生物膜为基础的仿生递送体系在肿瘤治疗领域备受瞩目。其特点有：(1)生物膜结构具有极佳的相容性；(2)生物膜的表面蛋白具有天然的生物学活性和广阔的应用空间，是信息交换、信号通路传达的重要媒介；(3)作为新一代的载药平台，生物膜结构和内核成分均可实现小分子、核酸、多肽甚至蛋白类药物的包载。因此结合生物膜的独特优势，其在肿瘤治疗方面有着很强的应用前景。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细菌和植物来源的融合囊泡、制备方法及其应用。本发明的融合囊泡结合了细菌外膜囊泡和植物类囊体膜的特性，融合囊泡结构均一，可高效、迅速地到达肿瘤，肿瘤靶向性高且蓄积时间较长；在肿瘤的治疗方面具有显著的效果。
在第一方面，本发明提供了一种细菌和植物来源的融合囊泡，所述融合囊泡包含细菌外膜囊泡和植物类囊体膜的混合膜结构，其中，所述细菌为革兰氏阴性细菌，所述植物类囊体为菠菜的类囊体。细菌外膜囊泡含有细菌来源的病原相关分子模式PAMPs，可以通过toll样受体等通路刺激BMDC细胞，可以充当肿瘤治疗的疫苗佐剂成分。植物类囊体可以利用肿瘤微环境的双氧水和水，自发产氧，最终通过ROS的产生杀死肿瘤。本发明的融合囊泡结合了二者的特性，由细菌外膜囊泡(OMV)与植物类囊体膜(NTs)融合而成；OMV提供肿瘤靶向性并激活肿瘤微环境免疫，NTs作为光敏剂对肿瘤进行光动力杀伤；本发明融合囊泡能够依靠细菌外膜囊泡的肿瘤靶向性快速富集于肿瘤区域，参与肿瘤治疗。
本发明中，所述融合囊泡结构均一，粒径为200nm～250nm。所述融合囊泡具有衍生所述融合囊泡的细菌外膜囊泡和植物类囊体膜的生理特性。用SDS-PAGE方法分析融合囊泡上的蛋白分别来源于细菌外膜囊泡和植物类囊体。融合囊泡的生理特性具有改善的靶向效率，改善的递送能力。
在第二方面，本发明提供了所述融合囊泡的制备方法，以细菌外膜囊泡与植物类囊体膜为原料，制备得到所述融合囊泡；
进一步地，所述细菌外膜囊泡与所述植物类囊体膜的质量比为1:0.2，1:0.4，1:0.8，1:1，1:2或1:4；优选地，所述质量比为1:0.8为最佳融合比率。
进一步地，先将植物类囊体膜通过聚碳酸酯多孔膜挤出，再将所述细菌外膜囊泡和所述植物类囊体膜一起通过聚碳酸酯多孔膜挤出获得所述融合囊泡；优选地，通过脂质体挤出器进行所述挤出。
在一个具体的实施方案中，在所述融合囊泡的制备过程中，以细菌外膜囊泡OMV和菠菜来源的类囊体的原料，通过手动脂质体挤出器，在200nm的聚碳酸酯多孔膜至少反复挤出21次获得。
在一个具体的实施方案中，所述挤出过程在缓冲液中进行；优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液。
在一个具体的实施方案中，以缓冲液配制所述植物类囊体膜的溶液后，将类囊体膜碎片依次通过800nm、400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，反复挤出至少21次；然后再将所述细菌外膜囊泡和所述植物类囊体膜的混合溶液通过200nm的聚碳酸酯多孔膜进行挤出获得所述融合囊泡。
在一个具体的实施方案中，还包括提取细菌外膜囊泡OMV和提取植物类囊体膜的方法。
在一个具体的实施方案中，细菌外膜囊泡OMV的提取包括以下步骤：
1)用LB培养基扩增MG1655大肠杆菌，当活化菌液OD600＝1时，以角转子10000g或者水平转头8000g，4℃条件，离心10min，去细菌沉淀收集上清；
2)用0.45μm的真空抽滤瓶过滤上清液；
3)用100kd超滤管以水平转头3000g条件，离心10min收集超滤管内的浓缩液；
4)浓缩液再次用0.45μm微孔滤膜过滤，在4℃、150000g条件下超速离心3h；
5)弃上清，用PBS重悬沉淀，分装于-80℃冷冻保存。
在一个具体的实施方案中，植物类囊体膜采用低渗提取法提取，包括以下步骤：
1)新鲜菠菜洗净取菜叶，4℃避光过夜；
2)加入匀浆缓冲液BBY-1(pH 7.8)榨汁，10层纱布过滤残渣，10000rpm离心10min收集沉淀；
3)以叶绿体溶胀液BBY-2(pH 8.0)重悬，4℃溶胀2h，10000rpm离心10min，去上清；
4)用BBY-2清洗沉淀，沉淀最终以类囊体膜保存液BBY-3悬浮，分装后-20℃避光保存。
在上述实施方案中，缓冲液的组分如下：
a)BBY-1：pH＝7.8；
物质
质量(1L)
0.4M蔗糖
136.92g
20mM Tricine
3.584g
2mM MgCl<sub>2</sub>
0.19042g
40mM NaCl
2.3376g
2mM Vc
0.35224g
0.2％BSA
2g
b)BBY-2：10mM HEPES pH＝8.0；
c)BBY-3：
物质
质量(1L)
0.4M蔗糖
136.92g
20mM MES
4.264g
15mM NaCl
0.8766g
5mM MgCl<sub>2</sub>
0.47665g
在一个具体的实施方案中，还包括将所述细菌外膜囊泡与植物类囊体膜融合制备融合囊泡的方法。
细菌外膜囊泡与植物类囊体膜的融合囊泡的制备，包括以下步骤：
1)类囊体膜母液用PBS清洗，10000rpm离心10min，沉淀用PBS重悬；
2)重悬后的类囊体膜在4℃、300W的条件下，超声15min；
3)将类囊体膜溶液依次使用手动脂质体挤出器，依次通过800nm、400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，每种膜对应至少21次挤出；
4)将细菌外膜囊泡与植物类囊体膜在不同的质量比条件下，通过200nm的聚碳酸酯多孔膜在PBS缓冲液中挤出，反复挤出至少21次；
5)挤出的融合母液，以10000rpm、4℃离心10min去掉未融合的沉淀，收集上清。
在本发明中，所述细菌外膜囊泡和植物类囊体可以以不同的质量比融合，通过调节两种成分的质量比，可以实现两种组分的最佳融合，最佳融合情况下，融合囊泡的粒径平均值为226.03nm。在一个实施方案中，当细菌外膜囊泡和植物类囊体的质量比为1:0.8时，其融合效率最高，流式细胞术检测其融合效率为81.8％。
在本发明中，细菌外膜囊泡OMV由BCA蛋白定量法进行定量；植物类囊体膜由紫外荧光吸收计算叶绿素浓度进行定量。
叶绿素定量公式：
叶绿素A(μg/mL)＝13.95*OD665-6.88*OD649；
叶绿素B(μg/mL)＝24.96*OD649-7.32*OD665；
总叶绿素＝叶绿素A+叶绿素B。
所获得的融合囊泡紫外吸收谱图在260-280nm出现细菌外膜囊泡(OMV)的特征吸收峰，在420-450nm和660-700nm出现类囊体的特征吸收峰；用LPS抗体标记OMV的FITC通道和类囊体自身的TRITC通道，在激光共聚焦显微镜观察下呈现颗粒共定位；用SDS-PAGE方法分析融合囊泡上的蛋白分别来源于细菌外膜囊泡和植物类囊体。
在第三方面，本发明提供了所述融合囊泡在制备巨噬细胞免疫调节剂中的应用；优选地，所述巨噬细胞为肿瘤相关巨噬细胞。所述肿瘤相关巨噬细胞为肿瘤驻留巨噬细胞。在一个具体的实施方案中，所述巨噬细胞为RAW264.7细胞。
在一个实施方案中，所述巨噬细胞免疫调节剂具有以下功能中的至少一种：(a)上调M1型巨噬细胞的共刺激分子表型；(b)下调M2型巨噬细胞的共刺激分子表型；和/或(c)调节肿瘤组织免疫抑制微环境。
因此，所述融合囊泡可作为巨噬细胞极化调节剂，调控巨噬细胞的功能表型转换，促进巨噬细胞由M2表型转换为M1表型。所述融合囊泡可以逆极化肿瘤相关的巨噬细胞，上调M1型巨噬细胞分泌的细胞因子，改变肿瘤微环境中M1/M2型巨噬细胞的比例，从而改善肿瘤微环境，杀伤肿瘤。
在一个具体的实施方案中，通过将融合囊泡和RAW264.7共孵育，融合囊泡可以明显上调M1型的共刺激分子CD86，并明显下调M2型的共刺激分子CD206，说明融合囊泡有逆转肿瘤抑制性微环境的潜力。
在第四方面，本发明提供了所述融合囊泡制备促进DC细胞共刺激分子表达的产品中的应用。
在具体的应用中，所述促进DC细胞共刺激分子表达包括上调DC细胞中CD80、CD86、MHC II类三种共刺激分子中的一种或多种；优选地，所述DC细胞为骨髓来源树突状细胞(BMDC)。
本发明利用Transwell构建模拟模型，融合囊泡孵育的Transwell模型，通过光照后对小室的BMDC三种共刺激分子CD80、CD86、MHCII的流式分析，本发明融合囊泡孵育明显上调BMDC细胞CD80、CD86、MHCII三种共刺激分子，说明了融合囊泡可以将光动力治疗和免疫治疗协同起来，更好的有利于抗原的呈递。本发明所述融合囊泡能作为免疫佐剂辅助抗原提呈细胞对肿瘤抗原的提呈。本发明所述融合囊泡可用于制备光动力杀伤癌细胞的药物。
在第五方面，本发明提供了所述融合囊泡在制备用于预防、治疗肿瘤的药物或在制备肿瘤细胞抑制剂中的应用。
在一个实施方案中，所述肿瘤包括肝癌、胃癌肺癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌或宫颈癌；优选地，所述肿瘤为结肠癌或乳腺癌；更优选CT26结肠癌。
在一个具体的实施方案中，所述肿瘤细胞为CT26肿瘤细胞或4T1癌细胞。
在第六方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含前述的融合囊泡。
有益效果：
(1)本发明提供的融合囊泡良好长循环特性、肿瘤靶向性，且不良反应弱，同时在660nm激光照射下能产生单线态氧杀伤肿瘤，凋亡坏死的肿瘤细胞释放的抗原可进一步激活免疫反应杀伤肿瘤。
(2)本发明融合囊泡不仅能作为免疫佐剂辅助抗原提呈细胞对肿瘤抗原的提呈，还能极化肿瘤部位的巨噬细胞为具有抗肿瘤作用的M1巨噬细胞，提升免疫效果。
(3)本发明融合囊泡有逆转肿瘤抑制性微环境的潜力，可以将光动力治疗和免疫治疗协同起来，更好的有利于抗原的呈递；本发明提供的融合囊泡在免疫、光动力、药物递送中有着重要应用前景。
(4)本发明融合囊泡能够快速富集于肿瘤区域，最终通过光动力治疗和免疫疗法协同治疗肿瘤，为临床肿瘤及其他重大疾病的治疗提供新思路和新策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明细菌外膜囊泡OMV(A)、类囊体囊泡NTs(B)及其融合囊泡BPN(C)的粒径分布图；
图2为本发明细菌外膜囊泡OMV(A)、类囊体囊泡NTs(B)及融合囊泡BPN(C)的透射电镜图(scar bar：100nm)；
图3为本发明中细菌外膜囊泡OMV、类囊体囊泡NTs及融合囊泡BPN的紫外吸收光谱；
图4为本发明中细菌外膜囊泡OMV、类囊体囊泡NTs及融合囊泡BPN的SDS-PAGE蛋白电泳图；
图5为本发明中细菌外膜囊泡OMV与类囊体囊泡挤压融合后(BPN，上图)和仅物理混合(Mix，下图)的激光共聚焦荧光图；
图6为本发明中不同浓度的OMV、NTs和BPN对RAW264.7巨噬细胞的极化效果，即M1型CD86的占比；
图7为本发明中不同浓度的OMV、NTs和BPN对RAW264.7巨噬细胞的极化效果，即M2型CD206的占比；
图8为本发明中不同组分经不同处理下对BMDC细胞的刺激效果；A为BMDC细胞表面CD80分子的平均荧光强度和阳性率；B为BMDC细胞表面CD86分子的平均荧光强度和阳性率；C为BMDC细胞表面MHC II类分子的平均荧光强度和阳性率；
图9为本发明中BPN的小鼠全身组织分布图；OMV、NTs和BPN分别给药后3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h后进行小动物活体荧光成像；OMV和NTs的激发光波长分别为：OMV所染DIR荧光染料激发波长为750nm，NTs的激发波长为675nm；
图10为本发明中BPN的小鼠全身组织分布图；分别在675nm(A)和750nm(B)的不同激光通道下检测的组织荧光强度，OMV和NTs的激发光波长分别为：OMV所染DIR荧光染料激发波长为750nm，NTs的激发波长为675nm；
图11为CT26结肠癌的抑瘤实验示意图，组别分别为PBS、OMV、NTs、NTs+laser，Mix，Mix+laser，BPN，BPN+laser，给药剂量分别为OMV＝20μg/只，NTs＝16μg/只，Mix＝20μg OMV+16μg NTs物理混合组，BPN＝20μg OMV：16μg NTs融合组；
图12为CT26结肠癌在不同给药治疗下，肿瘤的生长曲线；
图13为CT26结肠癌的不同给药治疗下，肿瘤的最终解剖对比图；
图14为4T1乳腺癌在不同给药治疗下，肿瘤的生长曲线；
图15为4T1肺转移的荧光定量。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，如无特别说明，所述方法均为常规方法，所述原材料均能从公开商业途径获得。
实施例1：细菌外膜囊泡OMVs的提取
MG1655大肠杆菌于1.5L的LB培养基中，在37℃、220rpm的条件下培养，当OD600＝1时停止摇菌，菌液以10000g、4℃离心10min，去沉淀取上清；然后用0.45μm真空抽滤瓶过滤上清液；上清用100kd超滤管3000g离心10min收集浓缩液；浓缩液用0.45μm的微孔滤膜过滤后在4℃、150000g条件下超速离心3h；弃上清，用400μL PBS重悬沉淀后-80℃冷冻保存；BCA定量的所提取的OMV浓度为3.48mg/mL。
实施例2：植物类囊体膜的提取
将300mL BBY-1与约100g洗净过夜的菠菜叶用榨汁机榨汁匀浆，所得匀浆用10层棉纱布过滤去残渣；滤液在10000rpm条件下离心10min，弃上清；沉淀悬浮于400mL BBY-2溶胀液中，4℃避光溶胀2h；后在10000rpm条件下离心10min，弃上清，用HEPES清洗两次(每次50mL BBY-2重悬沉淀，然后10000rpm离心10min，弃上清)；类囊体膜沉淀用保存液BBY-3悬浮匀浆，-20℃保存。依据上述公式，通过紫外分光光度法所测量的叶绿素含量0.77mg/ml。
实施例3：融合囊泡BPN的制备
取类囊体膜母液2mL用20mL PBS清洗，10000rpm离心10min，沉淀用5mL PBS重悬；重悬后的类囊体膜在4℃、300W的条件下，超声15min；将类囊体膜溶液依次使用手动脂质体挤出器，依次通过800nm、400nm、200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，每种膜对应至少21次挤出，用石英比色皿对类囊体中的叶绿素含量进行定量浓度为102μg/mL；取细菌外膜囊泡母液50μg与类囊体膜40μg，用PBS定容至1mL，混合溶液通过200nm的聚碳酸酯多孔膜挤出，反复挤出至少21次；挤出的融合母液，以10000rpm、4℃离心10min去掉未融合的沉淀，收集上清；对最终获得的融合囊泡再次进行叶绿素的定量。
实施例4
分别对实施例1中提取的OMV、实施例2、3中挤膜所得类囊体囊泡NTs和融合囊泡BPN进行表征，实验结果如下：
1、粒径
用马尔文粒度仪对上述三种颗粒的粒径分布进行测量，结果如图1所示，其中细菌外膜囊泡OMV的粒径为88.03nm，上述类囊体经过200nm聚碳酸酯多孔膜挤出后粒径为205.89nm，融合囊泡的最佳融合比例1:0.8的粒径为226.03nm。
2、电镜
取上述三种膜泡溶液各3-5μL，滴在无定形碳膜铜网载体，1min后，干燥铜网，再滴上2％的醋酸双氧铀染料4μL，静置1min，快去干燥，最终铜网通过FEI Tecnai Spirit透射电子显微镜进行观察，结果如图2所示。
3、紫外分光光度法
用紫外分光光度计测定上述三种颗粒的紫外吸收光谱，如图3所示，融合囊泡BPN的紫外吸收谱图在260-280nm出现细菌外膜囊泡的特征吸收峰，在420-450nm和660-700nm出现类囊体的特征吸收峰。
4、SDS-PAGE蛋白表征
首先通过BCA法对上述三种颗粒进行蛋白定量，确定最终上样量为5μg需要的上样体积；配置20mL 12％的分离胶(6.6mL H2O,8.0mL 30％Acrylamide,5.0mL 1.5M Tris-HCl(pH 8.80),0.2mL 10％SDS,0.2mL 10％过硫酸铵，0.008mL TEMED)，迅速混匀后加入模具中，等30s加水液封，等30min凝固；配置4mL浓缩胶(2.7mL H2O，0.67mL 30％Acrylamide，0.5mL 1.0M Tris(pH 6.8)，0.04mL 10％SDS，0.04mL 10％过硫酸铵，0.004mL TEMED)，弃去液封水，加入浓缩胶，立刻加入梳齿凝固30min；电泳槽加入500mL 1×电泳液，15min后拔掉梳齿。依次加入样品marker、OMV、NTs和BPN(蛋白含量均为5μg)；先80V、200mA电泳15min，再120V电泳至buffer跑至凝胶底部为止；取出凝胶，加入30mL考马斯亮蓝染液染色30min。结果如图4所示，OMV和NTs的特异性蛋白在融合组BPN上均有表现。
5、激光共聚焦成像
取OMV 50μg，加入PBS 164.3μL，过0.45μm滤头，滤液加入FITC标记的LPS抗体1μL，混合均匀后，37℃染色1.5h；使用300kd超滤管，5000g离心10min，去掉游离抗体，收集柱子底部的OMV溶液，并调整OMV溶液的蛋白浓度，使FITC-OMV溶液终浓度为250μg/mL；取100μLFITC标记的OMV溶液和106μL NTs溶液(188μg/mL)混合后使用手动脂质体挤出器通过200nm聚碳酸酯多孔膜挤出，反复挤21次作为融合BPN组；物理混合Mix组则取上述FITC-OMV溶液和挤膜后NTs溶液各30μL混合均匀即可。
激光共聚焦小皿，分别加入10μL样品，盖上小片凝胶(1.5％琼脂糖的PBS溶液，用于固定囊泡)，盖上盖玻片；选用FITC和Cy5两个激光通道成像，结果如图5所示：绿色为OMV上FITC抗体荧光，红色为类囊体的荧光，相比物理混合组的两个荧光通道表现为红绿相间，BPN组中两种荧光混合为金色，表明OMV和NTs成功融合。
综上所述，通过手动脂质体挤出器成功使细菌外膜囊泡OMV与植物类囊体NTs融合为融合囊泡BPN。
实施例5
对RAW264.7巨噬细胞的极化：
使用小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7，以CD86分子为M1型巨噬细胞的特征蛋白、CD206为M2型巨噬细胞的特征蛋白考察体系对巨噬细胞的极化效果。24孔板每孔1×105个RAW细胞，每孔加入100ng/mL的IL-4刺激48小时使巨噬细胞表型由M0极化为M2型；48小时后加入1mL样品和M2型RAW细胞共孵育，1μg的LPS最为阳性对照组，OMV加入浓度为0.001-10μg/mL，NTs的加入量为0.0008-8μg/mL，BPN对应加入0.001:0.0008-10:8μg/mL。
刺激24h后，弃上清，收集细胞，300g离心5min后去上清；细胞沉淀分别加入100μL0.2mg/mL CD86抗体，和100μL 0.2mg/mL CD206抗体溶液，4℃孵育30min；孵育结束后每管用PBS清洗三次，300g离心10min，最终细胞沉淀用200μL流式缓冲液重悬均匀，进行流式细胞术。
结果如图6至图7所示：IL-4成功将大部分RAW细胞极化为了M2型巨噬细胞，OMV、NTs和BPN均表现出和浓度依赖性的、将M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞的能力，其中BPN在0.01:0.008的浓度比例下(BCA蛋白定量定的OMV的浓度为0.01μg/mL，叶绿素紫外吸收定量的NTs量为0.008μg/mL)，即表现出很强的极化能力，NTs的极化能力相对低于OMV和BPN。
实施例6
体外以Transwell构建模拟模型，考察光动力释放抗原对骨髓来源BMDC细胞的刺激：提取骨髓来源的BMDC细胞，加入GM-CSF和IL-4持续刺激7天；
Transwell实验的具体步骤如下：
(1)铺板：上室接种CT26肿瘤细胞，每孔1×105细胞；下室接种BMDC细胞，每孔5×105细胞；
(2)加药：于上室中加入PBS、OMV、NTs和BPN(10:8μg/mL)药物，孵育过夜，因为小室有空隙，所以上室加入的颗粒也会接触DC细胞；
(3)激光：将上室培养基更换为无酚红培养基，660nm激光以0.5
mW/cm2功率照射10min；
(4)DC刺激：上室光动力释放的抗原持续刺激BMDC细胞，继续培养24h；
(5)检测：向各个组别分别加入CD86、CD80、MHC II三种抗体，4
℃孵育30min；
(6)流式细胞术测量荧光强度和阳性率。
结果如图8所示：经过激光光照后的BPN组对BMDC细胞的刺激显著优于其它组别，说明了光动力促进的抗原释放有促进DC细胞共刺激分子表达的作用。
实施例7
检测融合囊泡BPN的肿瘤靶向性：
用细胞膜深红色荧光染料DiR标记OMV，再在1:0.8的比例下，制备BPN，15只小鼠分3组，每组5只；OMV组小鼠每只尾静脉注射100μL 50μg/mL OMV溶液，NTs组小鼠每只尾静脉注射100μL 40μg/mL挤膜后NTs溶液，BPN组小鼠每只尾静脉注射100μL BPN溶液(50μg/mLOMV+40μg/mL NTs融合而成)。在注射后的3-96h进行小动物荧光成像，图9的实验结果显示，相较于NTs组别，融合组别在OMV的协助下，可以明显提高BPN对肿瘤的靶向性；
96h活体荧光成像后，处死小鼠，取出肿瘤及内脏；以小动物活体成像仪定量小鼠组织荧光强度。
结果如图10所示：图10中A图为675nm(DiR染料激发光)激光通道，代表OMV脏器分布，可以看出BPN和OMV有着相当的肿瘤靶向性；图10中B图为750nm(类囊体激发光)激光通道，相较于单独NTs给药的组别，融合组BPN别在OMV的协助下，对肿瘤的靶向性提高了4.03倍。
实施例8：CT26结肠癌抑瘤实验
实验方案如图11所示，在Day 0，对Babl/c雌鼠，皮下接种CT26肿瘤细胞，1×106cell/只；Day 8，当瘤子体积达到100mm3的时候，尾静脉注射药物，组别分别为PBS、OMV、NTs、NTs+laser，Mix，Mix+laser，BPN，BPN+laser，给药剂量分别为OMV＝20μg/只，NTs＝16μg/只，Mix＝20μg OMV+16μg NTs物理混合组，BPN＝20μg OMV：16μg NTs融合组。Day 11，当药物充分蓄积到肿瘤后，660nm激光，0.5mW/cm2功率照射小鼠肿瘤部位10min；Day8-29，测量小鼠瘤子体积，最后一天，解剖小鼠，取出肿瘤。结果如图12、13所示，结果显示BPN给药组经660nm激光照射后能显著抑制肿瘤的发展，在29天内的肿瘤体积均小于100mm3，瘤子解剖图可以看出BPN+laser组别不仅能明显抑制肿瘤生长，对某些个体的老鼠肿瘤可以起到消融肿瘤的作用。
实施例9：Luc-4T1乳腺癌抑瘤实验
与实验例8类似，进行Luc-4T1转移瘤的抑制实验。在Day 0，对Babl/c雌鼠，皮下接种Luc-4T1肿瘤细胞，1×106cell/只；Day 9，当瘤子体积达到100mm3的时候，尾静脉注射药物，组别分别为PBS、OMV、NTs、NTs+laser，Mix，Mix+laser，BPN，BPN+laser，给药剂量分别为OMV＝20μg/只，NTs＝16μg/只，Mix＝20μg OMV+16μg NTs物理混合组，BPN＝20μg OMV：16μgNTs融合组。Day 12，当药物充分蓄积到肿瘤后，660nm激光，0.5mW/cm2功率照射小鼠肿瘤部位10min；Day13，尾静脉注射Luc-4T1(3×105cell/只)肿瘤细胞，以构建更为恶劣的转移瘤模型；测量小鼠瘤子体积，最后一天，解剖小鼠肺部进行成像。结果如图14、15所示，结果显示BPN给药组经660nm激光照射后能显著抑制肿瘤的发展，在24天内的肿瘤体积均小于100mm3。肺部的成像图可以看出BPN+laser组别可以明显降低肺部转移瘤病灶，表现为Luc荧光强度最低。
实施例10：细菌外膜囊泡OMV与植物类囊体NTs质量比对融合效率的影响
融合囊泡的比例筛选方法如下：混合液总体积固定为1mL，并固定OMV的浓度为50μg/mL即50μg，囊体的浓度分布为0-200μg/mL，即0-200μg，OMV和NTs物理混合后，使用微型挤出机通过200nm聚碳酸酯多孔膜挤出以使NTs与OMVs融合；
上述细菌外膜囊泡OMV与植物类囊体NTs的混合体系，用细胞流式仪(Backman,CytoFlex LX)进行检测，筛选了OMV:NTs＝1:0.2、1:0.4、1:0.8、1:1、1:2、1:4的比例，当OMV:NTs＝1:0.8时，流式检测的融合效率最高，达到80％以上。
上述细菌外膜囊泡OMV的粒径为88.03nm，上述类囊体经过200nm聚碳酸酯多孔膜挤出后粒径为205.89nm，融合囊泡的最佳融合比例的粒径为226.03nm。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。