具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

一种从华山参中分离纯化东莨菪碱单体的方法，其包括以下步骤：

向华山参中加入乙醚和体积浓度为70％-80％的乙醇，经过超声提取，超声提取进行2次，第1次超声提取30-40min，分离取第一滤液和滤渣，向滤渣加入乙醇进行第2次超声提取，第2次超声提取20-30min，分离取第二滤液，将第一滤液和第二滤液混合后进行离心，离心时间为30-60min，离心速度为500-800r/s，离心后取上清液，将上清液在55-65℃抽真空50-100min得到第一残渣，向第一残渣加入氢氧化钠溶液，再加入氯仿进行萃取，氯仿萃取3次，每次萃取25-35min，将每次得到的萃取液混合后得到氯仿萃取溶液，将氯仿萃取溶液蒸干得到第二残渣；向第二残渣中加入盐酸溶液，然后加入D151大孔吸附树脂吸附5-10h，吸附后，将D151大孔吸附树脂用洗脱液洗脱6-12h，洗脱后得到的溶液在1000-1500r/s离心10-20min，得到东莨菪碱成品。

东莨菪碱是一种叔胺抗毒蕈碱药，其作用一般类似阿托品，对中枢和周围均有作用，但是它比阿托品抑制唾液分泌的作用更强，通常会减缓心率而不是加速心率，特别是在使用小剂量时。它对中枢的作用与阿托品不同，东莨菪碱能抑制大脑皮质，产生嗜睡和健忘，其对眼平滑肌和腺体分泌的抑制作用比阿托品强。东莨菪碱的外周作用与阿托品相似，它对涎腺、支气管和汗腺分泌的抑制作用较阿托品强，对眼的散瞳和调节麻痹作用较阿托品迅速，但作用消失较快、对心脏、肠管和支气管平滑肌的作用较弱，它也具有解除血管痉挛和改善微循环的作用。在一般治疗剂量时对中枢有明显的抑制作用，较大剂量时可产生催眠作用，大剂量时可产生激动、不安、幻觉或谵妄等中枢兴奋症状，但很快就进入睡觉状态，剂量更大(0.08mg/kg静脉注射)则皮质抑制更显著。

华山参为茄科植物漏斗泡囊草Physochlaina infundibularis Kuang的干燥根，具有温肺祛痰，平喘止咳，安神镇惊的功效，华山参中含有多种生物碱。生物碱是存在于自然界中的一类含氮的碱性有机化合物，有似碱的性质，所以过去又称为赝碱。大多数有复杂的环状结构，氮素多包含在环内，有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一，还具有光学活性。生物碱具环状结构，难溶于水，与酸可以形成盐，有一定的旋光性和吸收光谱，大多有苦味，呈无色结晶状，少数为液体。生物碱有几千种，由不同的氨基酸或其直接衍生物合成而来，是次级代谢物之一，对生物机体有毒性或强烈的生理作用。在常压时绝大多数生物碱均无挥发性，直接加热先熔融，继被分解，也可能熔融而同时分解，只有在高度真空下才能因加热而有升华现象。

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，因其吸附性好、吸附迅速、解吸容易等优良特性，在分离纯化天然药物活性成分中受到广泛青睐。其中D151大孔吸附树脂对东莨菪碱具有较大的吸附率和洗脱率，对东莨菪碱的分离纯化效果较好，因此选用D151对东莨菪碱分离纯化，能够得到纯度更高的东莨菪碱。

本实施例中由于生物碱难溶于水，易溶于有机溶剂，故用乙醚和乙醇为华山参的溶剂。选择乙醚和乙醇同为溶剂，乙醚与乙醇混合后可以提高溶液的生物相容性，进而让生物碱更容易溶解在溶液中，避免华山参中不溶于有机溶剂的物质将东莨菪碱截留，使得华山参中的东莨菪碱无法完全溶解在乙醚和乙醇中，进而使分离纯化得到的东莨菪碱纯度降低。详细地，选用体积浓度为70％-80％的乙醇，合适的浓度还可以让华山参中的东莨菪碱及莨菪碱被乙醇提取出来，即让东莨菪碱和莨菪碱溶解在乙醇和乙醚中，使后续提取东莨菪碱更简单。可选地，乙醚与乙醇的体积比为10：(1-5)，乙醚和乙醇合适的占比，能够让溶液的生物相容性效果更好，进而让华山参中的东莨菪碱能够完全被分离提取出来。其中，乙醚和乙醇的总质量是华山参质量的10-20倍，可以避免乙醚和乙醇量太少，无法将华山参中的东莨菪碱完全提取出来。

本实施例中将华山参超声提取2次，超声波产生的振荡作用，让华山参在溶液中的扩散速度加快，通过超声波持续不断的振荡，让乙醚和乙醇更容易渗入到华山参中，进而加快华山参与乙醚和乙醇的混合。第1次提取30-40min，因为第1次提取时，溶液中的提取物质含量比较高，在该时间内提取可以让提取物质提取比较彻底，而在第1次提取后滤渣中可能会存在未被完全提取的提取物质，所以需要进行第2次提取。第2次提取20-30min，由于滤渣中的提取物质含量比较少，在该时间内提取不仅可以提取残余物质，还可以节约时间，避免提取时间过长。

可选地，在向第一残渣加入氢氧化钠溶液之前，还包括向第一残渣中加入0.5mol/L-1mol/L的硫酸，然后用二氯甲烷萃取30-90min，弃去二氯甲烷层。硫酸可以除去第一残渣中的水溶性杂质，二氯甲烷可以除去第一残渣中的脂溶性杂质。选用0.5mol/L-1mol/L的硫酸除杂，强酸的溶解程度比较高，可以确保第一残渣中的水溶性杂质去除比较彻底，降低杂质含量，进而。用二氯甲烷萃取30-90min，在此萃取时间内，二氯甲烷可以更好的浸润到第一残渣内，确保二氯甲烷可以将第一残渣内部的表面的脂溶性杂质除去，进一步提高第一残渣的提取物质的含量。

可选地，3次氯仿萃取时，氯仿的用量依次为10-20mL、5-10mL、5-8mL。第1次萃取采用10-20mL氯仿，因为此时溶液中东莨菪碱的含量较多，需要较多的氯仿才可以将其萃取出来。第2次和第3次采用5-10mL氯仿进行萃取，此时东莨菪碱含量较低，使用5-8mL即可将其完全提出，避免氯仿用量过多造成氯仿浪费。

本实施例中将上清液在55-65℃抽真空得到第一残渣，在该温度下进行抽真空，可以避免温度过高让第一残渣中的东莨菪碱的形态发生变化，或者对东莨菪碱的晶型造成破坏，进而让得到的东莨菪碱纯度降低，该温度下还可以让乙醇和乙醚蒸发，得到东莨菪碱的粗提物。抽真空50-100min，可以让第一残渣中的乙醇和乙醚蒸发干净，减少乙醇和乙醚对后续操作的影响。

详细地，洗脱液是质量浓度为0.1％-0.5％的盐酸溶液，选用盐酸溶液对D151大孔吸附树脂进行洗脱，盐酸与东莨菪碱反应得到盐酸东莨菪碱，而盐酸东莨菪碱易溶于水，这样就可以让D151大孔吸附树脂上的东莨菪碱洗脱下来，另外盐酸与东莨菪碱的反应速度比较快，这样可以让东莨菪碱的洗脱速度更快，洗脱率更高。选用质量浓度为0.1％-0.5％的盐酸进行洗脱，该浓度下，溶液中的离子浓度更高，在对东莨菪碱进行洗脱时，离子与东莨菪碱反应更快，进而可以提高洗脱速度。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种从华山参中分离纯化东莨菪碱单体的方法，其包括以下步骤：

向华山参中加入乙醚和体积浓度为70％的乙醇，经过超声提取，超声提取进行2次，第1次超声提取30min，分离取第一滤液和滤渣，向滤渣加入乙醇进行第2次超声提取，第2次超声提取20min，分离取第二滤液，将第一滤液和第二滤液混合后进行离心，离心时间为30min，离心速度为500r/s，离心后取上清液，将上清液在55℃抽真空50min得到第一残渣，向第一残渣加入氢氧化钠溶液，再加入氯仿进行萃取，氯仿萃取3次，每次萃取25min，将每次得到的萃取液混合后得到氯仿萃取溶液，将氯仿萃取溶液蒸干得到第二残渣；向第二残渣中加入盐酸溶液，然后加入D151大孔吸附树脂吸附5h，吸附后，将D151大孔吸附树脂用洗脱液洗脱6h，洗脱后得到的溶液在1000r/s离心10min，得到东莨菪碱成品。

本实施例中乙醚和乙醇的体积比为10：1，乙醚和乙醇的总质量是华山参质量的10倍，盐酸溶液的质量浓度为0.1％，3次氯仿萃取时氯仿的用量依次为10mL、5mL、5mL。

实施例2

一种从华山参中分离纯化东莨菪碱单体的方法，其包括以下步骤：

向华山参中加入乙醚和体积浓度为80％的乙醇，经过超声提取，超声提取进行2次，第1次超声提取40min，分离取第一滤液和滤渣，向滤渣加入乙醇进行第2次超声提取，第2次超声提取30min，分离取第二滤液，将第一滤液和第二滤液混合后进行离心，离心时间为60min，离心速度为800r/s，离心后取上清液，将上清液在65℃抽真空100min得到第一残渣，向第一残渣加入氢氧化钠溶液，再加入氯仿进行萃取，氯仿萃取3次，每次萃取35min，将每次得到的萃取液混合后得到氯仿萃取溶液，将氯仿萃取溶液蒸干得到第二残渣；向第二残渣中加入盐酸溶液，然后加入D151大孔吸附树脂吸附10h，吸附后，将D151大孔吸附树脂用洗脱液洗脱12h，洗脱后得到的溶液在1500r/s离心20min，得到东莨菪碱成品。

本实施例中乙醚和乙醇的体积比为10：5，乙醚和乙醇的总质量是华山参质量的20倍，盐酸溶液的质量浓度为0.5％，3次氯仿萃取时氯仿的用量依次为20mL、10mL、8mL。

实施例3

一种从华山参中分离纯化东莨菪碱单体的方法，其包括以下步骤：

向华山参中加入乙醚和体积浓度为75％的乙醇，经过超声提取，超声提取进行2次，第1次超声提取35min，分离取第一滤液和滤渣，向滤渣加入乙醇进行第2次超声提取，第2次超声提取25min，分离取第二滤液，将第一滤液和第二滤液混合后进行离心，离心时间为40min，离心速度为700r/s，离心后取上清液，将上清液在60℃抽真空70min得到第一残渣，向第一残渣加入氢氧化钠溶液，再加入氯仿进行萃取，氯仿萃取3次，每次萃取30min，将每次得到的萃取液混合后得到氯仿萃取溶液，将氯仿萃取溶液蒸干得到第二残渣；向第二残渣中加入盐酸溶液，然后加入D151大孔吸附树脂吸附6h，吸附后，将D151大孔吸附树脂用洗脱液洗脱8h，洗脱后得到的溶液在1100r/s离心15min，得到东莨菪碱成品。

本实施例中乙醚和乙醇的体积比为10：3，乙醚和乙醇的总质量是华山参质量的15倍，盐酸溶液的质量浓度为0.2％，3次氯仿萃取时氯仿的用量依次为15mL、8mL、6mL。

实施例4

一种从华山参中分离纯化东莨菪碱单体的方法，其包括以下步骤：

向华山参中加入乙醚和体积浓度为72％的乙醇，经过超声提取，超声提取进行2次，第1次超声提取32min，分离取第一滤液和滤渣，向滤渣加入乙醇进行第2次超声提取，第2次超声提取22min，分离取第二滤液，将第一滤液和第二滤液混合后进行离心，离心时间为50min，离心速度为600r/s，离心后取上清液，将上清液在58℃抽真空80min得到第一残渣，向第一残渣加入氢氧化钠溶液，再加入氯仿进行萃取，氯仿萃取3次，每次萃取27min，将每次得到的萃取液混合后得到氯仿萃取溶液，将氯仿萃取溶液蒸干得到第二残渣；向第二残渣中加入盐酸溶液，然后加入D151大孔吸附树脂吸附8h，吸附后，将D151大孔吸附树脂用洗脱液洗脱10h，洗脱后得到的溶液在1200r/s离心12min，得到东莨菪碱成品。

本实施例中乙醚和乙醇的体积比为10：4，乙醚和乙醇的总质量是华山参质量的12倍，盐酸溶液的质量浓度为0.3％，3次氯仿萃取时氯仿的用量依次为16mL、7mL、7mL。

实施例5

一种从华山参中分离纯化东莨菪碱单体的方法，其包括以下步骤：

向华山参中加入乙醚和体积浓度为78％的乙醇，经过超声提取，超声提取进行2次，第1次超声提取37min，分离取第一滤液和滤渣，向滤渣加入乙醇进行第2次超声提取，第2次超声提取27min，分离取第二滤液，将第一滤液和第二滤液混合后进行离心，离心时间为45min，离心速度为650r/s，离心后取上清液，将上清液在62℃抽真空75min得到第一残渣，向第一残渣中加入0.5mol/L的硫酸，然后用二氯甲烷萃取40min，弃去二氯甲烷层，然后向其中加入氢氧化钠溶液，再加入氯仿进行萃取，氯仿萃取3次，每次萃取32min，将每次得到的萃取液混合后得到氯仿萃取溶液，将氯仿萃取溶液蒸干得到第二残渣；向第二残渣中加入盐酸溶液，然后加入D151大孔吸附树脂吸附7.5h，吸附后，将D151大孔吸附树脂用洗脱液洗脱9h，洗脱后得到的溶液在1300r/s离心17min，得到东莨菪碱成品。

本实施例中乙醚和乙醇的体积比为10：2，乙醚和乙醇的总质量是华山参质量的17倍，盐酸溶液的质量浓度为0.4％，3次氯仿萃取时氯仿的用量依次为13mL、7.5mL、6.5mL。

实施例6

一种从华山参中分离纯化东莨菪碱单体的方法，其包括以下步骤：

向华山参中加入乙醚和体积浓度为75％的乙醇，超声提取30min，在650r/s离心45min，取上清液，将上清液在60℃抽真空65min，得到第一残渣，向第一残渣加入氢氧化钠溶液，再加入氯仿萃取30min，得到氯仿萃取溶液，将氯仿萃取溶液蒸干得到第二残渣；向第二残渣中加入盐酸溶液，然后加入D151大孔吸附树脂吸附6.5h，吸附后，将D151大孔吸附树脂用洗脱液洗脱8.5h。

本实施例中乙醚和乙醇的体积比为10：2.5，乙醚和乙醇的总质量是华山参质量的13倍，盐酸溶液的质量浓度为0.15％，3次氯仿萃取时氯仿的用量依次为14mL、8.5mL、5.5mL。

实施例7

一种从华山参中分离纯化东莨菪碱单体的方法，其包括以下步骤：

向华山参中加入乙醚和体积浓度为76％的乙醇，超声提取35min，在750r/s离心55min，取上清液，将上清液在63℃抽真空55min，得到第一残渣，向第一残渣加入氢氧化钠溶液，再加入氯仿萃取30min，得到氯仿萃取溶液，将氯仿萃取溶液蒸干得到第二残渣；向第二残渣中加入盐酸溶液，然后加入D151大孔吸附树脂吸附8.5h，吸附后，将D151大孔吸附树脂用洗脱液洗脱11h。

本实施例中乙醚和乙醇的体积比为10：3.5，乙醚和乙醇的总质量是华山参质量的18倍，盐酸溶液的质量浓度为0.35％，3次氯仿萃取时氯仿的用量依次为18mL、9.5mL、6.8mL。

试验结果

取实施例1-7的东莨菪碱样品进行高效液相色谱分析，得到每个实施例中东莨菪碱样品的色谱峰，与标准品进行对比，将每个实施例得到的色谱峰面积代入标准曲线的公式计算含量，通过含量计算得到样品中东莨菪碱的纯度，具体数据如下：(试验过程中，标准品是经过校准的)

表1结果统计表

根据表1可知，实施例5得到的东莨菪碱的纯度最好。实施例5与实施例1-4相比，它们的操作步骤大体相同，操作条件不同，还增加了向第一残渣中加入硫酸，用二氯甲烷萃取，弃去二氯甲烷层，这样能够进一步除去生物碱中的杂质，从而提高得到的东莨菪碱的纯度，由此可知在实施例5的操作条件下所得到的东莨菪碱纯度最好。实施例5与实施例6-7相比，实施例5中增加了超声提取和氯仿萃取次数，还增加了对第一残渣的处理步骤，第一残渣的处理步骤能够提高东莨菪碱的纯度，超声提取和氯仿萃取次数更加，通过多次提取可以进一步让溶液中的东莨菪碱分离效果更好，进而让得到的东莨菪碱纯度更好。由此可知，本发明能够从华山参中分离提取纯度更高的东莨菪碱。

综上所述，本发明实施例的从华山参中分离纯化东莨菪碱单体的方法，本发明中先将华山参与乙醚和乙醇混溶，经过超声提取，超声波产生的振荡作用，让华山参在溶液中的扩散速度加快，通过超声波持续不断的振荡，让乙醚和乙醇更容易渗入到华山参中，进而加快华山参与乙醚和乙醇的混合。再对其离心、抽真空，得到第一残渣，由于还有会其它溶于乙醇或乙醚的物质混杂在第一残渣中，故需要对第一残渣进行二次分离纯化。向第一残渣中加入氢氧化钠溶液，主要是为了调节pH，当pH为弱碱性时，用氯仿进行萃取，避免酸性环境时影响氯仿的萃取效果，具体是让生物碱成盐，生物碱成盐后易溶于水，这样再用氯仿进行萃取时才更容易将生物碱提取出来。将氯仿萃取溶液进行蒸干，主要是为了除去氯仿，从而得到第二残渣即东莨菪碱粗提物。东莨菪碱粗提物中含有其它莨菪碱，需要再次对其分离纯化，用D151大孔树脂进行吸附，由于D151大孔吸附树脂对东莨菪碱的吸附率和洗脱率很好，对其它莨菪碱没有吸附性，因此经过吸附洗脱后可以得到纯度很好的东莨菪碱。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。