具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

本发明实施例提出一种山莨菪碱的纯化工艺，包括以下步骤：将0.05-0.15wt％复合酶溶液加入华山参酶解处理后过滤分离得到山莨菪浸膏和一次滤液；向一次滤液中加入乙醇一进行一次萃取得到萃取液；将萃取液减压蒸馏得到粗提取液；向粗提取液与山莨菪浸膏的混合物中加入乙醇一进行二次萃取过滤后得到二次滤液；将二次滤液于50-60℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。

华山参为草本植物，其植物细胞由细胞壁和原生质体组成，而细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成。在山莨菪碱的提取过程中，前述这些构成细胞壁的物质会阻碍原生质体中有效成分向提取介质中扩散。因此，本发明实施例将0.05-0.15％的复合酶溶液加入华山参中进行酶解处理，复合酶作用于植物细胞使得其细胞壁以及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶等物质降解，破坏细胞壁的致密结构，减小山莨菪内有效活性成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从而提高有效活性成分的提取率。再者，利用复合酶之间的协同效应可以加速山莨菪细胞壁的溶解，从而提高后期对山莨菪碱的提取率。详细地，复合酶为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶中至少两种。

进一步地，为了提高山莨菪碱的溶出率，本发明实施例中，华山参经过研磨过筛得到细粒，过筛目数为20-80目，所述细粒再加入复合酶溶液进行酶解处理。将华山参粉粹成小颗粒，可以增大乙醇与华山参颗粒的接触面积，从而加快山莨菪碱的溶出速率，缩短提取时间的同时，提高山莨菪碱的提取率。

为了提高复合酶的活性，加速酶解处理的速率，本发明实施例中，酶解处理的温度是35-40℃，酶解时间为2-3小时。在该温度下复合酶的活性较高，分子运动加快，溶解、扩散速率也加快，有利于山莨菪碱的提出，且能够避免复合酶高温失活而致使催化能力降低。此外，低温也有利于保护山莨菪碱的有效成分，避免被高温破坏而失效。而该酶解时间可以使得华山参的细胞壁酶解较为充分，同时也可避免酶解时间过长而使得水解液腐败，降低保温工艺的成本。

进一步地，酶解处理的步骤中，华山参与复合酶溶液的料液比为1：(15-20)。该比例下，复合酶与华山参的接触面积较大。酶解反应速率较大。若复合酶的浓度过高，会对复合酶产生抑制作用而使得复合酶的利用不够充分，造成资源的浪费，且增加经济成本；若复合酶的浓度过低，则复合酶无法充分地酶解华山参。

经过前道酶解处理的工序后，将该悬浊液进行过滤，分离后得到山莨菪浸膏和一次滤液。由于山莨菪碱易溶于乙醇，因此本发明实施例中选用乙醇作为萃取剂。向一次滤液中加入乙醇一进行一次萃取得到萃取液，萃取过程中山莨菪碱等易溶于乙醇的物质提取出来，然后再将萃取液经过减压蒸馏得到粗提取液。减压蒸馏的处理可以在较低的温度蒸馏出山莨菪碱的粗产品，且低温处理不仅可以避免有效成分的分解，还能减低成本，节约能源。根据相似相溶的原理，本发明实施例中，乙醇一采用70-85vol％的乙醇溶液。该浓度下的乙醇溶液对山莨菪碱的提取率较高，若超过该浓度，则乙醇一中水的含量较少，溶剂极性减弱，不利于对山莨菪碱的提取，且其提取率会降低。

经过一次萃取后仍然会有少量山莨菪碱的残留，为了提高对华山参的生物利用率，本发明实施例中，向粗提取液与山莨菪浸膏的混合物中加入乙醇一进行二次萃取，根据相似相溶的原理，使得山莨菪浸膏中残留的山莨菪碱溶出，不仅使得二次滤液最为接近天然华山参中山莨菪碱的成分，还提高了山莨菪碱的提取率。

详细地，一次萃取与二次萃取的温度均为60-70℃，每次萃取时间为40-60分钟。该萃取温度下既能加速分子的运动速率，缩短萃取时间，又能避免高温导致山莨菪碱活性成分被破坏而失效。萃取时间越长越利于活性物质的提取。但是，萃取时间太长，会造成多余杂质的溶出，从而导致山莨菪碱的提取率降低。因此，萃取时间太久不利于山莨菪碱的提取，故选择萃取时间为40-60分钟。

然后将二次滤液于50-60℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。在该温度下进行减压蒸馏可将多余的杂质去除，对山莨菪碱进一步地进行纯化，而且还能最大程度地保留山莨菪碱的生理活性，并且对其进行了浓缩，提高了单位体积内活性物质的含量，进而提高其生理性能的功效。

进一步地，二次滤液在进行减压蒸馏的步骤之前，将二次滤液经大孔吸附树脂处理，然后经乙醇二洗脱得到纯化粗液，将纯化粗液于50-60℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。将二次滤液经过离子交换树脂处理，以除去二次滤液中的盐类和色素。华山参在进行提取时，其溶液中常混有一部分色素以及盐分等杂质。其中色素主要来源于纤维素原料本身含有的色素、焦糖化反应、美拉德反应等产生的产物。而在华山参提取的过程中，常会有大量的钠离子混入提取液中。而色素和盐分的存在会降低终产品的质量，且限制了山莨菪碱的应用，因此需经过大孔吸附树脂的处理。大孔吸附树脂再经过乙醇二洗脱分离得到纯化粗液，达到纯化、除杂的目的。然后再经过减压蒸馏处理即可得到纯化的山莨菪碱。

详细地，前述乙醇二采用50-60vol％的乙醇溶液。乙醇二作为洗脱液，其体积分数过低或过高，其极性均与目标化合物相差较大，不仅破坏树脂与活性物质形成的化学键，同时其它吸附杂质也会竞争脱附，致使洗脱率降低，因此采用50-60vol％的乙醇。

本发明实施例提出的山莨菪碱的纯化工艺，不仅提高了山莨菪碱的溶出率，同时还通过分级纯化的工艺对山莨菪碱进行提纯，且最大程度地保留其生理活性，保证其药效。

本发明还提出了一种山莨菪碱，其由上述山莨菪碱的纯化工艺制成。该山莨菪碱的纯度较高，生理活性较为优异，且稳定性较好。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明实施例提出一种山莨菪碱的纯化工艺，包括以下步骤：

将华山参进行研磨，研磨后过筛，筛选出20目的小颗粒；将0.05wt％复合酶溶液加入小颗粒中，且于40℃的温度下酶解3小时，酶解处理后过滤分离得到山莨菪浸膏和一次滤液；向一次滤液中加入70vol％的乙醇一进行一次萃取得到萃取液；将萃取液减压蒸馏得到粗提取液；向粗提取液与山莨菪浸膏的混合物中加入70vol％的乙醇一进行二次萃取过滤后得到二次滤液；将二次滤液经大孔吸附树脂处理，然后经50vol％的乙醇二洗脱得到纯化粗液，将纯化粗液于50℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。

需要说明的是，复合酶为纤维素酶和半纤维素酶，且纤维素酶与半纤维素酶的质量比为2:1，且华山参与复合酶溶液的料液比为1:15，一次萃取与二次萃取的温度均为60℃，每次萃取时间为60分钟。

实施例2

本发明实施例提出一种山莨菪碱的纯化工艺，包括以下步骤：

将华山参进行研磨，研磨后过筛，筛选出80目的小颗粒；将0.15wt％复合酶溶液加入小颗粒中，且于35℃的温度下酶解2小时，酶解处理后过滤分离得到山莨菪浸膏和一次滤液；向一次滤液中加入85vol％的乙醇一进行一次萃取得到萃取液；将萃取液减压蒸馏得到粗提取液；向粗提取液与山莨菪浸膏的混合物中加入85vol％的乙醇一进行二次萃取过滤后得到二次滤液；将二次滤液经大孔吸附树脂处理，然后经60vol％的乙醇二洗脱得到纯化粗液，将纯化粗液于60℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。

需要说明的是，复合酶为纤维素酶和果胶酶，且纤维素酶与果胶酶的质量比为2.0:0.9，华山参与复合酶溶液的料液比为1:20，一次萃取与二次萃取的温度均为70℃，每次萃取时间为40分钟。

实施例3

本发明实施例提出一种山莨菪碱的纯化工艺，包括以下步骤：

将华山参进行研磨，研磨后过筛，筛选出45目的小颗粒；将0.10wt％复合酶溶液加入小颗粒中，且于37℃的温度下酶解2.5小时，酶解处理后过滤分离得到山莨菪浸膏和一次滤液；向一次滤液中加入80vol％的乙醇一进行一次萃取得到萃取液；将萃取液减压蒸馏得到粗提取液；向粗提取液与山莨菪浸膏的混合物中加入80vol％的乙醇一进行二次萃取过滤后得到二次滤液；将二次滤液经大孔吸附树脂处理，然后经55vol％的乙醇二洗脱得到纯化粗液，将纯化粗液于55℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。

需要说明的是，复合酶为纤维素酶和果胶酶，且华山参与复合酶溶液的料液比为1:18，一次萃取与二次萃取的温度均为65℃，每次萃取时间为50分钟。

实施例4

本发明实施例提出一种山莨菪碱的纯化工艺，包括以下步骤：

将华山参进行研磨，研磨后过筛，筛选出60目的小颗粒；将0.08wt％复合酶溶液加入小颗粒酶解处理后过滤分离得到山莨菪浸膏和一次滤液；向一次滤液中加入75vol％的乙醇一进行一次萃取得到萃取液；将萃取液减压蒸馏得到粗提取液；向粗提取液与山莨菪浸膏的混合物中加入75vol％的乙醇一进行二次萃取过滤后得到二次滤液；将二次滤液经大孔吸附树脂处理，然后经53vol％的乙醇二洗脱得到纯化粗液，将纯化粗液于52℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。

需要说明的是，复合酶为纤维素酶和半纤维素酶，且华山参与复合酶溶液的料液比为1:17。

实施例5

本发明实施例提出一种山莨菪碱的纯化工艺，包括以下步骤：

将0.12wt％复合酶溶液加入华山参酶解处理后过滤分离得到山莨菪浸膏和一次滤液；向一次滤液中加入78vol％的乙醇一进行一次萃取得到萃取液；将萃取液减压蒸馏得到粗提取液；向粗提取液与山莨菪浸膏的混合物中加入78vol％的乙醇一进行二次萃取过滤后得到二次滤液；将二次滤液经大孔吸附树脂处理，然后经乙醇二洗脱得到纯化粗液，将纯化粗液于58℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。

需要说明的是，华山参与复合酶溶液的料液比为1:18。

实施例6

本发明实施例提出一种山莨菪碱的纯化工艺，包括以下步骤：

将0.09wt％复合酶溶液加入华山参酶解处理后过滤分离得到山莨菪浸膏和一次滤液；向一次滤液中加入乙醇一进行一次萃取得到萃取液；将萃取液减压蒸馏得到粗提取液；向粗提取液与山莨菪浸膏的混合物中加入乙醇一进行二次萃取过滤后得到二次滤液；将二次滤液于56℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。

需要说明的是，华山参与复合酶溶液的料液比为1:16。

实施例7

本发明实施例提出一种山莨菪碱的纯化工艺，包括以下步骤：

将0.14wt％复合酶溶液加入华山参酶解处理后过滤分离得到山莨菪浸膏和一次滤液；向一次滤液中加入乙醇一进行一次萃取得到萃取液；将萃取液减压蒸馏得到粗提取液；向粗提取液与山莨菪浸膏的混合物中加入乙醇一进行二次萃取过滤后得到二次滤液；将二次滤液于57℃的温度下减压蒸馏至无乙醇得到纯化的山莨菪碱。

试验例1

根据《原料药物与制剂稳定性试验指导原则》，(以下简称《指导原则》)分别称取1g实施例1-7所得到的纯化山莨菪碱，置于培养皿中，摊成≤5mm厚的薄层，分别敞口置于温度25℃、相对湿度92.5％(KNO₃饱和溶液)及温度25℃、相对湿度75％(NaCl饱和溶液)的密闭容器中，于放置后第0、5、10天取样，准确称定实验前后供试品质量，结果见表1。

表1

由表1中的数据可知，实施例1-7所得纯化山莨菪碱的抗湿性较好，在两种相对湿度条件下，山莨菪碱的吸湿增重均＜5％，说明利用本发明实施例提出的山莨菪碱的纯化工艺可以提高山莨菪碱的稳定性，在高湿环境下其吸湿量较少。

试验例2

根据《指导原则》分别称取1g实施例1-7所得到的纯化山莨菪碱，置于培养皿中，摊成≤5mm厚的薄层，敞口置于60℃下，于放置后第0、5、10天取样，测定山莨菪碱的质量，结果见表2。

表2

由表2中的数据可知，在该温度下山莨菪碱的含量无明显变化，说明其在高温下稳定性较好。

试验例3

由上述2个试验例可知，实施例1-7相对比，实施例7所得纯化山莨菪碱的稳定性相对较差，因此选择实施例7的山莨菪碱作为本试验例的研究对象，采用《药典》中的旋光度检测方法对实施例7的山莨菪碱(配制50mg/ml的山莨菪碱溶液)进行纯度的检测。

通过该检测方法的检测，实施例7的山莨菪碱的比旋度为-32.0°，接近于莨菪碱的比旋度-32.5°，符合山莨菪碱的光学活性，且纯度较高，说明本发明实施例提供的山莨菪碱纯化工艺能够提高山莨菪碱的纯度。

综上所述，本发明提供一种山莨菪碱及其纯化工艺，不仅对山莨菪碱进行了纯化，而且还能最大程度地保留山莨菪碱的生理活性。另一方面，本发明还提出了一种山莨菪碱，其由上述山莨菪碱的纯化工艺制成。该山莨菪碱的纯度较高，生理活性较为优异，且稳定性较好。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明实施例中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。