具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

下述实施例中使用的起始物料如下：

1、三甲胺盐酸盐，含量限度≥99.0%，供应商：山东力鼎新型材料有限公司；

2、十二烷基二甲基胺，含量限度≥97.0%，供应商：克莱恩丰益脂肪胺（连云港）有限公司；

3、环氧氯丙烷，含量限度≥99.0%，供应商：山东信恒化工有限公司。

下述实施例中季铵化反应工序在不锈钢电加热瓷釜中进行；过滤工序在精密过滤器中进行，设备型号RG—6型。

实施例1、十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵的合成

十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵的生产工艺流程图如图1所示。

先将称量好的叔胺（十二烷基二甲基胺）（453g）加入搪瓷釜中，开动搅拌，30分钟后，停止搅拌加入环氧氯丙烷（241g），季铵化反应开始，物料温度从室温开始上升，温度超过80℃时开始通入冷却水，控制温度不得超过110℃。保持80℃-110℃（具体选择100℃）温度继续反应4小时，停止搅拌，加入三甲胺盐酸盐（195g）开始第二次季铵化反应，保持80℃-110℃（具体选择100℃）温度继续反应3小时，得到十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵（产率为90%，纯度为95%）。

其红外光谱图如图2所示。

经结构鉴定，所得化合物确为目标产物十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵。

上述反应关键工艺参数：反应温度控制在80℃-110℃，反应时间不低于7小时

对目标产物进行检测：

1、性状：目标产物常温下应为黄色胶状体，低温时可逐渐形成蜡状固体；水溶液显碱性反应，振摇时产生多量泡沫；

2、非季铵类物：前后两次消耗的碘酸钾滴定液（0.05mol/L）之差，不得大于0.5ml；

3、含量测定：

用电位滴定法测定含量。按无水物计算，含烃铵盐（C₂₀H₄₆N₂OCl₂）为97.0％—103.0%。

检验合格后，打开反应釜出料口，将半成品放入贮料桶中，开动过滤机，进行过滤操作。然后将过滤好的产品抽至目标包装桶内，领取标签，标签上的批号、生产日期、有效期应已打印好。

对比例1：合成十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵

先将称量好的叔胺（十二烷基二甲基胺）（453g）加入搪瓷釜中，开动搅拌，30分钟后，停止搅拌加入环氧氯丙烷（241g），季铵化反应开始，物料温度从室温开始上升，达到60-70℃（具体为65℃）时保持该温度继续反应4小时，停止搅拌，加入三甲胺盐酸盐（195g）开始第二次季铵化反应，保持60-70℃（具体为65℃）温度继续反应3小时，得到十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵（产率为60%，纯度为80%）。

对比例2：合成十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵

先将称量好的叔胺（十二烷基二甲基胺）（453g）加入搪瓷釜中，开动搅拌，30分钟后，停止搅拌加入环氧氯丙烷（241g），季铵化反应开始，物料温度从室温开始上升，温度超过80℃时开始通入冷却水，控制温度不得超过110℃。保持80℃-110℃温度继续反应3小时，停止搅拌，加入三甲胺盐酸盐（195g）开始第二次季铵化反应，保持80℃-110℃温度继续反应2.5小时，得到十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵（产率为75%，纯度为86%）。

实施例2、十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵的药效试验

消毒工作是预防和控制疫病发生的重要环节之一，是切断病原微生物传播的主要手段。近年来，国内外均致力于寻求高效、快速、广谱的消毒剂。本发明制备的十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵，对环境中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希杆菌、溶血性链球菌C 群具有杀灭作用。为确证其消毒效果进行实验室抑菌和猪舍环境消毒试验，报告如下。

一、材料和方法

1、试验材料

1.1受试菌种金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、溶血性链球菌C群，分别以A、B、C表示。由本课题组提供。

1.2试剂 10g/L蛋白胨的磷酸盐缓冲液、普通营养琼脂培养基小牛血清、马丁肉汤培养基

1.3脱脂白平纹布片（10mm×10mm）、PQ-240 型喷雾消毒机。

1.4试验用猪舍：由山西农业科学院畜牧兽医研究所猪场提供。

1.5药品：十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵：由山西诺苇生物技术有限公司生产（按照实施例1的方法制备），中和剂甘氨酸和吐温- 80从市场购买。十二烷基二甲基苄基氯化铵消毒剂：山东泰和水处理股份有限公司生产，批号：200716，规格：40％。

2、试验方法

2.1中和剂按文献[1]选择甘氨酸和吐温- 80作为消毒剂的中和剂，测定最佳中和浓度。

2.2菌液制备将细菌传至第6～8代，用PBS液稀释成5×10⁶CFU/mL 细菌悬液。

2.3杀菌试验

2.3.1定性杀菌试验

十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵消毒剂用灭菌蒸馏水稀释成不同浓度，每管2.5mL分别加入等量受试菌液，混匀，置于20℃水浴中，每隔5、10、15、30和60min，从每管中取0.5mL，加入到含中和剂的4.5mL马丁肉汤中摇匀，中和10min之后，再取出0.5mL加到4.5mL马丁肉汤培养基内，置37℃培养24h，观察细菌生长情况，混浊表示细菌生长，不变混浊继续培养至第7天，仍不混浊可判为无菌生长。同时设对照管。

2.3.2载体定量杀菌试验

将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，分别用含10g/L蛋白胨的磷酸盐缓冲液（PBS）制成菌悬液。取菌悬液0.02ml，滴染于脱脂白平纹布片（10mm×10mm）上。置37℃培养箱内干燥20min，制成菌片。实验时，将1片菌片加入5.0ml消毒液（阳性对照为PBS）中。作用至规定时间，取出菌片，移入50ml中和剂溶液的试管中，中和作用10min，敲打试管以洗脱菌片上菌并混匀。取洗脱液0.5ml作普通营养琼脂倾注接种，置37℃培养48h，观察结果。计算杀灭率。

2.3.3观察有机物影响时，向菌悬液中加入小牛血清后再染制菌片，按上述程序进行试验。

2.3.4猪场猪舍消毒试验

选用猪舍进行现场消毒效果的观察，猪舍为砖混结构，金属栏饲养，水泥地面。经过清扫及自来水冲洗，待干燥后，用PQ-240 型喷雾消毒机，将十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵消毒剂分为试验1、2、3组按1∶300、1∶600、1∶900稀释后喷洒，4组为对照组（十二烷基二甲基苄基氯化铵），喷洒后关闭门窗1h。消毒前与消毒后，分别用平皿暴露法，在猪舍四角和中间五点放置琼脂培养基平皿，放置约半小时采样；随后将琼脂培养基平皿放入37℃温箱培养24h，数出消毒前与消毒后的菌落数，计算杀灭率。

3、观察项目

3.1细菌在马丁肉汤培养基中的生长情况，培养基变浑浊为阳性、不变浑浊为阴性。

3.2消毒前后细菌在琼脂培养基上生长菌落数的变化。

二、试验结果

1、中和剂效果

以金黄色葡萄球菌为指示细菌，结果表明：以50g/L甘氨酸和吐温- 80 的缓冲液作为中和剂能有效地中和10%的消毒剂溶液，且并不影响细菌的生长。

2、杀菌效果

2.1三种细菌分别与不同浓度的消毒剂作用不同时间，以无菌生长管的消毒剂最低浓度为最低杀菌有效浓度，以无菌生长管的最短消毒时间为该浓度杀菌最快有效时间（结果见表1）。

表1 十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵消毒剂对细菌定性杀菌试验结果

注: ①A、B、C 分别代表金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、溶血性链球菌;

②“+ ”表示有细菌生长，“-”表示无细菌生长;

③表内结果是6 次试验的平均值。

从表1中可看出: 十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵消毒剂1∶700 稀释时，10min能有效杀灭金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、溶血性链球菌。

2.2载体定量杀菌试验（结果见表2）

表2 不同时间杀菌效果一览表

注：（1）试验温度为19～22℃；

（2）阳性对照组大肠杆菌菌数为1310000cfu/片；

（3）金黄色葡萄球菌菌数为1500000 cfu/片；

（4）结果为3次试验平均值。

从表2中可看出：金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌消毒作用7min杀灭率达99.10%以上。

2.3有机物影响试验

当菌悬液含体积分数50%小牛血清时，十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵消毒剂对金黄色葡萄球菌杀灭效果有轻度影响（结果见表3）。

表3有机物影响试验结果

2.4猪场猪舍消毒效果

十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵消毒剂对猪场猪舍的消毒效果（结果见表4）

表4 猪场猪舍消毒前后菌落数

从表4中可看出：使用十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵消毒后，猪舍的菌落数明显减少，试验组1、2、3和对照组的灭菌率分别为99.5%、98.9% 、91.5%和91.1%。

三、小结与讨论

1.从对细菌杀灭效果来看，其制剂充分发挥了有效的杀灭效果，扩大了杀菌谱，使用方便。十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵破坏细菌表面的蛋白受体。在实验室的条件下，即使作1∶700倍稀释，在10min内，能有效地杀灭金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、溶血性链球菌；既能杀灭革兰氏阳性菌、又能杀灭革兰氏阴性菌，载体定量杀菌试验金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌消毒作用7min杀灭率达99.10%以上。当菌悬液含体积分数50%小牛血清时，十二烷基二甲基羟丙基三甲基氯化二铵消毒剂对金黄色葡萄球菌杀灭效果有轻度影响。

2.现场消毒，试验组分1∶300、1：600、1：900三个剂量，在60 min灭菌率分别为99.5%、98.9％和91.5％。对照组1：600，灭菌率为91.1％。因此，临床应用推荐剂量为：1∶600。

3.实验室条件下研究消毒剂的消毒效果时，当混合液移到培养基中时，不可避免地带有少量残余消毒剂，能继续阻碍细菌在培养基中的生长繁殖，形成阴性结果^[2]，所以，在测定杀菌浓度试验时，必须除去残余的消毒剂的影响。本研究中，选用的中和剂能很好地中和消毒剂，且其浓度并不影响细菌的生长。

参考文献：

[1]傅先强、刘占军养禽场禽病检验手册[M]：北京：中国农业大学出版社，1992.130～133.

[2]张建时、孙祖越、严雪铭等，含碘清洗消毒剂对临床微生物的杀灭效果[J ]：中国消毒学杂志， 1998， 15 (2)： 108～110.