具体实施方式

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数，反之亦然。

如本文所用，术语“抗原结合分子”在其最广义上是指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的示例是抗体、抗体片段和支架抗原结合蛋白。

术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的一部分，其包含与抗原的一部分或全部特异性结合并互补的区域。在抗原很大的情况下，抗原结合分子可以仅与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。抗原结合结构域可以由例如一个或多个可变结构域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，但是其也可以由支架抗原结合蛋白，特别是脂质运载蛋白突变蛋白提供。

如本文所用，术语“能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域”或“能够特异性结合到靶细胞抗原的部分”是指特异性结合到靶细胞抗原的多肽分子。在一个方面，抗原结合结构域能够将与其附接的实体(例如能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白)引导至靶位点，例如引导至携带靶细胞抗原的特定类型的肿瘤细胞。能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域包括如本文进一步定义的抗体及其片段。此外，能够特异性结合到靶细胞抗原的部分包括如本文进一步定义的支架抗原结合蛋白。关于抗体或其片段，术语“能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域”包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

如本文所用，术语“能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段”是指特异性结合到靶细胞抗原的Fab分子。在一个方面，抗原结合部分能够通过其靶细胞抗原活化信号传导。在一个特定方面，抗原结合部分能够将与其附接的实体(例如脂质运载蛋白突变蛋白)引导至靶位点，例如引导至携带靶细胞抗原的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。

本文的术语“抗体”以最广义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，以及抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。

如本文所用，术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，每个结合位点与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性结合到至少两种不同的抗原决定簇(靶标)。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在一个特定方面，双特异性抗原结合分子包含三个抗原结合位点，其中两个抗原结合位点对第一抗原决定簇具有特异性，并且一个抗原结合位点对第二抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。

如在本申请中所用的术语“价”表示抗原结合分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语“单价”、“二价”“四价”和“六价”分别表示抗原结合分子中存在一个结合位点、两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。

如本申请中使用的术语“与抗原单价”表示在抗原结合分子中仅存在所述抗原的一个结合位点。如本申请中使用的术语“与靶细胞抗原单价”表示在抗原结合分子中仅存在所述靶细胞抗原的一个结合位点。

术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本上相似的结构的抗体。“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由通过二硫键键合的两条轻链和两条重链组成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，后接三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)(也称为重链恒定区)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，后接轻链恒定结构域(CL)(也称为轻链恒定区)。抗体的重链可以分配为五种类型中的一种，所述五种类型被称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，它们中的一些可以进一步分为亚型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。

“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，所述部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双体抗体、三体抗体、四体抗体、交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；以及单结构域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun在The harmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)中所述；还可参见WO 93/16185；以及美国专利5,571,894和5,587,458。关于对包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利5,869,046。双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，该双体抗体可以是二价的或双特异性的，参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。在Hudson等人，NatMed 9,129-134(2003)中也描述了三体抗体和四体抗体。单结构域抗体为包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，Waltham，MA；参见例如美国专利6,248,516 B1)。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文所述。

木瓜蛋白酶消化完整抗体产生两个称为“Fab”片段的相同的抗原结合片段，每个“Fab”片段含有重链可变结构域和轻链可变结构域以及轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。因此，如本文所用，术语“Fab片段”是指包含轻链片段以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段，所述轻链片段包含VL结构域和轻链恒定结构域(CL)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于Fab'片段在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，这些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有游离巯基。胃蛋白酶处理产生F(ab')₂片段，其具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分。

术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交换型Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：在一个方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换型Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab_(VLVH)。在另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换型Fab分子包含包括重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)的肽链，以及包括轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)的肽链。该交换型Fab分子也称为CrossFab_(CLCH1)。在一个方面，术语“Fab片段”还包括交叉Fab片段。

“支架抗原结合蛋白”是本领域已知的，例如纤连蛋白和设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)已被用作抗原结合结构域的替代支架，参见例如Gebauer和Skerra，Engineeredprotein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin ChemBiol 13:245-255(2009)和Stumpp等人，Darpins:A new generation of proteintherapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面中，支架抗原结合蛋白选自由以下项组成的组：CTLA-4(Evibody)、脂质运载蛋白(Anticalin)、蛋白A衍生的分子(诸如蛋白A的Z结构域(亲和体))、A结构域(Avimer/巨型抗体)、血清转铁蛋白(反式体)；设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)、抗体轻链或重链的可变结构域(单结构域抗体，sdAb)、抗体重链的可变结构域(纳米抗体，aVH)、V_NAR片段、纤连蛋白(AdNectin)、C型凝集素结构域(四连接素)；新抗原受体β-内酰胺酶的可变结构域(V_NAR片段)、人γ-晶体蛋白或泛素蛋白(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型结构域、微型体(诸如来自knottin家族的蛋白质)、肽适体和纤连蛋白(adnectin)。CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4⁺ T细胞上表达的CD28家族受体。其胞外域具有可变结构域样Ig折叠。对应于抗体CDR的环可以用异源序列取代，以赋予不同的结合性质。经工程化改造以具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称为Evibody(例如US7166697B1)。Evibody与抗体(例如结构域抗体)的分离的可变区大小大致相同。关于进一步的细节，参见Journal ofImmunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是细胞外蛋白质家族，其运输小的疏水性分子，诸如类固醇、胆素、类维生素A和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端处具有许多环，可以工程化改造成与不同的靶抗原结合。Anticalin的大小介于160-180个氨基酸之间，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步的细节，参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)、US7250297B1和US20070224633。亲和体是来源于金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的支架，其可以被工程化改造以与抗原结合。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化形成了文库。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462和EP1641818A1。Avimer是来源于A结构域支架家族的多结构域蛋白质。约35个氨基酸的天然结构域采用确定的二硫键键合结构。多样性是通过重组A结构域家族表现出的自然变异而形成的。关于进一步的细节，参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列来工程化改造转铁蛋白，以结合不同的靶抗原。工程化改造的转铁蛋白支架的示例包括反式体。关于进一步的细节，参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞支架的附接的蛋白质家族。单个锚蛋白重复序列是由两个α-螺旋和一个β-转角组成的33残基基序。它们可通过随机化每个重复序列中的第一α-螺旋和β-转角中的残基，而工程化改造成结合不同的靶抗原。它们的结合界面可以通过增加模块的数量来增加(亲和力成熟方法)。关于进一步的细节，参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003)、PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。单结构域抗体是由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。第一单结构域来源于骆驼科动物的抗体重链的可变结构域(纳米抗体或V_HH片段)。此外，术语单结构域抗体包含自体人重链可变结构域(aVH)或来源于鲨鱼的V_NAR片段。纤连蛋白可以经工程化改造以结合抗原的支架。Adnectin由III型人纤连蛋白(FN3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的主链组成。β-夹层的一个端部处的三个环可以经工程化改造，以使Adnectin能够特异性识别目标治疗靶标。关于进一步细节，参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764和US6818418B1。肽适体是组合的识别分子，该组合的识别分子由恒定的支架蛋白，通常是硫氧还蛋白(TrxA)组成，所述恒定的支架蛋白含有在活性位点处插入的受约束的可变肽环。关于进一步细节，参见ExpertOpin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。微型体来源于含有3-4个半胱氨酸桥、长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，微蛋白的示例包括KalataBI和芋螺毒素以及knottin。微蛋白具有环，其可以经工程化改造为包括最高达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠。关于工程化改造的knottin结构域的进一步细节，参见WO2008098796。

脂质运载蛋白是细胞外蛋白质家族，其运输小的疏水性分子，诸如类固醇、胆素、类维生素A和脂质。脂质运载蛋白是重量为约18-20kDa的单体蛋白质，其表现出具有高结构可塑性的结合位点，其包括安装在稳定b筒支架上的四个肽环(Skerra,FEBS Journal2008,275,2677-2683)。因此，它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端处具有许多环，其可以工程化改造成与不同的靶抗原结合。从而产生对某个靶抗原具有特异性的脂质运载蛋白突变蛋白。“脂质运载蛋白突变蛋白”是突变的蛋白质，其中与天然存在的(野生型)脂质运载蛋白相比，一个或多个氨基酸被交换、缺失或插入。术语脂质运载蛋白突变蛋白还包括野生型脂质运载蛋白的片段或变体。如本文所述的脂质运载蛋白突变蛋白的大小在160-180个氨基酸之间。在一个特定方面，脂质运载蛋白突变蛋白是由其超二级结构定义的多肽，即圆柱形β-折叠片状超二级结构区，其包含在一端通过四个环成对连接的8个β-链从而限定结合袋(pocket)，其中在所述四个环中的至少三个环中的每一个的至少一个氨基酸已经突变并且其中所述脂质运载蛋白以可检测的亲和力有效结合4-1BB。

在一个方面，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白是源自人泪液脂质运载蛋白(TLPC或Tlc)的突变蛋白，也称为泪液前白蛋白或冯-埃布纳(von Ebner)腺蛋白。如本文所用，术语“人泪液脂质运载蛋白”或“Tlc”是指具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P31025(同种型1)的成熟人泪液脂质运载蛋白。这种类型的脂质运载蛋白突变蛋白因此源自SEQ ID NO：90的氨基酸序列。具体地，本文公开的脂质运载蛋白突变蛋白是源自具有SWISS-PROT/UniProt数据库登录号P80188的成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(huNGAL)的突变蛋白。这种类型的脂质运载蛋白突变蛋白可以被指定为“huNGAL突变蛋白”并且源自SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽。在一些方面，能够以可检测的亲和力特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白可以包括至少一个氨基酸取代，其中天然半胱氨酸残基被另一个氨基酸(例如丝氨酸残基)取代。在一些其他方面，能够以可检测的亲和力特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白可以包括一个或多个非天然半胱氨酸残基，其取代了野生型脂质运载蛋白的一个或多个氨基酸。在另一个特定方面，能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白包括至少两个氨基酸取代，其中天然氨基酸被半胱氨酸残基取代，由此形成一个或多个半胱氨酸桥。在一些实施例中，所述半胱氨酸桥可以连接至少两个环区。在相关方面，本公开教导了能够通过结合到4-1BB来活化4-1BB的下游信号传导通路的一种或多种(一个或多个)脂质运载蛋白突变蛋白。

作为参考分子的“结合相同表位的抗原结合分子”是指这样的抗原结合分子，在竞争测定中所述抗原结合分子使参考分子与其抗原的结合被阻断50％或更多，并且相反地，在竞争测定中参考分子使抗原结合分子与其抗原的结合被阻断50％或更多。

如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指多肽大分子上的位点(例如一段连续的氨基酸或由非连续氨基酸的不同区域组成的构象构型)，抗原结合部分与所述位点结合，从而形成抗原结合部分-抗原复合物。有用的抗原决定簇可以在例如肿瘤细胞的表面上、病毒感染细胞的表面上、其他患病细胞的表面上、免疫细胞的表面上、血清中的游离物和/或细胞外基质(ECM)中找到。除非另有说明，否则本文中用作抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的任何天然形式的蛋白质，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人类)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在一个具体实施例中，抗原是人蛋白质。当提及本文中的特定蛋白质时，该术语涵盖“全长”、未加工的蛋白质，以及由细胞内加工而产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖天然存在的蛋白质变体，例如剪接变体或等位基因变体。

“特异性结合”是指结合对于抗原具有选择性，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施例中，例如如通过SPR所测得的，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于所述抗原结合分子与抗原的结合程度的约10％。在某些实施例中，与抗原结合的分子的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更低，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。

“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(K_D)表示，解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。

“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个互补决定区(CDR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致了抗体对抗原的亲和力的改善。

如本文所用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，该靶细胞为例如肿瘤中的细胞(诸如癌细胞或肿瘤基质的细胞)。在某些实施例中，靶细胞抗原为肿瘤细胞表面的抗原。在一个实施例中，靶细胞抗原选自由以下项组成的组：成纤维细胞活化蛋白(FAP)、HER2、癌胚抗原(CEA)、黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)、表皮生长因子受体(EGFR)、CD19、CD20和CD33。具体地，靶细胞抗原是成纤维细胞活化蛋白(FAP)或HER2。

术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”也称为脯氨酰内肽酶FAP或Seprase(EC3.4.21)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工FAP，以及通过细胞中加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。在一个实施例中，本发明的抗原结合分子能够特异性结合到人、小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列示出于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(149版，SEQ ID NO:91)或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。人FAP的胞外域(ECD)从氨基酸位置26延伸至氨基酸位置760。His标记的人FAP ECD的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:92中。小鼠FAP的氨基酸序列示出于UniProt登录号P97321(126版，SEQ ID NO:93)或NCBI RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP的胞外域(ECD)从氨基酸位置26延伸至氨基酸位置761。SEQ ID NO.94示出His标记的小鼠FAP ECD的氨基酸序列。SEQ ID NO:95示出His标记的食蟹猴FAP ECD的氨基酸序列。优选地，本发明的抗FAP结合分子结合到FAP的胞外域。示例性抗FAP结合分子描述于国际专利申请号WO 2012/020006 A2中。

术语“能够特异性结合到FAP”是指能够以足够的亲和力结合到FAP的抗原结合分子，使得所述抗原结合分子可用作靶向FAP的诊断和/或治疗剂。抗原结合分子包括但不限于抗体、Fab分子、交换型Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单域抗体以及VH和支架抗原结合蛋白。在一个方面，如例如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的，抗FAP抗原结合分子与不相关的、非FAP蛋白的结合程度小于抗原结合分子与FAP的结合的约10％。具体地，能够特异性结合到FAP的抗原结合分子具有以下解离常数(K_d)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更低，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。在某些方面，抗FAP抗原结合分子结合到来自不同物种的FAP。具体地，抗FAP抗原结合分子结合到人和食蟹猴FAP或人、食蟹猴和小鼠FAP。

术语“癌胚抗原(CEA)”也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CEA，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CEA的氨基酸序列示出于UniProt登录号P06731(151版，SEQ ID NO:96)中。长期以来，CEA被鉴定为一种肿瘤相关的抗原(Gold和Freedman，J Exp Med.，121:439-462，1965；Berinstein N.L.，J Clin Oncol.，20:2197-2207，2002)。CEA最初被归类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现已在多种正常成人组织中鉴定出来。这些组织主要来源于上皮，包括胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的细胞以及结肠、子宫颈、汗腺和前列腺的细胞(Nap等人，Tumour Biol.，9(2-3):145-53，1988；Nap等人，Cancer Res.，52(8):2329-23339，1992)。上皮来源的肿瘤及其转移均包含CEA作为肿瘤相关抗原。CEA本身的存在并不表示已转化为癌细胞，但CEA的分布具有指示性。在正常组织中，CEA通常在细胞顶面上表达(S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))，使其无法被血流中的抗体吸收。与正常组织相比，CEA倾向于在癌细胞的整个表面表达(S.,SeminCancer Biol.9(2):67-81(1999))。表达模式的这一变化使CEA易于与癌细胞中的抗体结合。此外，CEA在癌细胞中的表达增加。此外，CEA表达的增加促进细胞间粘附的增加，其可能导致转移(Marshall J.,Semin Oncol.,30(a Suppl.8):30-6,2003)。CEA在各种肿瘤实体中的表达普遍非常高。根据已发表的数据，自己在组织样品中实施的分析证实了CEA的高发性，其中在大肠癌(CRC)中的发生率为约95％，在胰腺癌中的发生率为90％，在胃癌中的发生率为80％，在非小细胞肺癌(NSCLC，与HER3共表达)中的发生率为60％，在乳腺癌中的发生率为40％；并且发现在小细胞肺癌和胶质母细胞瘤中的表达水平低。

CEA易于从细胞表面裂解，并且直接或通过淋巴管从肿瘤中流入血流中。由于这种特性，血清CEA水平已被用作诊断癌症和筛查癌症(尤其是结直肠癌)复发的临床指标(Goldenberg D M.，The International Journal of Biological Markers，7:183-188，1992；Chau I.等人，J Clin Oncol.，22:1420-1429，2004；Flamini等人，Clin Cancer Res；12(23):6985-6988，2006)。

术语“黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白多糖(MCSP)”也称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然MCSP，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人MCSP的氨基酸序列示出于UniProt登录号Q6UVK1(103版，SEQ IDNO:97)中。术语“表皮生长因子受体(EGFR)”也称为原癌基因c-ErbB-1或受体酪氨酸蛋白激酶erbB-1，除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然EGFR，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人EGFR的氨基酸序列示出于UniProt登录号P00533(211版，SEQ IDNO:98)中。

术语“CD19”是指B淋巴细胞抗原CD19，也称为B淋巴细胞表面抗原B4或T细胞表面抗原Leu-12，并且除非另有说明，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD19，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CD19的氨基酸序列示出于UniProt登录号P15391(160版，SEQ ID NO:99)中。所述术语涵盖“全长”未加工的人CD19以及由细胞中加工产生的任何形式的人CD19，只要如本文报道的抗体与其结合即可。CD19是一种结构不同的细胞表面受体，表达于人B细胞的表面上，所述人B细胞包括但不限于前B细胞、早期发育中的B细胞(即未成熟B细胞)、通过终末分化成浆细胞的成熟B细胞和恶性B细胞。CD19由大多数前B急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)、前淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、常见急性淋巴细胞白血病和一些无效急性(Null-acute)淋巴细胞白血病表达。CD19在浆细胞上的表达进一步表明它可能在分化的B细胞肿瘤(诸如多发性骨髓瘤)上表达。因此，CD19抗原是治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病和/或急性淋巴细胞白血病的免疫疗法的靶标。

“CD20”指B淋巴细胞抗原CD20，也称为跨膜4结构域亚家族A成员1(MS4A1)、B淋巴细胞表面抗原B1或白细胞表面抗原Leu-16，并且除非另有说明，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD20，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CD20的氨基酸序列示出于UniProt登录号P11836(149版，SEQ ID NO:100)中。“CD33”是指髓样细胞表面抗原CD33，也称为SIGLEC3或gp67，并且除非另有说明，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD33，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。人CD33的氨基酸序列示出于UniProt登录号P20138(157版，SEQ ID NO:101)中。

术语“HER2”，也称为“ErbB2”、“ErbB2受体”或“c-Erb-B2”，是指由细胞中HER2前体蛋白的加工产生的任何天然、成熟的HER2。除非另外指明，否则术语包括来自任何脊椎动物来源的HER2，所述脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(诸如，人和食蟹猴)和啮齿动物(诸如，小鼠和大鼠)。该术语还包括HER2的天然存在变体，例如，剪接变体或等位基因变体。示例性人HER2蛋白的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:102中。

术语“能够特异性结合到HER2”是指能够以足够的亲和力结合到HER2的抗原结合分子，使得所述抗原结合分子可用作靶向HER2的诊断和/或治疗剂。抗原结合分子包括但不限于抗体、Fab分子、交换型Fab分子、单链Fab分子、Fv分子、scFv分子、单域抗体以及VH和支架抗原结合蛋白。在一个方面，如例如通过表面等离子体共振(SPR)测量的，抗HER2抗原结合分子与不相关的、非HER2蛋白的结合程度小于抗原结合分子与HER2的结合的约10％。具体地，能够特异性结合到HER2的抗原结合分子具有以下解离常数(K_d)：≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10^-8M或更低，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。在某些方面，抗HER2抗原结合分子结合到来自不同物种的HER2。具体地，抗HER2抗原结合分子结合到人和食蟹猴HER2。

术语“表位”表示与抗[[PRO]]抗体结合的蛋白质或非蛋白质的抗原上的位点。表位可以由连续的氨基酸段形成(线性表位)，或者包含非连续的氨基酸(构象表位)，例如由于抗原折叠，即通过蛋白质抗原的三级折叠而在空间上接近。在蛋白质抗原暴露于变性剂后，线性表位通常仍被抗体结合，而构象表位通常在用变性剂处理后被破坏。表位包含独特的立体构象中的至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或8-10个氨基酸。

“表位4D5”或“4D5表位”或“4D5”是HER2的胞外域中的与抗体4D5(ATCC CRL10463)和曲妥珠单抗结合的区域。该表位靠近HER2的跨膜结构域，并且在HER2的结构域IV内。为了筛选与4D5表位结合的抗体，需要进行常规的交叉阻断测定诸如Antibodies,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)所述。可替代地，可以进行表位作图(mapping)以评估抗体是否结合到HER2的4D5表位(诸如，人HER2(SEQ ID NO:102)的约残基550至约残基610(包括端值)的区域中的任何一个或多个残基)。

“表位2C4”或“2C4表位”是HER2的胞外域中的与抗体2C4结合的区域。为了筛选与2C4表位结合的抗体，可以进行常规的交叉阻断测定诸如Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的。可替代地，可以进行表位作图以评估抗体是否结合到HER2的2C4表位。表位2C4包含来自HER2的胞外域中的结构域II的残基。2C4抗体和帕妥珠单抗在结构域I、II和III的连接处结合到HER2的胞外域(Franklin等人，Cancer Cell 5:317-328(2004))。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如，Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的在序列上高变并确定抗原结合特异性的各个区域，例如“互补决定区”(“CDR”)。

通常，抗体包含六个CDR；三个在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且三个在VL中的(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：

(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高可变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；以及

(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。

除非另有说明，否则CDR根据Kabat等人所述的方法(同上)确定。本领域技术人员将理解，也可以根据Chothia(同上)、McCallum(同上)所述的方法或任何其他在科学上接受的命名系统来确定CDR名称。

“框架”或“FR”是指除互补决定区(CDR)之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2-CDR-H2(CDR-L2)-FR3-CDR-H3(CDR-L3)-FR4。

术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地使用，是指具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。

“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在一个方面，对于VL，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组κI。在一个方面，对于VH，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组III。

术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。

抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁，以及IgA₂。在某些方面，抗体是IgG₁同种型。在某些方面，抗体是具有P329G、L234A和L235A突变以降低Fc区效应子功能的IgG₁同种型。在其他方面，抗体是IgG₂同种型。在某些方面，抗体是在铰链区具有S228P突变的IgG₄同种型，以改善IgG₄抗体的稳定性。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。

如本申请中所用的术语“衍生自人源的恒定区”或“人恒定区”表示亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区。此类恒定区在现有技术中是众所周知的并且例如，通过以下描述的：Kabat，E.A.，等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)(还参见，例如Johnson，G.，和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)。除非本文另外规定，否则恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为Kabat的EU索引，如在Kabat，E.A.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242中所述。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历进行过人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是这样的抗体，相对于原始抗体，所述抗体中的恒定区已经经过了另外修饰或改变，以产生根据本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。

“人”抗体是这样的抗体，其具有的氨基酸序列与由人或人细胞产生的或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相对应。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

本文中的术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，由宿主细胞产生的抗体可以经历对来自重链的C末端的一个或多个，特别是一个或两个氨基酸的翻译后切割。因此，由宿主细胞通过表达编码全长重链的特定核酸分子产生的抗体可以包括全长重链，或者所述抗体可以包括全长重链的切割变体。这可能是重链的最后两个C末端氨基酸为甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447，根据Kabat EU索引)的情况。因此，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)或C末端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。如果没有另外指明，则包含Fc区的重链的氨基酸序列在本文中被表示为没有C末端甘氨酸-赖氨酸二肽。在一个实施例中，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施例中，包括如本文所指定的Fc区的重链包含在根据本发明的抗体中，该重链包含另外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat的EU索引编号)。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中所述。IgG Fc区包含IgG CH2结构域和IgG CH3结构域。人IgGFc区的“CH2结构域”通常从大致231位的氨基酸残基延伸至大致340位的氨基酸残基。在一个实施例中，碳水化合物链附接至CH2结构域。本文的CH2结构域可以是天然序列CH2结构域或变体CH2结构域。“CH3结构域”包含Fc区中C末端至CH2结构域的一段残基(即，从IgG的约位置341处的氨基酸残基到约位置447处的氨基酸残基)。本文的CH3区可以是天然序列CH3结构域或变体CH3结构域(例如在一条链中具有引入的“凸起”(“突起”)而在另一条链中具有相应的引入的“空腔”(“孔”)的CH3结构域；参见以引用方式明确并入本文的美国专利号5,821,333)。此类变体CH3结构域可用于促进如本文所述的两条不相同的抗体重链的异二聚化。

术语“野生型Fc结构域”表示与自然界中发现的Fc结构域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc结构域包括天然人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然人IgG2 Fc区、天然人IgG3 Fc区和天然人IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。野生型Fc区表示在SEQ IDNO:122(IgG1，白种人同种异型)、SEQ ID NO:123(IgG1，非裔美国人同种异型)、SEQ ID NO:124(IgG2)、SEQ ID NO:125(IgG3)和SEQ ID NO:126(IgG4)中。

术语“变体(人)Fc结构域”表示与“野生型”(人)Fc结构域氨基酸序列的氨基酸序列区别在于至少一个“氨基酸突变”的氨基酸序列。在一个方面，与天然Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸突变，诸如在天然Fc区中从约1个到约10个氨基酸突变，并且在一个方面，从约1个到约5个氨基酸突变。在一个方面，(变体)Fc区与野生型Fc区具有至少约95％的同源性。

“杵臼结构(knob-into-hole)”技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“突起”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“孔”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。在一个具体实施例中，突起修饰包含Fc结构域的两个亚基中的一个中的氨基酸取代T366W，而孔修饰包含Fc结构域的两个亚基中的另一个中的氨基酸取代T366S、L368A和Y407V。在另一个具体实施例中，包含突起修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代S354C，而包含孔修饰的Fc结构域的亚基另外包含氨基酸取代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。编号是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD，1991的EU索引。

“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”旨在包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代、添加或缺失但基本上不降低免疫球蛋白介导效应子功能(诸如抗体依赖性细胞毒性)的能力的修改的变体。例如，可以使一个或多个氨基酸从免疫球蛋白的Fc区的N末端或C末端缺失，而基本上不丧失生物学功能。可以根据本领域中已知的一般规则来选择此类变体，以便对活性具有最小的影响(参见例如Bowie,J.U.等人，Science 247:1306-10(1990))。

术语“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区、随着抗体同种型的变化而变化的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、下调细胞表面受体(例如B细胞受体)，以及B细胞活化。

“活化Fc受体”是这样的Fc受体，其在抗体的Fc区接合后，引起刺激携带受体的细胞执行效应子功能的信号传导事件。活化Fc受体包括FcγRⅢa(CD16a)、FcγRⅠ(CD64)、FcγRⅡa(CD32)和FcαRⅠ(CD89)。特定的活化Fc受体是人FcγRⅢa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。

“肿瘤坏死因子受体超家族”或“TNF受体超家族”目前由27种受体组成。它是一组细胞因子受体，其特征在于能够通过细胞外富含半胱氨酸的结构域(CRD)结合肿瘤坏死因子(TNF)。这些假重复由受体链内高度保守的半胱氨酸残基所产生的链内二硫化物定义。除神经生长因子(NGF)外，所有TNF都与原型TNF-α同源。大多数TNF受体以其活性形式在血浆膜中形成三聚体复合物。因此，大多数TNF受体含有跨膜结构域(TMD)。这些受体中的多种受体还包含细胞内死亡结构域(DD)，这些结构域在配体结合后召集与胱天蛋白酶相互作用的蛋白质，从而起始胱天蛋白酶活化的外源途径。其他缺乏死亡结构域的TNF超家族受体与TNF受体相关因子结合并且活化细胞内信号传导通路，从而导致增殖或分化。这些受体也可起始细胞凋亡，但它们经由间接机制发挥作用。除调节细胞凋亡以外，多种TNF超家族受体还参与调节免疫细胞功能，诸如B细胞稳态和活化、自然杀伤细胞活化和T细胞协同刺激。多种其他调节特定细胞类型的应答，诸如毛囊发育和破骨细胞发育。TNF受体超家族的成员包括：肿瘤坏死因子受体1(1A)(TNFRSF1A,CD120a)、肿瘤坏死因子受体2(1B)(TNFRSF1B,CD120b)、淋巴毒素β受体(LTBR,CD18)、OX40(TNFRSF4,CD134)、CD40(Bp50)、Fas受体(Apo-1,CD95,FAS)、诱骗受体3(TR6,M68,TNFRSF6B)、CD27(S152,Tp55)、CD30(Ki-1,TNFRSF8)、4-1BB(CD137,TNFRSF9)、DR4(TRAILR1,Apo-2,CD261,TNFRSF10A)、DR5(TRAILR2,CD262,TNFRSF10B)、诱骗受体1(TRAILR3,CD263,TNFRSF10C)、诱骗受体2(TRAILR4,CD264,TNFRSF10D)、RANK(CD265,TNFRSF11A)、骨保护素(OCIF,TR1,TNFRSF11B)、TWEAK受体(Fn14,CD266,TNFRSF12A)、TACI(CD267,TNFRSF13B)、BAFF受体(CD268,TNFRSF13C)、疱疹病毒侵入介体(HVEM,TR2,CD270,TNFRSF14)、神经生长因子受体(p75NTR,CD271,NGFR)、B细胞成熟抗原(CD269,TNFRSF17)、糖皮质激素诱导的TNFR相关(GITR,AITR,CD357,TNFRSF18)、TROY(TNFRSF19)、DR6(CD358,TNFRSF21)、DR3(Apo-3,TRAMP,WS-1,TNFRSF25)以及外胚叶发育不全A2受体(XEDAR,EDA2R)。

经过初始T细胞活化后，肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的多个成员将维持T细胞应答。术语“共刺激TNF受体家族成员”或“共刺激TNF家族受体”是指TNF受体家族成员的一个亚组，其能够协同刺激T细胞的增殖和细胞因子产生。除非另有说明，否则该术语是指来自任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族受体，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)、非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在本发明的具体实施例中，共刺激TNF受体家族成员选自由以下项组成的组：OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、CD27、HVEM(CD270)、CD30和GITR，它们对T细胞均具有共刺激作用。更具体地，共刺激TNF受体家族成员为4-1BB。

除非另外指明，否则如本文所用的术语“4-1BB”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然4-1BB，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工4-1BB，以及通过细胞中加工产生的任何形式的4-1BB。该术语还涵盖4-1BB的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人4-1BB的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:103(Uniprot登录号Q07011)中，示例性鼠4-1BB的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:104(Uniprot登录号P20334)中，并且示例性食蟹猴4-1BB(来自猕猴)的氨基酸序列示出于SEQ ID NO:105(Uniprot登录号F6W5G6)中。

术语“肽连接基”是指包含一个或多个氨基酸，通常约2至20个氨基酸的肽。肽连接基是本领域中已知的或在本文中描述的。合适的非免疫原性连接肽是例如(G₄S)_n、(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽连接基，其中“n”通常为介于1与10之间、通常介于1与4之间的数字，特别地是2，即选自由以下项组成的组的肽：GGGGS(SEQ ID NO:75)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:76)、SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:77)、(G₄S)₃或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:78)、GGGGSGGGGSGGGG或G4(SG4)₂(SEQ ID NO:79)、和(G₄S)₄或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:80)，但是还包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:81)、GSGSGSGS(SEQ ID NO:82)、GSGSGNGS(SEQ ID NO:83)、GGSGSGSG(SEQ ID NO:84)、GGSGSG(SEQ ID NO:85)、GGSG(SEQ ID NO:86)、GGSGNGSG(SEQID NO:87)、GGNGSGSG(SEQ ID No:88)和GGNGSG(SEQ ID NO:89)。特别感兴趣的肽连接基是(G₄S)₂或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:76)、(G₄S)₃(SEQ ID NO:78)和(G₄S)₄(SEQ ID NO:80)，更具体地(G₄S)₃(SEQ ID NO:78)。其他肽连接基选自由以下项组成的组：SEQ ID NO:113、SEQID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：121。

如本申请中所用的术语“氨基酸”表示包括以下项的天然存在的羧基α-氨基酸的组：丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、蛋氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)，以及缬氨酸(val，V)。

如本文所用，“融合多肽”或“融合蛋白”是指包括抗体片段和不源自抗体的肽的单链多肽。在一个方面，融合多肽包括脂质运载蛋白突变蛋白，所述脂质运载蛋白突变蛋白经由肽键连接到抗体的Fc区，任选地经由肽连接基连接。融合可以通过将脂质运载蛋白突变蛋白的N或C末端氨基酸经由肽连接基直接连接到重链的C或N末端氨基酸而发生。

“融合”或“连接到”意指组分(诸如，多肽和所述TNF配体家族成员的胞外域)直接地或经由一个或多个肽连接基而通过肽键进行连接。

相对于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对候选序列与参考多肽序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大的序列同一性百分比之后，并且在出于比对的目的而不考虑将任何保守性取代作为序列同一性的组成部分的情况下，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、Clustal W、Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。可替代地，可使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经与用户文档一起提交到U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559，在那里以美国版权登记号TXU510087注册，并且如WO 2001/007611所述。

除非另外指明，否则出于本文的目的，用BLOSUM50比较矩阵，使用FASTA包第36.3.8c版或更高版本的ggsearch程序产生氨基酸序列同一性百分比值。FASTA程序包由W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；以及Pearson等人，(1997)Genomics 46:24-36创作，并且可从www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml或www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta公开获得。可替代地，可以使用可在fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处访问的公共服务器来比较序列，使用ggsearch(全局蛋白质：蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；开放：-10；ext：-2；Ktup＝2)来确保执行全局而非局部比对。在输出的比对标头(alignment header)中给出氨基酸同一性百分比。

术语“氨基酸序列变体”包括实质性变体，其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸取代。通常，相对于亲本抗原结合分子，选为用于进一步研究的一个或多个所得变体将在某些生物学特性方面(例如，亲和力增加、免疫原性降低)有改变(例如，改善)和/或将基本上保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟抗体，其可例如使用诸如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术方便地生成。简而言之，将一个或多个CDR残基突变并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施例中，取代、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，只要此类改变基本上不降低抗原结合分子的结合抗原的能力即可。例如，可在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文提供的保守性取代)。可用于鉴别可被靶向诱变的抗体残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴别残基或一组靶残基(例如，带电残基，诸如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可在对初始取代展示功能敏感性的氨基酸位置引入其他取代。可替代地或另外地，利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构鉴别抗体与抗原之间的接触点。可靶向或消除作为取代的候选的此类接触残基和相邻残基。可筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基至含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的双特异性抗原结合分子。

在某些方面中，改变本文提供的双特异性抗原结合分子以增加或降低抗体糖基化的程度。可通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点，从而便利地获得分子的糖基化变体。当双特异性抗原结合分子包含Fc区时，附接于其上的碳水化合物可以被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支化的双触角寡糖，所述双触角寡糖通常通过N-连接附接于Fc区的CH2结构域的Asn297。参见，例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及连接于双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施例中，可以对双特异性抗原结合分子中的寡糖进行修饰，以产生具有某些改善的特性的变体。在一个方面，提供了双特异性抗原结合分子的变体，其具有缺乏附接(直接地或间接地)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能，参见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本发明的双特异性抗原结合分子的其他变体包括具有两分型寡糖的变体，例如其中附接于Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能，参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利号6,602,684(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了在附接于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能并描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；以及WO 1999/22764(Raju,S.)中。

在某些方面，可期望产生本发明的双特异性抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体，例如“thioMAb”，其中分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施例中，取代的残基存在于分子的可接近位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可用于将抗体与其他部分，诸如药物部分或连接基-药物部分缀合，以产生免疫缀合物。在某些实施例中，可用半胱氨酸取代下列残基中的任何一个或多个：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区的S400(EU编号)。可如例如美国专利号7,521,541中所述形成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。

在某些方面，可以进一步修饰本文提供的双特异性抗原结合分子以含有本领域已知且易于获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在制造中可具有优势。聚合物可具有任何分子量，并且可以具有支链或不具有支链。附接于抗体的聚合物的数目可变化，并且如果附接了多于一个聚合物，那么它们可以为相同或不同的分子。通常，可基于以下考虑因素确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改善的抗体的特定特性或功能、双特异性抗体衍生物是否将用于限定条件下的疗法等。在另一方面，提供了抗体和可通过暴露于辐射而选择性地加热的非蛋白质性部分的缀合物。在一个实施例中，非蛋白质性部分是碳纳米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可具有任何波长，并且包括但不限于对普通细胞没有伤害，但是将非蛋白质性部分加热至抗体-非蛋白质性部分附近的细胞被杀死的温度的波长。

在另一方面，可以获得本文提供的双特异性抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒性剂缀合的抗体。

术语“核酸”或“多核苷酸”包括包含核苷酸聚合物的任何化合物和/或物质。每个核苷酸由碱基组成，特别是嘌呤或嘧啶碱基(即胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即脱氧核糖或核糖)和磷酸基团。通常，核酸分子通过碱基序列进行描述，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基序列通常表示为从5'至3'。在本文中，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)(包括例如互补DNA(cDNA)和基因组DNA)、核糖核酸(RNA)(特别是信使RNA(mRNA))、DNA或RNA的合成形式，以及包含这些分子中的两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性的或环状的。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链和双链形式。此外，本文所描述的核酸分子可含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的示例包括具有衍生化的糖或磷酸主链键或经化学修饰的残基的经修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为用于本发明的抗体的体外和/或体内(例如，在宿主或患者体内)直接表达的载体的DNA和RNA分子。此类DNA(例如cDNA)或RNA(例如mRNA)载体可以是未修饰的或经修饰的。例如，可以对mRNA进行化学修饰以增强RNA载体的稳定性和/或编码分子的表达，使得可以将mRNA注射到受试者体内以产生体内抗体(参见例如Stadler等人，Nature Medicine 2017，2017年6月12日在线发表，doi:10.1038/nm.4356或EP 2 101 823 B1)。

“分离的”核酸是指已自其自然环境的组分中分离的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。

“编码双特异性抗原结合分子的分离的核酸”是指编码双特异性抗原结合分子的重链和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括在单个载体或单独的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的此类核酸分子。

术语“表达盒”是指通过重组或合成生成的多核苷酸，其具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分除其他序列之外还包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施例中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。

术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的并且是指用于将特定基因引入与其可操作地关联的靶细胞中并指导所述基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及整合入其已被引入的宿主细胞的基因组中的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体允许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体处于靶细胞内部，即通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白。在一个实施例中，本发明的表达载体包含表达盒，所述表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。

术语“宿主细胞”“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指外源核酸已被引入其中的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。宿主细胞是可以用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，举几个例子，例如培养的哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞和植物细胞，以及包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中的细胞。

药剂的“有效量”是指在其所施用的细胞或组织中产生生理学变化所需的量。

药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。治疗有效量的药剂例如消除、减少、延迟、最小化或预防疾病的不良影响。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。具体地，个体或受试者是人。

术语“药物组合物”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用配制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。

“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中除有效成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂、稳定剂或防腐剂。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的分子用于延迟疾病的发展或用于减缓疾病的进展。

如本文所用的术语“癌症”是指增生性疾病，诸如多种淋巴瘤、癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌、乳腺癌、阴性乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、B细胞癌症(淋巴瘤)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性骨髓性白血病，包括以上癌症中的任一种的难治性型式，或一种或多种以上癌症的组合。

“HER2阳性”癌症包括HER2水平高于正常水平的癌细胞。HER2阳性癌症的实例包括HER2阳性乳腺癌和HER2阳性胃癌。任选地，HER2阳性癌症的免疫组织化学(IHC)评分为2+或3+和/或原位杂交(ISH)扩增比率>2.0。

术语“早期乳腺癌(EBC)”或“早期乳腺癌”在本文中用于指尚未扩散到乳腺或腋窝淋巴结之外的乳腺癌。这包括原位导管癌和I期、IIA期、IIB期和IIIA期乳腺癌。

将肿瘤或癌症称为“0期”、“I期”、“II期”、“III期”或“IV期”、以及此分类中的各个子阶段，表示使用本领域已知的整体分期(Overall Stage Grouping)或罗马数字分期(Roman Numeral Staging)方法的肿瘤或癌症的分类。尽管癌症的实际阶段取决于癌症的类型，但总的来说，0期癌症是原位病变，I期癌症是小的局部肿瘤，II期和III期癌症是表现出局部淋巴结受累的局部晚期肿瘤，以及IV期癌症代表转移性癌症。每种类型的肿瘤的特定阶段是熟练的临床医生已知的。

术语“转移性乳腺癌”是指癌细胞通过血管或淋巴管从原始部位传递到身体其他位置的一个或多个部位，从而在除乳腺外的一个或多个器官中形成一个或多个继发性肿瘤的状态。

“晚期”癌症是指由于局部侵袭或转移而扩散到原发部位或器官之外的癌症。因此，术语“晚期”癌症包括局部晚期和转移性疾病。

“复发性”癌症是指对初始疗法(例如手术)产生反应后，在初始部位或远处复发的癌症。“局部复发”癌症是指在治疗后与先前治疗过的癌症在同一位置复发的癌症。“可手术的”或“可切除的”癌症是局限于主要器官且适合手术(切除)的癌症。“非可切除的”或“不可切除的”癌症不能通过手术去除(切除)。

本发明的双特异性抗原结合分子

本发明提供了能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的新颖双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含能够特异性结合到4-1BB的两个脂质运载蛋白突变蛋白，具有特别有利的特性，诸如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物学活性、靶向效率、降低的毒性和降低的免疫力。

本发明的双特异性抗原结合分子包含能够特异性结合到4-1BB的两个脂质运载蛋白突变蛋白，所述脂质运载蛋白突变蛋各自融合到Fc结构域的亚基之一的C末端。双特异性抗原结合分子的几何形状，并且具体地是4-1BB和靶细胞抗原的两个不同结合位点之间的距离，对于共刺激TNF受体(即4-1BB)的最佳肿瘤局部活化而言，是非常重要的(M.Rothe和A.Skerrra,BioDrugs 2018,32,233-243)。现在还发现，当分子中仅存在一个针对靶细胞抗原的抗原结合结构域时，可以获得令人印象深刻的更好活化。肿瘤靶标结合与效应细胞靶标结合的1:2的更低比率，诸如能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域与能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白的1:2的比率导致在肿瘤细胞上更高的占据密度，因此导致4-1BB激动剂在效应细胞上的密集交联，并最终导致更强的4-1BB受体下游信号传导。

在第一方面，提供了一种能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子，其包含

(a)能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域，特别是能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段，

(b)Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，以及

(c)两个能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白中的一个与Fc结构域的所述第一亚基的C末端融合，并且另一个与所述Fc结构域的所述第二亚基的C末端融合。

在进一步方面，提供了一种能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子，其包含

(a)抗原结合结构域，特别是能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段，

(b)Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，以及

(c)能够特异性结合到4-1BB的两个脂质运载蛋白突变蛋白，其中脂质运载蛋白突变蛋白中的一个与Fc结构域的第一亚基的C末端融合，并且另一个与Fc结构域的第二亚基的C末端融合，并且其中能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每个源自SEQ ID NO：1的成熟人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(huNGAL)。

在一个方面，提供了如上文所定义的双特异性抗原结合分子，其中能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其中以下氨基酸中的一个或多个按如下突变的SEQ ID NO:2的氨基酸序列：

(a)位置20处的Q被R替换，或

(b)位置25处的N被Y或D替换，或

(c)位置28处的H被Q替换，或

(d)位置36处的Q被M替换，或

(e)位置40处的I被N替换，或

(f)位置41处的R被L或K替换，或

(g)位置44处的E被V或D替换，或

(h)位置46处的K被S替换，并且位置47至49处的氨基酸被缺失，或

(i)位置49处的I被H、N、V或S替换，或

(j)位置52处的M被S或G替换，或

(k)位置59处的K被N替换，或

(l)位置65处的D被N替换，或

(m)位置68处的M被D、G或A替换，或

(n)位置70处的K被M、T、A或S替换，或

(o)位置71处的F被L替换，或

(p)位置72处的D被L替换，或

(q)位置77处的M被Q、H、T、R或N替换，或

(s)位置79处的D被I或A替换，或

(t)位置80处的I被N替换，或

(u)位置81处的W被Q、S或M替换，或

(v)位置82处的T被P替换，或

(w)位置83处的F被L替换，或

(y)位置92处的F被L或S替换，或

(z)位置94处的L被F替换，或

(za)位置96处的K被F替换，或

(zb)位置100处的F被D替换，或

(zc)位置101处的P被L替换，或

(zd)位置103处的H被P替换，或

(ze)位置106处的S被Y替换，或

(zf)位置122处的F被Y替换，或

(zg)位置125处的F被S替换，或

(zh)位置127处的F被I替换，或

(zi)位置132处的E被W替换，或

(zj)位置134处的Y被G替换。

在一个方面，能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中4至10个氨基酸已经如上文所定义被突变。在一些方面，能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白包含以下氨基酸突变中的一个或多个：

(d)位置36处的Q被M替换，或

(e)位置40处的I被N替换，或

(f)位置41处的R被L或K替换，或

(i)位置49处的I被H、N、V或S替换，或

(j)位置52处的M被S或G替换，或

(m)位置68处的M被D、G或A替换，或

(n)位置70处的K被M、T、A或S替换，或

(p)位置72处的D被L替换，或

(q)位置77处的M被Q、H、T、R或N替换，或

(s)位置79处的D被I或A替换，或

(u)位置81处的W被Q、S或M替换，或

(za)位置96处的K被F替换，或

(zb)位置100处的F被D替换，或

(zd)位置103处的H被P替换，或

(zg)位置125处的F被S替换，或

(zh)位置127处的F被I替换，或

(zi)位置132处的E被W替换，或

(zj)位置134处的Y被G替换。

在另一方面，能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白包含以下氨基酸突变中的一个或多个：

(a)位置20处的Q被R替换，或

(b)位置25处的N被Y或D替换，或

(g)位置44处的E被V或D替换，或

(k)位置59处的K被N替换，或

(o)位置71处的F被L替换，或

(t)位置80处的I被N替换，或

(v)位置82处的T被P替换，或

(y)位置92处的F被L或S替换，或

(zc)位置101处的P被L替换，或

(zf)位置122处的F被Y替换。

在一个方面，能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。在一个方面，能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。在进一步方面，能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。在一个方面，能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一个方面，脂质运载蛋白突变蛋白都包含相同的氨基酸序列。

在进一步方面，提供了一种能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子，其包含

(a)能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段；

(b)Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，以及

(c)能够特异性结合到4-1BB的两个脂质运载蛋白突变蛋白，其中脂质运载蛋白突变蛋白中的一个与Fc结构域的第一亚基的C末端融合，并且另一个与Fc结构域的第二亚基的C末端融合，并且其中能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每个源自SEQ ID NO：90的人泪液脂质运载蛋白(Tlc)。

在一个方面，能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白中的每一个均包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112。

在一个方面，本发明提供了一种双特异性抗原结合分子，其包含两个能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白，其中脂质运载蛋白突变蛋白中的一个经由肽连接基与Fc结构域的第一亚基的C末端融合，并且另一个经由肽连接基与Fc结构域的第二亚基的C末端融合。在一个方面，肽连接基具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121。在一个方面，肽连接基具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:75、SEQID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQID NO:88和SEQ ID NO:89。在另一方面，肽连接基具有选自由以下项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:117、SEQID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121。具体地，肽连接基具有SEQID NO:78的氨基酸序列，即(G₄S)₃。

在进一步方面，Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域。更具体地，Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在一个特定方面，所述Fc结构域包含促进所述Fc结构域的所述第一亚基和所述第二亚基缔合的修饰。

促进异源二聚化的Fc结构域修饰

在一个方面，本发明的双特异性抗原结合分子包含：Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基；一个能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段，所述Fab片段与Fc结构域的第一亚基的N末端融合；和能够特异性结合到4-1BB的两个脂质运载蛋白突变蛋白，其中脂质运载蛋白突变蛋白中的一个与Fc结构域的第一亚基的C末端融合，并且另一个与Fc结构域的第二亚基的C末端融合。因此，本发明的双特异性抗原结合分子包含：分别包含Fc结构域的第一亚基和第二亚基的两个不同的多肽链(“重链”)，和一个轻链。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致了两个不同的重链的几种可能的组合。为了在重组生产中提高双特异性抗原结合分子的产率和纯度，因此将有利的是在双特异性抗原结合分子的Fc结构域中引入促进所需多肽的缔合的修饰。

因此，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质间相互作用位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，所述修饰特别是在Fc结构域的CH3结构域中。

在一个具体方面，所述修饰是所谓的“杵臼结构”修饰，所述修饰包括Fc结构域的两个亚基中的一个中的“突起(knob，杵)”修饰和Fc结构域的两个亚基中的另一个中的“孔(hole，臼)”修饰。因此，在一个特定方面，本发明涉及如本文上文所述的双特异性抗原结合分子，其包含IgG分子，其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块并且第二重链的Fc部分包含允许IgG分子的两个重链异二聚化的第二二聚化模块，并且第一二聚化模块包含突起，并且第二二聚化模块包含根据杵臼结构技术的孔。

杵臼结构技术描述于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)中。通常，该方法涉及在第一多肽的界面处引入凸起(“突起”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“孔”)，使得所述凸起可以定位在所述空腔中，以便促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。凸起是通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建的。具有与凸起相同或相似大小的补偿空腔是通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链而在第二多肽的界面中创建的。

因此，在一个特定方面，在本文公开的双特异性抗原结合分子的Fc结构域的所述第一亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第一亚基的所述CH3结构域内产生突起，所述突起可定位在所述第二亚基的所述CH3结构域内的空腔中，并且在所述Fc结构域的所述第二亚基的所述CH3结构域中，氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在所述第二亚基的所述CH3结构域内产生空腔，所述第一亚基的所述CH3结构域内的所述突起可定位在所述空腔内。

凸起和空腔可以通过改变编码多肽的核酸来制备，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成。

在一个具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，位置366处的苏氨酸残基被色氨酸残基(T366W)替换，并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，位置407处的酪氨酸残基被缬氨酸残基(Y407V)替换。更具体地，在Fc结构域的第二亚基中，另外地位置366处的苏氨酸残基被丝氨酸残基(T366S)替换，并且位置368处的亮氨酸残基被丙氨酸残基(L368A)替换。更具体地，在Fc结构域的第一亚基中，另外地位置354处的丝氨酸残基被半胱氨酸残基(S354C)替换，并且在Fc结构域的第二亚基中，另外地位置349处的酪氨酸残基被半胱氨酸残基(Y349C)替换。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步稳定二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。

在另一方面，促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基缔合的修饰包括介导静电转向效应的修饰，例如如在PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，该方法涉及用带电荷的氨基酸残基取代两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基，使得同源二聚体形成变得在静电上不利，但异源二聚化在静电上有利。

降低Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域修饰

本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，该二聚体的每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定结构域。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定缔合。

Fc结构域为本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中的良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞，而不是优选的抗原携带细胞。因此，在另一个特定方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应子功能。在一个方面，Fc基本上不结合到Fc受体和/或不诱导效应子功能。在一个特定方面，Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，Fc受体是人Fc受体。在一个具体方面，Fc受体是活化的人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面，Fc结构域不诱导效应子功能。降低的效应子功能可以包括但不限于以下中的一个或多个：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、减少的细胞因子分泌、减少的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、减少的与NK细胞的结合、减少的与巨噬细胞的结合、减少的与单核细胞的结合、减少的与多形核细胞的结合、减少的直接信号传导诱导性细胞凋亡、降低的树突细胞成熟或减少的T细胞引发。

在某些方面，一个或多个氨基酸修饰可引入本文提供的双特异性抗原结合分子的Fc区中，从而生成Fc区变体。Fc区变体可包含人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)。

在一个特定方面，本发明提供了能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原，其包含

(a)能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段；

(b)Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，以及

(c)能够特异性结合到4-1BB的两个脂质运载蛋白突变蛋白，其中脂质运载蛋白突变蛋白中的一个与Fc结构域的第一亚基的C末端融合，并且另一个与Fc结构域的第二亚基的C末端融合，其中所述Fc结构域包含降低与Fc受体、特别是与Fcγ受体的结合的一个或多个氨基酸取代。

在一个方面，本发明的双特异性抗原结合分子的Fc结构域包含降低Fc结构域对Fc受体的结合亲和力和/或效应子功能的一个或多个氨基酸突变。典型地，相同的一个或多个氨基酸突变存在于Fc结构域的两个亚基中的每一个中。具体地，Fc结构域在E233、L234、L235、N297、P331和P329的位置(EU编号)处包含氨基酸取代。具体地，Fc结构域包含IgG重链的位置234和235(EU编号)和/或329(EU编号)处的氨基酸取代。更具体地，提供了根据本发明的包含三聚体TNF家族配体的抗原结合分子，其包含在IgG重链中具有氨基酸取代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号)的Fc结构域。氨基酸取代L234A和L235A是指所谓的LALA突变。氨基酸取代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，并在国际专利申请公开号WO 2012/130831A1中描述，所述专利申请还描述了制备此类突变体Fc结构域的方法和用于确定其特性(诸如Fc受体结合或效应子功能)的方法。“EU编号”是指根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD，1991的EU索引进行的编号。

在一个特定方面，包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基的Fc结构域包含：包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的第一亚基，和包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的第二亚基。

具有降低的Fc受体结合和/或效应子功能的Fc结构域还包括具有Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被取代为丙氨酸(美国专利号7,332,581)。

在另一方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。与IgG1抗体相比，IgG4抗体表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应子功能。在一个更具体的方面，Fc结构域是在位置S228处(Kabat编号)包含氨基酸取代、具体地是氨基酸取代S228P的IgG4 Fc结构域。在一个更具体的方面，Fc结构域是包含氨基酸取代L235E和S228P以及P329G(EU编号)的IgG4 Fc结构域。WO 2012/130831中还描述了此类IgG4 Fc结构域突变体及其Fcγ受体的结合特性。

可以使用本领域熟知的遗传或化学方法，通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变Fc结构域。遗传方法可包括对编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以例如通过测序来验证正确的核苷酸变化。

与Fc受体的结合可以例如通过ELISA或通过表面等离子体共振(SPR)使用标准仪器(诸如BIAcore仪器(GE Healthcare))容易地确定，并且Fc受体诸如可以通过重组表达获得。本文描述了合适的此类结合测定。可替代地，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。

Fc结构域的效应子功能，或本发明的包含Fc结构域的双特异性抗体，可以通过本领域已知的方法来测量。本文描述了用于测量ADCC的合适的测定法。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的其他示例描述于：美国专利号5,500,362；Hellstrom等人，ProcNatl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA82,1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。可替代地，可以使用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；以及CytoTox非放射性细胞毒性测定(威斯康星州，麦迪逊市，普洛麦格公司(Promega,Madison,WI))。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，可例如在诸如在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估目标分子的ADCC活性。

在一些实施例中，Fc结构域与补体组分，特别是C1q的结合减少。因此，在一些实施例中，其中Fc结构域经工程化以具有降低的效应子功能，所述降低的效应子功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化，可以执行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103,2738-2743(2004))。

特定双特异性抗原结合分子

在一个方面，本发明提供了一种能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子，其包含

(a)能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段，

(b)Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，以及

(c)两个能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白中的一个与Fc结构域的所述第一亚基的C末端融合，并且另一个与所述Fc结构域的所述第二亚基的C末端融合。

在一个方面，能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：

(a)重链可变区(V_HFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；以及轻链可变区(V_LFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；或者

(b)重链可变区(V_HFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列；以及轻链可变区(V_LFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。

在一个方面，能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：重链可变区(V_HFAP)，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；以及轻链可变区(V_LFAP)，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。

在一个方面，提供了能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段，其包含：

(a)重链可变区(V_HFAP)，其包含与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(V_LFAP)，其包含与SEQ IDNO:28的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者

(b)重链可变区(V_HFAP)，其包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(V_LFAP)，其包含与SEQ IDNO:36的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一个方面，提供了能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段，其包含：重链可变区(V_HFAP)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的氨基酸序列，以及轻链可变区(V_LFAP)，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列；或者重链可变区(V_HFAP)，其包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列，以及轻链可变区(V_LFAP)，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一个方面，能够特异性结合到成纤维细胞活化蛋白(FAP)的Fab片段包含：重链可变区(V_HFAP)，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的氨基酸序列；以及轻链可变区(V_LFAP)，其包含SEQ IDNO:28的氨基酸序列。

在一个方面，本文提供的双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO：37的第一重链、SEQ ID NO：38的第二重链和SEQ ID NO：39的轻链。

在另一方面，本发明提供了一种能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子，其包含

(a)能够特异性结合到HER2的Fab片段；

(b)Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，以及

(c)两个能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白中的一个与Fc结构域的所述第一亚基的C末端融合，并且另一个与所述Fc结构域的所述第二亚基的C末端融合。

在一个方面，能够特异性结合到HER2的Fab片段包含：

(a)VH结构域，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列；或者

(b)VH结构域，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；或者

(c)VH结构域，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列。

在一个方面，能够特异性结合到HER2的Fab片段包含：(a)VH结构域，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。在一个方面，能够特异性结合到HER2的Fab片段包含：VH结构域，其包含：(i)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，(ii)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列，和(iii)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列；以及VL结构域，其包含：(iv)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，(v)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，和(vi)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。

在一个方面，提供了能够特异性结合到HER2的Fab片段，其包含：

(a)重链可变区(V_HHER2)，其包含与SEQ ID NO:46的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(V_LHER2)，其包含与SEQID NO:47的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者

(b)重链可变区(V_HHER2)，其包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(V_LHER2)，其包含与SEQID NO:55的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；或者

(c)重链可变区(V_HHER2)，其包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；以及轻链可变区(V_LHER2)，其包含与SEQID NO:63的氨基酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一个方面，提供了能够特异性结合到HER2的Fab片段，其包含：重链可变区(V_HHER2)，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，以及轻链可变区(V_LHER2)，其包含SEQ IDNO:47的氨基酸序列；或者重链可变区(V_HHER2)，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，以及轻链可变区(V_LHER2)，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；或者重链可变区(V_HHER2)，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列，以及轻链可变区(V_LHER2)，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列。在一个方面，能够特异性结合到HER2的Fab片段包含：重链可变区(V_HHER2)，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，以及轻链可变区(V_LHER2)，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在一个方面，能够特异性结合到HER2的Fab片段包含：重链可变区(V_HHER2)，其包含SEQID NO:54的氨基酸序列，以及轻链可变区(V_LHER2)，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列。

在一个方面，本文提供的双特异性抗原结合分子包含SEQ ID NO：64的第一重链、SEQ ID NO：65的第二重链和SEQ ID NO：66的轻链。

多核苷酸

本发明进一步提供了编码如本文所述的双特异性抗原结合分子或其片段的分离的核酸。

编码本发明的双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表达为编码完整抗原结合分子的单个多核苷酸，或表达为共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以经由例如二硫键或其他手段缔合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链部分可以由来自免疫球蛋白的重链部分的单独多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽将与轻链多肽缔合以形成免疫球蛋白。

在一些方面，分离的核酸编码如本文所述的根据本发明的完整双特异性抗原结合分子。具体地，分离的多核苷酸编码包含在如本文所述的根据本发明的双特异性抗原结合分子中的多肽。

在一个方面，本发明涉及编码双特异性抗原结合分子的分离的核酸，其中所述核酸分子包含：(a)编码能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域的序列，(b)编码Fc结构域的序列，所述Fc结构域包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，以及(c)编码能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白的序列。

在另一方面，提供了编码双特异性抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码以下的序列：(a)能够特异性结合到靶细胞抗原的Fab片段；(b)Fc结构域，其包括能够稳定缔合的第一亚基和第二亚基，以及(c)两个能够特异性结合到4-1BB的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述脂质运载蛋白突变蛋白中的一个与Fc结构域的所述第一亚基的C末端融合，并且另一个与所述Fc结构域的所述第二亚基的C末端融合。

在某些方面，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施例中，本发明的多核苷酸是RNA，例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。

重组方法

本发明的双特异性抗原结合分子可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得。对于重组生产，将例如如上所述的编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的一种或多种多核苷酸分离并插入至一个或多个载体中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类多核苷酸可使用常规方法容易地分离并且测序。在本发明的一个方面，提供了一种载体，优选为表达载体，该载体包含本发明的多核苷酸中的一种或多种多核苷酸。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有双特异性抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如以下文献所述的技术：Maniatis等人，MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)中所述的技术，用配体试剂标记抗体，该配体试剂结合、螯合或以其他方式复合放射性同位素金属，其中该试剂与抗体的工程半胱氨酸硫醇反应。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括表达盒，编码双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件可操作缔合地克隆至所述表达盒中。如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，该部分由翻译成氨基酸的密码子组成。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，但其(如果存在的话)可被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如在单个载体上)，或在单独的多核苷酸构建体中(例如在单独的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，该一种或多种多肽在翻译后或翻译时通过蛋白水解切割分离成最终的蛋白质。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸或其变体或衍生物融合或不融合。异源编码区包括但不限于特化元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区以某种方式与一个或多个调控序列缔合，以使基因产物的表达处于调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰待转录的基因模板的能力，则该两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区域将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可以是细胞特异性启动子，该细胞特异性启动子仅在预定细胞中指导DNA的实质转录。除启动子外，其他转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，可以与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。

本文公开了合适的启动子和其他转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子结合内含子-A)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔珠蛋白)的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素可诱导启动子)。类似地，各种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括其他特征，诸如复制起点，和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)，或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)。

本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的附加编码区缔合，所述附加编码区指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果需要分泌双特异性抗原结合分子或其多肽片段，可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经起始跨粗面内质网输出生长的蛋白质链，该信号肽或分泌前导序列就被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与所述多肽的N末端融合的信号肽，所述信号肽被从翻译的多肽上切割下来以产生所述多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施例中，使用天然信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地缔合的多肽分泌的能力的该序列的功能性衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以被人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β葡糖醛酸酶的前导序列取代。

DNA编码可用于促进后续纯化的短蛋白序列(例如组氨酸标签)或帮助标记融合蛋白的DNA可包含在编码本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。

在本发明的另一方面，提供了包含一种或多种本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施例中，提供了包含一种或多种本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独或组合地渗入本文中分别关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如，已转化或转染)载体，该载体包含编码本发明的双特异性抗原结合分子(的一部分)的多核苷酸。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以被工程化改造以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域中熟知的。此类细胞可以用特定的表达载体适当地转染或转导，并且可以生长大量含有载体的细胞以用于接种大规模发酵罐来获得足够量的抗原结合分子用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物，诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，多肽可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化时。多肽在表达后可以在可溶性级分中从细菌细胞糊状物中分离，并可以进一步纯化。除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核微生物也是用于编码多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括这样的真菌和酵母菌株，该真菌和酵母菌株的糖基化途径已经被“人源化”，从而导致产生具有部分或完全人糖基化模式的多肽。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)和Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。

用于表达(糖基化)多肽的合适宿主细胞还来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定出了可以与昆虫细胞结合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)、布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)、TRI细胞(如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所述)、MRC 5细胞，以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。关于适用于蛋白质生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，请参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268页(2003)。宿主细胞包括培养细胞，例如仅举几个例子而言哺乳动物培养细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，还包括转基因动物、转基因植物或培养植物或动物组织中所包含的细胞。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。用于在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。可以对表达包含免疫球蛋白的重链或轻链的多肽的细胞进行工程化改造，以便也表达另一条免疫球蛋白链，使得表达的产物为具有重链和轻链的免疫球蛋白。

在一个方面，提供了一种生产本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的方法，其中所述方法包括在适于表达本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养包含编码如本文提供的本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段多核苷酸的宿主细胞，以及从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收本发明的双特异性抗原结合分子或其多肽片段。

在本发明的双特异性抗原结合分子中，组分(至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的部分、包含Fc结构域的亚基和脂质运载蛋白突变蛋白的多肽)彼此不遗传融合。多肽被设计成使得其组分直接或通过连接基序列彼此融合。连接基的组成和长度可以根据本领域熟知的方法测定，并且可以测试连接基的功效。本发明的抗原结合分子的不同组分之间的连接基序列的实例见于本文提供的序列中。如果需要的话，还可包括另外的序列(例如内肽酶识别序列)以掺入切割位点来分离融合蛋白的各个组分。

在某些实施例中，形成抗原结合分子的一部分的能够与靶细胞抗原特异性结合的抗原结合结构域(诸如Fab片段)包含至少一个能够结合到抗原的免疫球蛋白可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并源自它们。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane，"Antibodies,a laboratorymanual",Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如在美国专利号4,186,567中所述)，或者可以例如通过筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如McCafferty的美国专利号5,969,108)。

任何动物物种的免疫球蛋白均可以用于本发明。可用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、灵长类或人源的。如果融合蛋白旨在用于人类使用，则可以使用嵌合形式的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的恒定区来自人。也可以根据本领域熟知的方法来制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如Winter的美国专利号5,565,332)。人源化可通过各种方法实现，所述各种方法包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)架构和恒定区上，所述架构和恒定区有或没有保留关键架构残基(例如对于保持良好的抗原结合亲和力或抗体功能来说重要的关键架构残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对抗体-抗原相互作用至关重要的残基)移植到人架构和恒定区上，或者(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基而用人样区段“隐藏”它们。人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson，Front Biosci 13，1619-1633(2008)中综述，并且进一步描述于例如：Riechmann等人，Nature 332，323-329(1988)；Queen等人，ProcNatl Acad Sci USA 86，10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321、和7,087,409；Jones等人，Nature 321，522-525(1986)；Morrison等人，Proc NatlAcad Sci 81，6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv Immunol 44，65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239，1534-1536(1988)；Padlan，Molec Immun 31(3)，169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods 36，25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan，Mol Immunol28，489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36，43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36，61-68(2005)和Klimka等人，Br J Cancer83，252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。根据本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人可变区可以形成由杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并源自所述抗体(参见诸如Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过以下方式来制备人抗体和人可变区：将免疫原施用于转基因动物，所述转基因动物已被修饰以产生响应于抗原激发(challenge，挑战)的完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见诸如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005))。人抗体和人可变区也可以通过分离选自人源噬菌体展示库的Fv克隆可变区序列来产生(参见诸如Hoogenboom等人在Methods in Molecular Biology 178,1-37(O'Brien等人,编,Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等人，Nature 348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))中。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。

在某些方面，包含在本发明的抗原结合分子中的能够特异性结合到靶细胞抗原的抗原结合结构域(诸如Fab片段)被工程化改造以具有增强的结合亲和力，例如根据PCT公开WO 2012/020006中公开的方法(参见与亲和力成熟相关的实例)或美国专利申请公开号2004/0132066。本发明的抗原结合分子与特定抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术(诸如表面等离子体共振技术(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))以及传统的结合测定(Heeley,Endocr Res28,217-229(2002))来测量。竞争测定可以用于鉴定与参考抗体竞争结合到特定抗原的抗原结合分子。在某些实施例中，此类竞争抗原结合分子与由参考抗原结合分子结合的相同表位(例如，线性或构象表位)结合。用于对抗原结合分子所结合的表位作图的详细示例性方法提供于：Morris(1996)，“Epitope Mapping Protocols，出自Methods in MolecularBiology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。在示例性竞争测定中，将固定的抗原在包含与抗原结合的第一标记抗原结合分子和正在测试其与第一抗原结合分子竞争结合到抗原的能力的第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。所述第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的抗原在包含第一标记抗原结合分子但不包含第二未标记抗原结合分子的溶液中孵育。在容许第一抗体与抗原结合的条件下孵育之后，去除过量未结合的抗体，并且测量与固定的抗原缔合的标记的量。若与固定的抗原缔合的标记的量相对于对照样品在测试样品中基本上减少，则表明第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合到抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual第14章(ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

如本文所述制备的本发明的双特异性抗原结合分子可通过本领域已知的技术纯化，这些技术为诸如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员而言将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用双特异性抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明融合蛋白的亲和色谱纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。基本上如实例中所述，可使用顺序蛋白A或G亲和色谱和尺寸排阻色谱来分离抗原结合分子。双特异性抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中任一者来确定，所述熟知的分析方法包括凝胶电泳法、高压液相色谱法等。例如，实例中所述的表达的双特异性抗原结合分子被显示为得到完整并且适当组装，如还原和非还原SDS-PAGE所示。

测定

本文所提供的抗原结合分子的物理/化学性质和/或生物学活性可通过本领域中已知的各种测定法进行鉴定、筛选或表征。生物活性可以包括诸如增强不同免疫细胞特别是T细胞的活化和/或增殖的能力。例如它们增强免疫调节细胞因子的分泌。其他增强或可以增强的免疫调节细胞因子是诸如IL2、颗粒酶B等。生物活性还可以包括食蟹猴结合交叉反应性以及与不同细胞类型的结合。还提供了在体内和/或体外具有此类生物活性的抗原结合分子。

1.亲和力测定

本文提供的双特异性抗原结合分子对4-1BB(CD137)的亲和力可以使用诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)等的标准仪器和诸如可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，根据实例中阐述的方法通过表面等离子体共振(SPR)来确定。WO 2018/087108中还描述了用于确定对4-1BB的亲和力的特定条件。双特异性抗原结合分子对靶细胞抗原(诸如FAP或HER2)的亲和力也可以使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)以及诸如可通过重组表达获得的受体或靶蛋白，通过表面等离子体共振(SPR)来确定。用于测量结合亲和力的特定说明性和示例性实施例描述于实例1.2和2.2中。根据一个方面，在25℃下使用T100仪器(GE Healthcare)通过表面等离子体共振来测量K_D。

2.结合测定和其他测定

本文所提供的双特异性抗原结合分子与表达相应受体的细胞的结合可使用表达特定受体或靶抗原的细胞系例如通过流式细胞术(FACS)来评价。在一个方面，表达4-1BB的新鲜外周血单核细胞(PBMC)可以用于结合测定。这些细胞可在分离后(原初PMBC)或刺激后(活化PMBC)直接使用。在另一方面，活化的小鼠脾细胞(表达4-1BB)可以用于证明本发明的双特异性抗原结合分子与表达4-1BB的细胞的结合。

在进一步方面，使用表达FAP或HER2的细胞系证明抗原结合分子与此靶细胞抗原的结合。

在另一方面，可使用竞争测定法鉴定分别与特定抗体或抗原结合分子竞争结合到FAP、HER2或4-1BB的抗原结合分子。在某些方面，此类竞争抗原结合分子与由特定抗FAP抗体、抗HER2抗体或特定抗4-1BB抗体结合的相同表位(例如，线性或构象表位)结合。用于定位抗体与之结合的表位的详细示例性方法提供于：Morris(1996)，“Epitope MappingProtocols”，出自Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。

3.活性测定

在一个方面，提供了用于鉴定与FAP或HER2以及具有生物活性的4-1BB结合的双特异性抗原结合分子的测定方法。生物活性可以包括，诸如，通过4-1BB在表达FAP或HER2的癌细胞上的激动性信号传导。还提供了通过测定鉴定出的具有此类体外生物活性的双特异性抗原结合分子。

在某些方面，测试本发明的双特异性抗原结合分子的此类生物活性。用于检测本发明的分子的生物活性的测定是实例3.3和4.3中描述的那些。此外，用于检测细胞裂解(例如，通过测量LDH释放)、诱导的细胞凋亡动力学(例如，通过测量胱天蛋白酶3/7活性)或细胞凋亡(例如，使用TUNEL测定)的方法是本领域中熟知的。另外，可通过评价此类复合物对各种淋巴细胞亚群诸如NK细胞、NKT细胞或γδT细胞的存活、增殖和淋巴因子分泌的影响，或评估其调节抗原呈递细胞诸如树突细胞、单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力，对此类复合物的生物活性进行评估。

药物组合物、制剂和施用途径

在进一步方面，本发明提供了包含本文提供的双特异性抗原结合分子中任一者的药物组合物，其例如用于以下治疗方法中的任一者中。在一个实施例中，药物组合物包含本文所提供的双特异性抗原结合分子中的任何一者以及至少一种药用赋形剂。在另一实施例中，药物组合物包含本文提供的双特异性抗原结合分子中任一者以及如下文所述的至少一种附加治疗剂。

本发明的药物组合物包含溶于或分散于药用赋形剂中的治疗有效量的一种或多种双特异性抗原结合分子。术语“药学上或药理学上可接受的”是指分子实体和组合物在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，即当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。含有至少一种双特异性抗原结合分子和任选的附加活性成分的药物组合物的制备将是鉴于本公开而为本领域的技术人员已知的，如由Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990所示例的，该文献以引用方式并入本文。具体地，组合物为冻干制剂或水溶液。如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”包括任何和所有溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂及它们的组合，如对本领域的普通技术人员所知。

肠胃外组合物包括设计用于注射(例如，皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射)的那些组合物。为了注射，可在水溶液中配制本发明的双特异性抗原结合分子，优选在生理相容性缓冲剂诸如Hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水中配制。溶液可含有配制剂(formulatory agent)，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，融合蛋白可以是粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)构建。根据需要，通过将本发明的融合蛋白以所需的量与下面列举的各种其他成分一起掺入适当的溶剂中，来制备无菌可注射溶液。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基础分散介质和/或其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液、悬浮液或乳液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥或冻干技术，所述真空干燥或冻干技术产生来自先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何附加所需成分的粉末。如果需要的话，液体介质应适当缓冲，并且在注射之前应首先使用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂等渗。该组合物必须是在制造和贮存条件下稳定的，并且保存为抗诸如细菌和真菌等微生物的污染作用。应当理解，内毒素污染应以例如低于0.5ng/mg蛋白质的安全水平保持最低。合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有增加悬浮液粘度的化合物，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、葡聚糖等。任选地，悬浮液还可含有合适的稳定剂或增大化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度溶液。另外，活性化合物的悬浮液可以制备成适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂质体。

活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白、微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备缓释制备物。缓释制备物的合适示例包括含有多肽的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质是例如膜或微胶囊等成型制品的形式。在特定实施例中，可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)来实现。

本文的示例性药学上可接受的赋形剂还包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。除了先前描述的组合物之外，双特异性抗原结合分子也可以配制成长效制备物。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内植入)或通过肌内注射施用。因此，例如，融合蛋白可以用合适的聚合或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制成微溶衍生物(例如配制成微溶盐)。

包含本发明的双特异性抗原结合分子的药物组合物可通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干工艺进行生产。药物组合物可以使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于将蛋白质加工成可以在药学上使用的制备物。适当的配方取决于所选择的施用途径。

双特异性抗原结合分子可以配制成以游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本上保留游离酸或游离碱的生物活性的盐。这些药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如用蛋白质性质组合物的游离氨基形成的酸加成盐，或用无机酸(诸如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的酸加成盐。用游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或者有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比，药用盐倾向于更易溶于水性和其他质子溶剂中。

本文描述的组合物还可含有多于一种对于所治疗的特定适应症是必需的活性成分，优选是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。

待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。

治疗方法和组合物

本文提供的能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子中的任一种均可以用于治疗方法。

为了用于治疗方法中，本发明的双特异性抗原结合分子可按照符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。

在一个方面，提供了用作药物的能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子。在进一步方面，提供了用于治疗疾病、特别是用于治疗癌症或感染性疾病的本发明的双特异性抗原结合分子。在某些方面，提供了用于治疗方法中的本发明的双特异性抗原结合分子。在一个方面，本发明提供了一种如本文所述的双特异性抗原结合分子，其用于治疗有此需要的个体的疾病。在某些方面，本发明提供了一种用于治疗患有疾病的个体的方法中的双特异性抗原结合分子，该方法包括向个体施用治疗有效量的双特异性抗原结合分子。

在某些方面，待治疗的疾病是癌症。根据本发明的术语“癌症”还包括癌症转移。“转移”意指癌细胞从其原始部位到身体的另一部分的扩散。即使在去除原发肿瘤后，肿瘤转移也经常发生，因为肿瘤细胞或组分可能会保留并发展转移潜力。在一个方面，能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子用于治疗实体瘤。实体瘤的代表性实例包括结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、头颈癌和淋巴瘤。因此，提供了如本文所述的能够二价结合到4-1BB并单价结合到FAP的双特异性抗原结合分子，其用于治疗实体瘤。

在某些方面，待治疗的疾病是HER2阳性癌症。HER2阳性癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。因此，提供了如本文所述的能够二价结合到4-1BB并单价结合到HER2的双特异性抗原结合分子，其用于治疗这些癌症。需要治疗的受试者、患者或“个体”通常是哺乳动物，更特别地是人。

在另一方面，提供了如本文所述的双特异性抗原结合分子，其用于治疗感染性疾病，特别是用于治疗病毒感染。术语“感染性疾病”是指可以在个体与个体之间或在生物体与生物体之间传播并由微生物病原体引起的任何疾病。在进一步方面，提供了如本文所述的双特异性抗原结合分子，其用于治疗自身免疫疾病，例如狼疮病。在某些方面，待治疗的感染性疾病是慢性病毒感染，如HIV(人类免疫缺陷病毒)、HBV(乙型肝炎病毒)、HCV(丙型肝炎)、HSV1(单纯疱疹病毒1类)、CMV(巨细胞病毒)、LCMV(淋巴细胞性脑膜炎病毒)或EBV(爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein-Barr virus))。

在进一步方面，本发明涉及能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子用于生产或制备用于治疗有需要的个体的疾病的药物的用途。在一个方面，药物用于治疗疾病的方法中，该方法包括向具有所述疾病的个体施用治疗有效量的所述药物。在某些方面中，待治疗的疾病是增殖性疾患，特别是癌症。因此，在一个方面，本发明涉及本发明的双特异性结合分子在生产或制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一个方面，提供了本发明的双特异性结合分子在生产或制备用于治疗实体瘤的药物中的用途。在一个方面，提供了本发明的双特异性结合分子在生产或制备用于治疗HER2阳性癌症的药物中的用途。HER2阳性癌症的实例包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)。在某些方面，待治疗的癌症是HER2阳性乳腺癌，特别是HER2阳性转移性乳腺癌。本领域技术人员可认识到，在一些情况下，双特异性抗原结合分子可能无法提供治愈，而仅可以提供部分益处。在一些方面，具有某些益处的生理变化也被视为具有治疗益处。因此，在一些方面，提供生理变化的双特异性抗原结合分子的量被视为“有效量”或“治疗有效量”。

在某些方面，提供了本发明的双特异性结合分子在生产或制备用于治疗感染性疾病的药物中的用途。在一个方面，感染性疾病是慢性病毒感染，如HIV(人类免疫缺陷病毒)、HBV(乙型肝炎病毒)、HCV(丙型肝炎)、HSV1(单纯疱疹病毒1类)、CMV(巨细胞病毒)、LCMV(淋巴细胞性脑膜炎病毒)或EBV(爱泼斯坦巴尔病毒(Epstein-Barr virus))。

在进一步方面，本发明提供了一种治疗个体中的疾病的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子。在一个方面，向所述个体施用组合物，所述组合物包含药用形式的本发明的双特异性抗原结合分子。在某些方面，待治疗的疾病是增殖性疾患。在一个特定方面，疾病是癌症。在一个方面，待治疗的疾病是感染性疾病。在某些方面，如果待治疗的疾病是癌症，则所述方法还包括向所述个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如抗癌剂。在某些方面，所述方法包括进一步向个体施用治疗有效量的细胞毒性剂或另一种免疫疗法。根据上述实施例中的任一实施例的“个体”可以是哺乳动物，优选地是人。

为了预防或治疗疾病，本发明的双特异性抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂联合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、施用途径、患者体重、抗原结合分子的类型、疾病的严重程度和进程、双特异性抗原结合分子是出于预防还是治疗目的施用、先前或同时进行的治疗性干预、患者的临床病史和对融合蛋白的应答以及主治医师的酌处权。在任何情况下，负责施用的执业者将针对个体受试者来确定组合物中活性成分的浓度和适当剂量。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。双特异性抗原结合分子适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗原结合分子可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。双特异性抗原结合分子的一种示例性剂量的范围为约0.005mg/kg至约10mg/kg。在其他示例中，剂量还可包括每次施用约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导出的任何范围。在从本文所列数字可推导出的范围的示例中，可以基于上述数字施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等的范围。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约2至约20或例如约6个剂量的双特异性抗原结合分子)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。

本发明的双特异性抗原结合分子将通常以有效实现预期目的量使用。为用于治疗或预防病症，将本发明的双特异性抗原结合分子或其药物组合物以治疗有效量施用或施加。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的详细公开内容。对于全身施用，最初可以根据体外测定(诸如细胞培养测定)来估计治疗有效剂量。可以随后在动物模型中配制剂量，以实现包括如在细胞培养中测定的IC₅₀循环浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人类的有用剂量。还可以使用本领域熟知的技术来根据体内数据(例如动物模型)估计初始剂量。本领域的普通技术人员可以基于动物数据来容易地优化对人的施用。剂量和间隔可以单独地调节，以提供足以维持疗效的双特异性抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量的范围是约0.1至50mg/kg/天，通常约0.5至1mg/kg/天。通过每天施用多个剂量可以实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC来测量血浆中的水平。在局部施用或选择性摄入的情况下，双特异性抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域的技术人员将能够在无需过度实验的情况下优化治疗有效的局部剂量。

本文所述的治疗有效剂量的双特异性抗原结合分子通常将提供治疗益处而不会引起显著的毒性。双特异性抗原结合分子的毒性和治疗功效可通过细胞培养或实验动物中的标准药学程序来测定。细胞培养测定和动物研究可以用于测定LD₅₀(致死群体的50％的剂量)和ED₅₀(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，所述治疗指数可以表示为比率LD₅₀/ED₅₀。表现出大治疗指数的双特异性抗原结合分子是优选的。在一个方面，根据本发明的双特异性抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制适用于人类的一系列剂量。剂量优选在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED₅₀的循环浓度的范围内。剂量可以取决于多种因素而在该范围内变化，所述多种因素为例如所采用的剂型、所利用的施用途径、受试者的病症等。确切的配方、施用途径和剂量可以由个别医生根据患者的病症来选择(参见例如Fingl等人，1975，在：ThePharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中，该文献的全部内容以引用方式并入本文中)。用本发明的融合蛋白治疗的患者的主治医师将知道如何以及何时由于毒性、器官功能障碍等终止、中断或调节施用。相反地，如果临床应答不充分(排除毒性)，则主治医师也会知道将治疗调节到更高水平。在目标疾患的管理中施用的剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、施用途径等而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重性。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和应答而变化。

其他药剂和治疗

本发明的能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子可以在疗法中与一种或多种其他药剂组合施用。例如，本发明的双特异性抗原结合分子可以与至少一种另外的治疗剂共同施用。术语“治疗剂”包括可以施用用于治疗需要此类治疗的个体的症状或疾病的任何药剂。此类附加治疗剂可包含适合于所治疗的具体适应症的任何活性成分，优选地是具有不会彼此不利地影响的互补活性的活性成分。在某些方面，另外的治疗剂是另一种抗癌剂，诸如细胞毒性剂、化学治疗剂或抗血管生成剂。

在一个方面，本发明的能够二价结合到4-1BB并单价结合到靶细胞抗原的双特异性抗原结合分子可以与阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂组合施用。特别地，阻断PD-L1/PD-1相互作用的试剂为抗PD-L1抗体或抗PD1抗体。更特别地，阻断PD-L1/PD-1相互作用的药剂选自由以下项组成的组：阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗和纳武单抗。在一个具体方面，阻断PD-L1/PD-1相互作用的试剂为阿特珠单抗。

此类其他药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所用融合蛋白的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。双特异性抗原结合分子通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径，或本文所述剂量的约1％至99％，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的途径使用。

上述此类联合疗法涵盖联合施用(其中两种或更多种治疗剂被包含在同一组合物或分开的组合物中)，以及分开施用，在分开施用的情况下，本发明的双特异性抗原结合分子的施用可以在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。

制品

在本发明的另一方面中，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上述疾患的物质。该制品包括容器和在所述容器上或与所述容器相关的标签或包装插页(package insert)。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、静脉注射(IV)溶液袋等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。容器容纳组合物，该组合物单独或与另一种有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的组合物组合，并且容器可具有无菌入口(例如容器可以是静脉注射溶液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的双特异性抗原结合分子。

标签或包装插页指示该组合物用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括：(a)第一容器，所述第一容器具有容纳在其中的组合物，其中所述组合物包含本发明的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子；以及(b)第二容器，所述第二容器具有容纳在其中的组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。本发明的该实施例中的制品可进一步包含包装插页，该包装插页指示组合物可用于治疗特定病症。

可替代地或另外地，制品还可包括第二(或第三)容器，该二(或第三)容器包括药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。

表B(序列)：

关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息给出于：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中。根据如上文所定义的根据Kabat(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))的EU编号系统来对抗体链的氨基酸进行编号和引用。

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实例

以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施例。

重组DNA技术

使用标准方法来操纵DNA，如在Sambrook等人，Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根据制造商的说明来使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在以下参考文献中给出：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第五版，NIH Publication No 91-3242。

DNA测序

通过双链测序确定DNA序列。

基因合成

通过使用适当模板进行PCR生成所需的基因区段，或由Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成从合成寡核苷酸和PCR产物合成所需的基因区段。在确切的基因序列不可用的情况下，基于最接近的同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从来源于合适的组织的RNA中分离出基因。将侧接有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化出质粒DNA，并通过紫外光谱法确定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有合适限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到相应的表达载体中。所有构建体均设计有5’端DNA序列，该序列编码前导肽，该前导肽靶向真核细胞分泌的蛋白。

细胞培养技术

使用如在Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编辑)，John Wiley&Sons,Inc中所述的标准细胞培养技术。

蛋白纯化

参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简言之，将抗体施加至蛋白A琼脂糖柱(GE healthcare)并用PBS洗涤。在pH 2.8下实现抗体的洗脱，之后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200，GE Healthcare)在PBS中或在20mM组氨酸、150mMNaCl pH 6.0中将聚集的蛋白与单体抗体分离。将单体抗体级分合并，使用例如MILLIPOREAmicon Ultra(30 MWCO)离心浓缩器浓缩(若需要)，冷冻并储存在-20℃或-80℃下。提供样品的部分以例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱(SEC)或质谱法来进行后续的蛋白质分析和分析表征。

SDS-PAGE

根据制造商的说明使用预制凝胶系统(Invitrogen)。具体地，使用10％或4-12％Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和MES(还原凝胶，具有抗氧化剂电泳缓冲添加剂)或MOPS(非还原凝胶)电泳缓冲液。

分析尺寸排阻色谱法

通过HPLC色谱法执行用于测定抗体的聚集和寡聚状态的尺寸排阻色谱法(SEC)。简而言之，将蛋白A纯化的抗体施加至Agilent HPLC 1100系统上的300mM NaCl、50mMKH₂PO₄/K₂HPO₄，pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱，或施加至Dionex HPLC系统上的2×PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分来定量洗脱的蛋白。将BioRad凝胶过滤标准品151-1901用作标准品。

实例1

具有与4-1BB的二价结合和与FAP的单价/二价结合的双特异性抗体的制备、纯化和表征

1.1具有与4-1BB的二价结合和与FAP的单价或二价结合的双特异性抗体的产生

具有对4-1BB二价结合和与FAP单价或二价结合的双特异性激动性4-1BB抗体的制备方法如图1A和1B所示。FAP结合物(克隆4B9，如WO 2012/020006 A2中所述的产生和制备，其通过引用并入本文)和4-1BB结合物(anticalin，如WO 2016/177802中所述产生和制备)用于制备图1A和1B中描述的分子，其中TA1是FAP。根据国际专利申请公开号WO2012/130831A1中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入重链的Fc恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。

编码FAP(4B9)结合物的重链和轻链DNA序列的可变区与孔的恒定重链或人IgG1的恒定轻链在框内一起进行亚克隆。

如下克隆具有与FAP的二价结合的构建体：各自包含VH(FAP)-Fc(hu IgG1)-(G4S)3连接子-4-1BB结合脂质运载蛋白的两个重链和包含VL(FAP)-Cκ的两个轻链。双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA的氨基酸序列见于表1。

如下克隆具有与FAP的单价结合的构建体：包含VH(FAP)Fc突起(hu IgG1)-(G4S)3连接子4-1BB结合脂质运载蛋白的一个重链、一个重链Fc孔(hu IgG1)-(G4S)3连接子4-1BB结合脂质运载蛋白和包含VL(FAP)-Cκ的一个轻链。含有S354C/T366W突变的Fc突起重链和含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc孔重链和抗FAP轻链的组合允许产生异二聚体，其包括两个4-1BB结合脂质运载蛋白。双特异性单价2+1抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA的氨基酸序列见于表2。

表1:成熟双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PGLALA抗原结合分子的氨基酸序列

表2：成熟双特异性单价1+2抗FAP、抗4-1BB脂质运载蛋白huIgG1PGLALA抗原结合分子的氨基酸序列

双特异性抗体是通过瞬时转染HEK293 EBNA细胞产生的。将细胞离心并用预热的CD CHO培养基替换培养基。将表达载体在CD CHO培养基中混合，加入PEI，将溶液涡旋混合，并且在室温下孵育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，将其转移至摇瓶中，并且置于培养箱中，在5％CO₂的气氛下于37℃下孵育3小时。孵育后，加入具有补充剂的Excell培养基。转染一天后加入12％Feed。7天后收获细胞上清液，并通过标准方法纯化。对于a)和b)构建体，分别以1:1或1:1:1的比率用相应的表达载体转染细胞。

参照标准方案从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简而言之，通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化含有Fc的蛋白质。在pH 3.0下实现洗脱，然后立即中和样品。浓缩蛋白质，并通过尺寸排阻色谱法在20mM组氨酸、140mM氯化钠(pH 6.0)中将聚集蛋白质与单体蛋白质分离。

通过使用根据Pace等人，Protein Science,1995,4,2411-1423的基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数测量280nm处的光密度(OD)，来确定纯化的构建体的蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂的情况下，使用LabChipGXII，通过CE-SDS分析蛋白质的纯度和分子量。聚集体含量的测定如下进行：通过HPLC色谱法，使用分析型尺寸排阻色谱柱(TSKgel G3000SW XL)，并且在运行缓冲液(25mM K₂HPO₄,125mM NaCl,200mM L-精氨酸单氢氯化物(pH6.7))中平衡，在25℃下。

表3总结了双特异性FAP(4B9)靶向4-1BB结合抗原结合分子的产量和最终单体含量。

表3:双特异性4-1BB结合抗原结合分子的生化分析

为了比较，还产生了包含SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的氨基酸序列的2+2FAP(4B9)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG4 SP分子，和包含SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72的非靶向2+2DP47 x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG4 SP对照分子。

1.2通过表面等离子体共振进行的具有与4-1BB的二价结合和与FAP的单价或二价 结合的双特异性和三特异性的抗体的功能表征

通过表面等离子体共振(SPR)评估同时结合人4-1BB Fc(kih)和人FAP的能力。所有SPR实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。将生物素化的人4-1BB Fc(kih)直接偶联至链霉亲和素(SA)传感器芯片的流通池。所用的固定化水平最高达500共振单位(RU)。

使双特异性FAP靶向抗4-1BB脂质运载蛋白在200nM的浓度范围下以30μL/分钟的流速历经90秒通过流通池，并且将解离设置为0秒。将人FAP作为第二分析物在500nM的浓度下以30μL/分钟的流速历经90秒注射通过流通池(图2A)。监测解离120秒。通过扣除在蛋白质未固定化的参比流通池中获得的应答，校正本体折射率差异。

如在图2B和2C的图中可以看出，双特异性FAP靶向抗4-1BB脂质运载蛋白两者可以同时结合人4-1BB和人FAP。

实例2

具有与4-1BB的二价结合和与HER2的单价/二价结合的双特异性抗体的制备、纯化和表征

2.1具有与4-1BB的二价结合和与HER2的单价或二价结合的双特异性抗体的产生

具有对4-1BB二价结合和与HER2单价或二价结合的双特异性激动性4-1BB抗体的制备方法如图1A和1B所示。HER2结合物(对应于曲妥珠单抗)和4-1BB结合物(脂质运载蛋白，产生和制备如WO 2016/177802中所述)用于制备图1A和1B中描述的分子，其中TA1是HER2。根据国际专利申请公开号WO2012/130831A1中所述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入重链的Fc恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。

编码FAP(4B9)结合物的重链和轻链DNA序列的可变区与孔的恒定重链或人IgG1的恒定轻链在框内一起进行亚克隆。

如下克隆具有与FAP的二价结合的构建体：各自包含VH(HER2)-Fc(hu IgG1)-(G4S)3连接子-4-1BB结合脂质运载蛋白的两个重链和包含VL(HER2)-Cκ的两个轻链。双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA的氨基酸序列见于表4。

如下克隆具有与FAP的单价结合的构建体：包含VH(HER2)Fc突起(hu IgG1)-(G4S)3连接子4-1BB结合脂质运载蛋白的一个重链、一个重链Fc孔(hu IgG1)-(G4S)3连接子4-1BB结合脂质运载蛋白和包含VL(HER2)-Cκ的一个轻链。含有S354C/T366W突变的Fc突起重链和含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc孔重链和抗HER2轻链的组合允许产生异二聚体，其包括两个4-1BB结合脂质运载蛋白。双特异性单价2+1抗HER2、抗4-1BB huIgG1PGLALA的氨基酸序列见于表5。

表4：成熟双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB脂质运载蛋白huIgG1PGLALA抗原结合分子的氨基酸序列

表5：成熟双特异性单价1+2抗HER2、抗4-1BB脂质运载蛋白huIgG1PGLALA抗原结合分子的氨基酸序列

按照实例1所述生产并且纯化双特异性抗体。

表6总结了双特异性HER2靶向4-1BB结合抗原结合分子的产量和最终单体含量。

表6：双特异性4-1BB结合抗原结合分子的生化分析

为了比较，还制备了先前描述的包含SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74的氨基酸序列的融合多肽2+2HER2(TRAS)-anticalin-4-1BB人IgG4 SP(WO2016/177802)。

2.2通过表面等离子体共振进行的具有与4-1BB的二价结合和与HER2的单价或二 价结合的双特异性和三特异性的抗体的功能表征

通过表面等离子体共振(SPR)评估同时结合人4-1BB Fc(kih)和人HER2的能力。所有SPR实验均采用Biacore T200，在25℃下使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore，Freiburg/Germany)。将生物素化的人4-1BB Fc(kih)直接偶联至链霉亲和素(SA)传感器芯片的流通池。所用的固定化水平最高达500共振单位(RU)。

使双特异性HER2靶向抗4-1BB脂质运载蛋白在200nM的浓度下以30μL/分钟的流速历经90秒通过流通池，并且将解离设置为0秒。将人FAP作为第二分析物在500nM的浓度下以30μL/分钟的流速历经90秒注射通过流通池(图3A)。监测解离120秒。通过扣除在蛋白质未固定化的参比流通池中获得的应答，校正本体折射率差异。

如在图3B的图中可以看出，双特异性HER2靶向抗4-1BB脂质运载蛋白两者均可以同时结合人4-1BB和人HER2。

实例3

FAP靶向4-1BB脂质运载蛋白抗原结合分子的功能表征

3.1与表达人FAP的细胞系的结合

为了与细胞表面表达的人成纤维细胞活化蛋白(FAP)的结合，使用NIH/3T3-huFAP克隆19细胞。通过在CMV启动子存在下用编码人FAP的表达pETR4921质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)，形成NIH/3T3-huFAP克隆19。将细胞维持在补充有胎牛血清(FBS，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号16000-044，批号941273，经γ射线照射，无支原体，热灭活)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Glutqa-MAX-I，由LifeTechnologies提供的GIBCO，目录号35050-038)和1.5μg/mL嘌呤霉素(InvivoGen，目录号ant-pr-5)的DMEM(由Life Technologies提供的GIBCO，目录号42340-025)中。在结合测定中，将2×10⁵的NIH/3T3-huFAP克隆19细胞加入圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one，cellstar，目录号650185)的各个孔中。将细胞用200μL DPBS洗涤一次，然后将沉淀重悬于100μL/孔的4℃的冷DPBS缓冲液(包含1:5000稀释的可固定活性染料eFluor 450(eBioscience，目录号65 0863 18))中。将孔板在4℃下孵育30分钟，然后用200μL 4℃的冷DPBS缓冲液洗涤一次。然后将细胞重新悬浮在50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液中，所述缓冲液含有不同滴定浓度(起始浓度300nM，以1:6稀释，分八个稀释步骤)的双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为2+2)，或双特异性单价1+2抗FAP、抗4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为1+2)，或对照分子，然后在4℃下在黑暗中孵育1小时。用200μL DPBS/孔洗涤四次后，在4℃下用50μL/孔的4℃的冷FACS缓冲液将细胞染色30分钟，所述缓冲液含有2.5μg/mL PE-缀合AffiniPure抗人IgG Fc片段特异性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)。将细胞用200μL4℃的DPBS缓冲液洗涤两次，然后重悬于50μL/孔的含1％甲醛的DPBS中进行固定。将同一天或第二天的细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并且使用MACSQuant Analyzer 10(MiltenyiBiotec)或Canto II(BD)进行采集。使用FlowJo 10.4.2(FlowJo LLC)、Microsoft OfficeExcel Professional 2010(Microsoft Software Inc.)和GraphPad Prism(GraphPadSoftware Inc.)分析数据。

如图4所示，双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA(称为FAP(4B9)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA 2+2)以与FAP(4B9)huIgG1 PG LALA类似的亲和力结合，因为两种分子都与FAP二价结合。因此，4-1BB结合脂质运载蛋白的C末端融合不会影响与FAP的结合。双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB huIgG4 SP分子(FAP(4B9)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG4 SP 2+2)显示出比其他FAP二价结合分子更低的gMFI。这可以通过Fc片段的不同同种型来解释。由于我们使用多克隆抗人Fc片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段，Fc部分中的表位可能不同，导致第二检测片段结合更少，并且gMFI更低。双特异性单价1+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PG LALA分子(FAP(4B9)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA 1+2，实心黑色三角形和线)显示出比双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA(称为FAP(4B9)x4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA 2+2)更高的gMFI。这可以通过它与FAP的单价结合来解释，导致在细胞表面上的更高占有率，因为一个分子只占有一个FAP单体而不是两个。由于FAP(4B9)显示出非常高的亲和力，因此在此结合测定中无法检测到亲和力的丧失(例如EC₅₀值的增加)。单个结合曲线的EC₅₀值和曲线下面积(AUC)分别列于表7和表8中。

表7：与表达FAP的细胞系NIH/3T3-huFAP克隆19的结合曲线的EC₅₀值如图4所示

表8：与表达FAP的细胞系NIH/3T3-huFAP克隆19的结合曲线的曲线下面积(AUC)值如图4所示

3.2与表达人4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的结合

为了与细胞表面表达的人4-1BB(CD137)的结合，使用Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系(Promega,Germany)。将细胞作为悬浮细胞维持在RPMI 1640培养基(由LifeTechnologies提供的GIBCO，目录号42401-042)中，其补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号16000-044，批号941273，经γ射线照射，无支原体，热灭活)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(Glutqa-MAX-I，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号35050-038)、1mM丙酮酸钠(SIGMA-Aldrich，目录号S8636)和1％(v/v)MEM-非必需氨基酸溶液100x(SIGMA-Aldrich，目录号M7145)、600μg/ml G-418(Roche，目录号04727894001)、400μg/ml潮霉素B(Roche，目录号10843555001)和25mM HEPES(Sigma LifeSience，目录号H0887-100mL)。在结合测定中，将2×10⁵的Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2加入圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one，cellstar，目录号650185)的各个孔中。将细胞用200μL DPBS洗涤一次，然后将沉淀重悬于100μL/孔的4℃的冷DPBS缓冲液(包含1:5000稀释的可固定活性染料eFluor 450(eBioscience，目录号65 0863 18))中。将孔板在4℃下孵育30分钟，然后用200μL 4℃的冷DPBS缓冲液洗涤一次。然后将细胞重新悬浮在50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液中，所述缓冲液含有不同滴定浓度(起始浓度300nM，以1:6稀释，分八个稀释步骤)的双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA(称为2+2)，或双特异性单价1+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA(称为1+2)，或对照分子，然后在4℃下在黑暗中孵育1小时。用200μL DPBS/孔洗涤四次后，在4℃下用50μL/孔的4℃的冷FACS缓冲液将细胞染色30分钟，所述缓冲液含有2.5μg/mL PE-缀合AffiniPure抗人IgG Fc片段特异性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)。将细胞用200μL 4℃的FACS缓冲液洗涤两次，然后重悬于50μL/孔的含1％甲醛的DPBS中进行固定。将同一天或第二天的细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并且使用MACSQuant Analyzer 10(Miltenyi Biotec)或CantoII(BD)进行采集。使用FlowJo 10.4.2(FlowJo LLC)、Microsoft Office ExcelProfessional 2010(Microsoft Software Inc.)和GraphPad Prism(GraphPad SoftwareInc.)分析数据。

如图5所示，所有抗4-1BB脂质运载蛋白双特异性分子以类似的亲和力结合到人4-1BB表达转基因人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2。与在结合到人4-1BB期间结合到表达FAP的细胞(图4)不同，我们没有看到含有Fc-huIgG1 PG LALA或Fc-huIgG4SP的分子之间的结合(gMFI)的差异。与FAP相比，这可涉及更低表达水平的4-1BB，并因此gMFI值远远更低，诸如此测定不够灵敏以至于无法检测差异。结合曲线的EC₅₀值和AUC分别列于表9和表10中。

表9：图5所示的与细胞表达的人4-1BB的结合曲线的EC₅₀值的总结

表10：与细胞表达的人4-1BB的结合曲线的曲线下面积(AUC)值的总结如图5所示

3.3在表达人4-1BB和NFκB-荧光素酶报告基因的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκ B-luc2中的NF-κB活化

4-1BB(CD137)受体与其配体(4-1BBL)的激动性结合通过活化核因子kappa B(NFkB)诱导4-1BB下游信号传导，并且促进CD8 T细胞的存活和活性(Lee HW,Park SJ,ChoiBK,Kim HH,Nam KO,Kwon BS.4-1BB promotes the survival of CD8(+)T lymphocytesby increasing expression of Bcl-x(L)and Bfl-1.J Immunol 2002；169:4882-4888)。为了监测由双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA分子(称为2+2)、或双特异性单价1+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA分子(称为1+2)介导的这种NFκB活化，从Promega(德国)购买Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系。细胞培养方法如上文所述(与表达人4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2的结合)。在测定中，收获细胞并将其重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的测定培养基RPMI 1640培养基中。将10μl含有2×10³Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的报告细胞转移至带顶盖的无菌白色384孔平底组织培养板(Corning，目录号3826)的各个孔中。加入10μL的测定培养基，其含有滴定浓度的双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA(称为2+2)，或双特异性单价1+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA(称为1+2)或对照分子。最后，提供10μL单独的测定培养基或包含1×10⁴表达FAP的细胞(人黑素瘤细胞系WM-266-4(ATCC CRL-1676)或NIH/3T3-huFAP克隆19(如上文所述)的测定培养基，并且将板置于细胞培养箱中在37℃和5％CO₂下孵育6小时。向各个孔中加入6μl新鲜解冻的One-Glo荧光素酶测定检测溶液(Promega，目录号E6110)，并且使用Tecan酶标仪(积分时间为500ms，无滤光片，采集所有波长的信号)立即测量发光强度。使用Microsoft Office Excel Professional 2010(Microsoft Software Inc.)和GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.)分析数据。

如图6A所示，在不存在表达FAP的细胞的情况下，没有分子能够诱导urkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系中强烈的人4-1BB受体活化，从而导致NFκB活化和因此的荧光素酶表达。在存在表达FAP的细胞(如WM-266-4)的情况下(图6B，人黑素瘤细胞系，中间体FAP表达)或NIH/3T3-huFAP克隆19(图6C，人FAP转基因小鼠成纤维细胞系)，双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为FAP(4B9)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1PG LALA 2+2，空心向下黑色三角形和虚线)、或双特异性单价1+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1PGLALA抗原结合分子(称为FAP(4B9)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA1+2，实心黑色三角形和线)或双特异性对照分子、双特异性二价2+2抗FAP、抗4-1BB huIgG4 PGLALA抗原结合分子(称为FAP(4B9)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG4 SP 2+2，半实心黑色六聚体和虚线)的交联导致Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系中NFκB活化的荧光素酶活性强烈增加。通过活化曲线的最高曲线下面积(AUC)，双特异性单价1+2抗FAP、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为FAP(4B9)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA 1+2，实心黑色三角形和线)表现最佳。肿瘤靶标结合侧与效应细胞靶标结合的1:2的更低比率，诸如FAP结合部分与4-1BB结合部分的1:2比率似乎导致更高的占据密度，因此导致4-1BB激动剂在效应细胞上的密集交联，并最终导致更强的4-1BB受体下游信号传导。活化曲线的EC₅₀值和曲线下面积(AUC)分别列于表11和表12中。

表11：图6B和6C中所示的活化曲线的EC₅₀值

表12：如图6B和6C所示的活化曲线的曲线下面积(AUC)值的总结

实例4

HER2靶向4-1BB脂质运载蛋白抗原结合分子的功能表征

4.1与表达人HER2的细胞系的结合

为了结合到细胞表面表达的HER2，使用了人胃癌细胞系NCI-N87(ATCC CRL-5822)和人乳腺癌细胞系KPL4(川崎医学院(Kawasaki Medical School))。NCI-N87细胞作为贴壁细胞在RPMI 1640培养基(Life Technologies的GIBCO，目录号42401-042)中培养，所述培养基提供有10％(v/v)FBS(Life Technologies的GIBCO，目录号16000-044，批号941273，无γ辐照支原体，56℃加热灭活35min)和2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(GlutaMAX-I，GIBCO，Invitrogen，目录号35050-038)。KPL4细胞作为贴壁细胞在DMEM培养基(LifeTechnologies的GIBCO，目录号42430082)中培养，所述培养基提供有10％(v/v)FBS和2mML-丙氨酰-L-谷氨酰胺。在结合测定中，将2×10⁵个的NCI-N87和KPL4加入圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one，cellstar，目录号650185)的各个孔中。将细胞用200μL DPBS洗涤一次，然后将沉淀重悬于100μL/孔的4℃的冷DPBS缓冲液(包含1:5000稀释的可固定活性染料eFluor 450(eBioscience，目录号65 0863 18))中。将孔板在4℃下孵育30分钟，然后用200μL 4℃的冷DPBS缓冲液洗涤一次。然后将细胞重新悬浮在50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液中，所述缓冲液含有不同滴定浓度(起始浓度300nM，以1:6稀释，分八个稀释步骤)的双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为2+2)，或双特异性单价1+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为1+2)，或对照分子，然后在4℃下在黑暗中孵育1小时。用200μL DPBS/孔洗涤四次后，在4℃下用50μL/孔的4℃的冷FACS缓冲液将细胞染色30分钟，所述缓冲液含有2.5μg/mL PE-缀合AffiniPure抗人IgG Fc片段特异性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)。将细胞用200μL 4℃的DPBS缓冲液洗涤两次，然后重悬于50μL/孔的含1％甲醛的DPBS中进行固定。将同一天或第二天的细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并且使用MACSQuant Analyzer 10(MiltenyiBiotec)或CantoII(BD)进行采集。使用FlowJo 10.4.2(FlowJo LLC)、Microsoft OfficeExcel Professional 2010(Microsoft Software Inc.)和GraphPad Prism(GraphPadSoftware Inc.)分析数据。

如图7A和7B所示，双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为HER2(TRAS)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA 2+2)以与HER2(TRAS)huIgG1PG LALA类似的亲和力结合，因为两种分子都与HER2二价结合。因此，4-1BB结合脂质运载蛋白的C末端融合不会影响与HER2的结合。双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB huIgG4 SP分子(HER2(TRAS)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG4 SP 2+2)显示出比其他HER2二价结合分子更低的MFI。这可以通过Fc片段的不同同种型来解释。由于我们使用多克隆抗人Fc片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段，Fc部分中的表位可能不同，导致第二检测片段结合更少，并且gMFI更低。双特异性单价1+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PG LALA分子(HER2(TRAS)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA 1+2，实心黑色三角形和线)显示出比双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1PGLALA抗原结合分子(称为HER2(TRAS)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA2+2)更高的gMFI。这可以通过它与HER2的单价结合来解释，导致在细胞表面上的更高占有率，因为一个分子只占有一个HER2而不是两个。单个结合曲线的EC₅₀值和曲线下面积(AUC)分别列于表13和表14中。

表13：与表达HER2的细胞系NCI-N87和KPL4的结合曲线的EC₅₀值如图7A和7B所示

表14：与表达HER2的细胞系NCI-N87和KPL4的结合曲线的曲线下面积(AUC)值如图7A和7B所示

4.2与表达人4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的结合

为了与细胞表面表达的人4-1BB(CD137)的结合，使用Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系(Promega,Germany)。将细胞作为悬浮细胞维持在RPMI 1640培养基(由LifeTechnologies提供的GIBCO，目录号42401-042)中，所述培养基补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号16000-044，批号941273，经γ射线照射，无支原体，热灭活)、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽(GlutaMAX-I，由Life Technologies提供的GIBCO，目录号35050-038)、1mM丙酮酸钠(SIGMA-Aldrich，目录号S8636)和1％(v/v)MEM-非必需氨基酸溶液100x(SIGMA-Aldrich，目录号M7145)、600μg/ml G-418(Roche，目录号04727894001)、400μg/ml潮霉素B(Roche，目录号10843555001)和25mM HEPES(SigmaLife Sience，目录号H0887-100 mL)。在结合测定中，将2×10⁵的Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2加入圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one，cellstar，目录号650185)的各个孔中。将细胞用200μL DPBS洗涤一次，然后将沉淀重悬于100μL/孔的4℃的冷DPBS缓冲液(包含1:5000稀释的可固定活性染料eFluor 450(eBioscience，目录号65 0863 18))中。将孔板在4℃下孵育30分钟，然后用200μL 4℃的冷DPBS缓冲液洗涤一次。然后将细胞重新悬浮在50μL/孔的4℃冷FACS缓冲液中，所述缓冲液含有不同滴定浓度(起始浓度300nM，以1:6稀释，分八个稀释步骤)的双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为2+2)，或双特异性单价1+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为1+2)，或对照分子，然后在4℃下在黑暗中孵育1小时。用200μL DPBS/孔洗涤四次后，在4℃下用50μL/孔的4℃的冷FACS缓冲液将细胞染色30分钟，所述缓冲液含有2.5μg/mL PE-缀合AffiniPure抗人IgG Fc片段特异性山羊F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-098)。将细胞用200μL 4℃的FACS缓冲液洗涤两次，然后重悬于50μL/孔的含1％甲醛的DPBS中进行固定。将同一天或第二天的细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并且使用MACSQuantAnalyzer 10(Miltenyi Biotec)或CantoII(BD)进行采集。使用FlowJo 10.4.2(FlowJoLLC)、Microsoft Office Excel Professional 2010(Microsoft Software Inc.)和GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.)分析数据。

如图8所示，所有抗4-1BB脂质运载蛋白双特异性分子以类似的亲和力结合到人4-1BB表达转基因人T细胞淋巴瘤细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2。与在结合到人4-1BB期间结合到表达HER2的细胞(图7A和7B)不同，我们没有看到含有Fc-huIgG1 PG LALA或Fc-huIgG4 SP的分子之间的结合(gMFI)的差异。与HER2相比，这可能涉及更低表达水平的4-1BB，并因此gMFI值远远更低，诸如此测定不够灵敏以至于无法检测差异。结合曲线的EC₅₀值和AUC分别列于表15和表16中。

表15：图8所示的与细胞表达的人4-1BB的结合曲线的EC₅₀值的总结

表16：与表达HER2的细胞系NCI-N87和KPL4的结合曲线的曲线下面积(AUC)值如图8所示

4.3在表达人4-1BB和NFκB-荧光素酶报告基因的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFκ B-luc2中的NF-κB活化

4-1BB(CD137)受体与其配体(4-1BBL)的激动性结合通过活化核因子kappa B(NFkB)诱导4-1BB下游信号传导，并且促进CD8 T细胞的存活和活性(Lee HW,Park SJ,ChoiBK,Kim HH,Nam KO,Kwon BS.4-1BB promotes the survival of CD8(+)T lymphocytesby increasing expression of Bcl-x(L)and Bfl-1.J Immunol 2002；169:4882-4888)。为了监测由双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原分子(称为2+2)、或双特异性单价1+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为1+2)介导的这种NFκB活化，从Promega(德国)购买Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2报告细胞系。细胞培养方法如上文所述(与表达人4-1BB的报告细胞系Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2的结合)。在测定中，收获细胞并将其重悬于补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I的测定培养基RPMI 1640培养基中。将10μl含有2×10³Jurkat-hu4-1BB-NFκB-luc2的报告细胞转移至带顶盖的无菌白色384孔平底组织培养板(Corning，目录号3826)的各个孔中。加入10μL的测定培养基，其含有滴定浓度的双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为2+2)，或双特异性单价1+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为1+2)或对照分子。最后，提供10μL的单独的测定培养基、或包含1×10⁴个表达HER2的细胞KPL4、NCI-N87(如上文所述)或SK-Br3(人乳腺癌，ATCC HTB-30)的测定培养基，并且将板置于细胞培养箱中在37℃和5％CO₂下孵育6小时。向各个孔中加入6μl新鲜解冻的One-Glo荧光素酶测定检测溶液(Promega，目录号E6110)，并且使用Tecan酶标仪(积分时间为500ms，无滤光片，采集所有波长的信号)立即测量发光强度。

如图9A至9D所示，在不存在表达HER2的细胞的情况下(图9A)，没有分子能够诱导Jurkat-hu4-1BB-NFkB-luc2报告细胞系中强烈的人4-1BB受体活化，从而导致NFkB活化和因此的荧光素酶表达。在存在表达HER2的细胞(如SK-Br3(图9B)、KPL4(图9C)和NCI-N87(图9D))的情况下，双特异性单价2+1抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为HER2(TRAS)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA 2+1，实心黑色三角形和实线)的交联显示出良好的活化曲线，其高度和/或EC₅₀值与交联细胞的HER2表达强度相关。双特异性二价2+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA抗原结合分子(称为HER2(TRAS)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA 2+2，实心黑色三角形和线)，及其对照分子HER2(TRAS)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG4 SP(半实心黑色六聚体和虚线)均与HER2二价结合，并诱导相似的活化曲线，由此两种分子的活化远低于HER2(TRAS)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1PG LALA 2+1(黑色实心三角形和线)的活化曲线。通过活化曲线的最高曲线下面积(AUC)，双特异性单价1+2抗HER2、抗4-1BB huIgG1 PGLALA(称为HER2(TRAS)x 4-1BB脂质运载蛋白huIgG1 PG LALA 1+2，实心黑色三角形和线)表现最佳。我们相信，肿瘤靶标结合侧与效应细胞靶标结合的1:2的更低比率，诸如HER2结合部分与4-1BB结合部分的1:2的比率导致肿瘤细胞上更高的占据密度，因此导致4-1BB激动剂在效应细胞上的密集交联，并最终导致更强的4-1BB受体下游信号传导。活化曲线的EC₅₀值和曲线下面积(AUC)分别列于表17和表18中。

表17：如图9B、9C和9D所示的活化曲线的EC₅₀值的总结

表18：如图9B、9C和9D所示的活化曲线的曲线下面积(AUC)值

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司

<120> 包含脂质运载蛋白突变蛋白的双特异性抗原结合分子

<130> P35474-WO

<150> EP19169022.1

<151> 2019-04-12

<160> 129

<170> PatentIn 3.5 版

<210> 1

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<212> PRT

<213> 智人

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<213> 人工序列

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<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 51

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<210> 16

<211> 178

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<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 52

<400> 16

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Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

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Asp Gly

<210> 17

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 53

<400> 17

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Arg Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Val Asp Lys Asp Pro

35 40 45

His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile

65 70 75 80

Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe

85 90 95

Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Tyr Phe Lys Ser Val Ile Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 18

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 54

<400> 18

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Asn

65 70 75 80

Trp Pro Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Phe

85 90 95

Ile Lys Ser Asp Leu Gly Pro Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 19

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 55

<400> 19

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

35 40 45

His Lys Met Gly Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Asn Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Asp Val Met Phe Leu Asp Lys Lys Cys Gln Tyr Ile Ile

65 70 75 80

Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe

85 90 95

Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 20

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 56

<400> 20

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

1 5 10 15

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr

20 25 30

Val Val Gly Met Ala Gly Asn Asn Leu Leu Arg Asp Asp Lys Asp Pro

35 40 45

His Lys Met Ser Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

50 55 60

Asn Val Thr Asp Val Met Leu Leu Asp Lys Lys Cys His Tyr Ile Ile

65 70 75 80

Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Thr Leu Gly Phe

85 90 95

Ile Lys Ser Asp Pro Gly His Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser

100 105 110

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Ser Val Ile Gln

115 120 125

Asn Arg Glu Trp Phe Gly Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

130 135 140

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

145 150 155 160

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

165 170 175

Asp Gly

<210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-H1

<400> 21

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-H2

<400> 22

Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-H3

<400> 23

Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr

1 5

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-L1

<400> 24

Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-L2

<400> 25

Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr

1 5

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-L3

<400> 26

Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr

1 5

<210> 27

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) VH

<400> 27

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) VL

<400> 28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1) CDR-H1

<400> 29

Ser His Ala Met Ser

1 5

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1) CDR-H2

<400> 30

Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1) CDR-H3

<400> 31

Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr

1 5

<210> 32

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1) CDR-L1

<400> 32

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1) CDR-L2

<400> 33

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1) CDR-L3

<400> 34

Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr

1 5

<210> 35

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) VH

<400> 35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) VL

<400> 36

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc 孔 huIgG1 PGLALA - 4-1BB 脂质运载蛋白重链

<400> 37

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys

245 250 255

Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp

260 265 270

Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp

275 280 285

Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser

290 295 300

Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp

305 310 315 320

Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly

325 330 335

Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val

340 345 350

Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe

355 360 365

Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu

370 375 380

Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu

385 390 395 400

Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys

405 410 415

Ile Asp Gly

<210> 38

<211> 639

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH (FAP 4B9) Fc 突起 huIgG1 PGLALA 4-1BB 脂质运载蛋白重链

<400> 38

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser

450 455 460

Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln

465 470 475 480

Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly

485 490 495

Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met

500 505 510

Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr

515 520 525

Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe

530 535 540

Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser

545 550 555 560

Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr

565 570 575

Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu

580 585 590

Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu

595 600 605

Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu

610 615 620

Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly

625 630 635

<210> 39

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL (FAP 4B9) Cκ 轻链

<400> 39

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR-H1，帕妥珠单抗

<400> 40

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp

1 5 10

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR-H2，帕妥珠单抗

<400> 41

Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR-H3，帕妥珠单抗

<400> 42

Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR-L1，帕妥珠单抗

<400> 43

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala

1 5 10

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR-L2，帕妥珠单抗

<400> 44

Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR-L3，帕妥珠单抗

<400> 45

Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 46

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变结构域 VH，帕妥珠单抗 (PER)

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变结构域 VL，帕妥珠单抗 (PER)

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR-H1，曲妥珠单抗

<400> 48

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

1 5 10

<210> 49

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR-H2，曲妥珠单抗

<400> 49

Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR-H3，曲妥珠单抗

<400> 50

Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR-L1，曲妥珠单抗

<400> 51

Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 52

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR-L2，曲妥珠单抗

<400> 52

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser

1 5

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR-L3，曲妥珠单抗

<400> 53

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 54

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变结构域 VH，曲妥珠单抗 (TRAS)

<400> 54

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 55

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变结构域 VL，曲妥珠单抗 (TRAS)

<400> 55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR-H1，aff. 帕妥珠单抗

<400> 56

Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Thr Met Asp

1 5 10

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR-H2，aff. 帕妥珠单抗

<400> 57

Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 CDR-H3，aff. 帕妥珠单抗

<400> 58

Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 59

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR-L1，aff. 帕妥珠单抗

<400> 59

Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala

1 5 10

<210> 60

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR-L2，aff. 帕妥珠单抗

<400> 60

Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链 CDR-L1，aff. 帕妥珠单抗

<400> 61

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 62

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链可变结构域 VH，aff. 帕妥珠单抗 (aff-PER)

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 63

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链可变结构域 VL，aff. 帕妥珠单抗 (aff-PER)

<400> 63

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 64

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc 孔 huIgG1 PGLALA - 4-1BB 脂质运载蛋白重链

<400> 64

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys

245 250 255

Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp

260 265 270

Tyr Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp

275 280 285

Pro Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser

290 295 300

Tyr Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp

305 310 315 320

Ile Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly

325 330 335

Lys Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val

340 345 350

Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe

355 360 365

Gln Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu

370 375 380

Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu

385 390 395 400

Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys

405 410 415

Ile Asp Gly

<210> 65

<211> 642

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH (Her2 TRAS) Fc 突起 huIgG1 PGLALA 4-1BB 脂质运载蛋白重链

<400> 65

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

465 470 475 480

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

485 490 495

Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

500 505 510

Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

515 520 525

Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile

530 535 540

Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys

545 550 555 560

Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser

565 570 575

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln

580 585 590

Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

595 600 605

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

610 615 620

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

625 630 635 640

Asp Gly

<210> 66

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL (Her2 TRAS) Cκ轻链

<400> 66

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 67

<211> 639

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH (FAP 4B9) - Fc huIgG1 PGLALA - 4-1BB 脂质运载蛋白重链

<400> 67

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser

450 455 460

Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu Gln

465 470 475 480

Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val Gly

485 490 495

Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys Met

500 505 510

Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr

515 520 525

Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr Phe

530 535 540

Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys Ile Lys Ser

545 550 555 560

Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr

565 570 575

Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg Glu

580 585 590

Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu

595 600 605

Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu

610 615 620

Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly

625 630 635

<210> 68

<211> 642

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH (Her2 TRAS) - Fc huIgG1 PGLALA-4-1BB 脂质运载蛋白重链

<400> 68

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val

465 470 475 480

Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr

485 490 495

Val Val Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro

500 505 510

Ile Lys Met Met Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr

515 520 525

Asp Val Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile

530 535 540

Trp Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Lys

545 550 555 560

Ile Lys Ser Phe Pro Gly His Thr Ser Ser Leu Val Arg Val Val Ser

565 570 575

Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln

580 585 590

Asn Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu

595 600 605

Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly

610 615 620

Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile

625 630 635 640

Asp Gly

<210> 69

<211> 637

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH (FAP 4B9) - Fc huIgG4 SP - 4-1BB 脂质运载蛋白重链

<400> 69

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

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Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Asp Ser Thr Ser

450 455 460

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Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr Asp Val Thr Met Val

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<210> 70

<211> 215

<212> PRT

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<220>

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<211> 635

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro Leu

465 470 475 480

Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr Val Val

485 490 495

Gly Gln Ala Gly Asn Ile Arg Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro Ile Lys

500 505 510

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515 520 525

Thr Met Val Lys Phe Asp Asp Lys Lys Cys Met Tyr Asp Ile Trp Thr

530 535 540

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545 550 555 560

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565 570 575

Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Phe Val Phe Gln Asn Arg

580 585 590

Glu Glu Phe Tyr Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser

595 600 605

Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro

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<220>

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 77

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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<210> 78

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

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<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 80

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 81

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 81

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1 5 10

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 82

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

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<210> 83

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 83

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 84

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 85

Gly Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 86

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1

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

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Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 88

Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly

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<210> 89

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 89

Gly Gly Asn Gly Ser Gly

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 90

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<213> 智人

<400> 91

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65 70 75 80

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85 90 95

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180 185 190

Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr

195 200 205

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210 215 220

Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly

245 250 255

Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro

260 265 270

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275 280 285

Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val

290 295 300

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Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln

325 330 335

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Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe

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580 585 590

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595 600 605

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 食蟹猴 FAP 胞外域+聚-lys-标签+his6-标签

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 100

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 101

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1 5 10 15

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<210> 102

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 102

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1 5 10 15

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180 185 190

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275 280 285

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290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln

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485 490 495

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<210> 103

<211> 163

<212> PRT

<213> 智人

<400> 103

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Ser Pro Gln

<210> 104

<211> 163

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 104

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1 5 10 15

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Ser Pro Gln

<210> 105

<211> 164

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 105

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<210> 106

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 32

<400> 106

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<210> 107

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 33

<400> 107

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<210> 108

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 34

<400> 108

Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys

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Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val

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145 150

<210> 109

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 35

<400> 109

Val Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys

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Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly

145 150

<210> 110

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 36

<400> 110

Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys

1 5 10 15

Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val

20 25 30

Thr Pro Met Thr Leu Ser Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys

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130 135 140

Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly

145 150

<210> 111

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 37

<400> 111

Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys

1 5 10 15

Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val

20 25 30

Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Glu

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100 105 110

Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys

115 120 125

Thr Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Ser

130 135 140

Gln Ile Glu Thr Ser Ser Pro Gly

145 150

<210> 112

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂质运载蛋白突变蛋白变体 38

<400> 112

Thr Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys

1 5 10 15

Ala Met Thr Val Asp Glu Gly Cys Arg Pro Trp Asn Ile Phe Ser Val

20 25 30

Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Asp Gly Asn Leu Glu Ala Lys

35 40 45

Val Thr Met Ala Ile Asp Gly Pro Ala Gln Glu Val Lys Ala Val Leu

50 55 60

Glu Lys Ala Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly Gly Lys His

65 70 75 80

Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr

85 90 95

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100 105 110

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<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

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<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 115

Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala

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<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 116

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1 5 10 15

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Gly Gly Ser Gly Asn Ser Ser Gly Ser Gly Gly Ser Pro Val Pro Ser

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<223> 肽连接基

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

<400> 118

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Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser

20 25 30

Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr

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Pro Ser Pro Ser Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn Ser Ser Ser

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<223> 肽连接基

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Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro

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Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala

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Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽连接基

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<220>

<223> 肽连接基

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180 185 190

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275 280 285

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<211> 327

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275 280 285

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165 170 175

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Pro Gly

225

<210> 129

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc 突起 hu IgG1

<400> 129

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

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130 135 140

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145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225