具体实施方式

首先，详细地对本实施方式的免疫刺激剂进行说明。

本实施方式的免疫刺激剂含有通式I所表示的化合物或其药理学上允许的盐作为有效成分，

[化5]

(式中，n表示4～12的整数)。式中，优选n为4～10，更优选n为4～8，进一步更优选n为5～7。

本说明书中，“药理学上允许的盐”的意思是公开的化合物的衍生物，其中，母体化合物为了形成盐而通过酸或碱部分的置换被修饰。药理学上允许的盐的例子包括但不限于：胺、碱那样的碱性残基的矿物或有机酸盐、或羧酸等那样的酸性残基的有机盐。本说明书中，药理学上允许的盐包括例如由无毒性无机或有机酸形成的母体化合物的现有的无毒性盐。本说明书中，药理学上允许的盐有时通过现有的化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这样的盐是在水中或有机溶剂中或2种的混合溶液中，使这些化合物的游离酸或游离碱按合适的碱或酸的化学计量反应而制备的。一般而言，醚、乙酸乙酯(EtOAc)、乙醇、异丙醇、乙腈等那样的非水系介质是合适的。合适的盐的列表在雷明顿制药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第17版，Mack出版公司，宾夕法尼亚州伊斯顿，1985年第1418页和药学杂志(Journal of Pharmaceutical Science)66,2(1977)中有记载。

上述通式I的化合物例如可以通过“新大环化合物的合成(Synthesis of NewMacrocycles)第IV.I部分，二聚邻苯二甲酸酯的两步合成(Two-step Synthesis ofDimeric Phthalic Acid Esters)，化学学会杂志珀金交易(Journal of the ChemicalSociety，Perkin Transactions)1,1974,2578-2580”等公知的合成方法来制造。

本实施方式的免疫刺激剂例如可以含有式II所表示的化合物或其药理学上允许的盐作为有效成分，

[化6]

式II的化合物是前述式I中n为6的化合物。式II的化合物的化学名为7,8,9,10,11,12,19,20,21,22,23,24-十二氢-二苯并[1,6,13,18]-四氧杂十八(熳)环-2,5,14,17-四酮(7,8,9,10,11,12,19,20,21,22,23,24-dodecahydro-dibenzo[1,6,13,18]-tetraoxacyclooctadecine-2,5,14,17-tetrone)。本说明书中，有时将式II的化合物称为“AU-1833C”。

对上述式II的化合物(AU-1833C)的合成方法的一例进行说明(图1)。以下的化合物1～5如图1所示。将化合物1溶解在吡啶中，在其中加入化合物2，预定温度下搅拌预定时间。进一步加入化合物1，预定温度下搅拌预定时间。接下来用EtOAc稀释后，按照HCl溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液的顺序进行分液。在EtOAc层中加入Na₂SO₄干燥后，浓缩，得到化合物3。将化合物3、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)溶解在无水二氯甲烷中，在其中加入化合物4，搅拌预定时间。接下来用氯仿稀释后，按照HCl溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液的顺序进行分液。在氯仿层中加入Na₂SO₄干燥后，浓缩，用EtOAc和己烷硅胶柱纯化后，得到化合物5。将化合物5和预定的催化剂溶解在无水二氯甲烷中，搅拌预定时间。接下来，用EtOAc和己烷硅胶柱纯化后，得到化合物6。将化合物6溶解在甲醇中，在其中加入钯-活性炭乙二胺复合物，氢气气氛下搅拌预定时间。接下来用硅藻土过滤后，用EtOAc和己烷硅胶柱纯化，得到AU-1833C。需说明的是，上述式II的化合物(AU-1833C)也可以通过除了这种方法以外的方法合成，或者也可以通过对动植物进行加工、提取处理等而分离。

关于本实施方式的免疫刺激剂的免疫刺激作用，例如，用该免疫刺激剂给药的哺乳动物细胞中细胞因子产生增强(例如肿瘤坏死因子(TNF-α)产生增强)的程度比未给药的哺乳动物细胞中的增强程度高的情况下、以及用该免疫刺激剂给药的哺乳动物中腹腔内浸润细胞(peritoneal exudate cell：PEC)数增加的程度比未给药的哺乳动物中的增加程度高的情况下，可以判定具有免疫刺激作用。前述哺乳动物例如为人、小鼠、猴、马、牛等。

本实施方式的免疫刺激剂可以通过常规方法制备成例如片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、糖浆剂、注射剂等剂型，也可以使用合适的给药系统(DDS)。此外，还可以添加通常的医药品中使用的赋形剂、粘合剂、润滑剂、着色剂、崩解剂、增稠剂、防腐剂、稳定剂、pH调节剂等。此外，本实施方式的免疫刺激剂的给药量可以根据对象的年龄、体重、适应症等适当设定。此外，关于本实施方式的免疫刺激剂的给药方法，吃饭时给药、饭后给药、饭前给药、餐间给药、睡前给药等均可。

接下来，对本实施方式的免疫刺激用食品饮料进行说明。

本实施方式的免疫刺激用食品饮料含有通式I所表示的化合物或其药理学上允许的盐作为有效成分，

[化7]

(式中，n表示4～12的整数)。式中，优选n为4～10，更优选n为4～8，进一步更优选n为5～7。

本实施方式的免疫刺激用食品饮料例如可以含有式II所表示的化合物或其药理学上允许的盐作为有效成分，

[化8]

式II的化合物是前述式I中n为6的化合物。式II的化合物的化学名为7,8,9,10,11,12,19,20,21,22,23,24-十二氢-二苯并[1,6,13,18]-四氧杂十八(熳)环-2,5,14,17-四酮(7,8,9,10,11,12,19,20,21,22,23,24-dodecahydro-dibenzo[1,6,13,18]-tetraoxacyclooctadecine-2,5,14,17-tetrone)。本说明书中，有时将式II的化合物称为“AU-1833C”。

本实施方式的免疫刺激用食品饮料中，关于“药理学上允许的盐”、“免疫刺激”作用等的详细信息与前述是同样的。

本实施方式的免疫刺激用食品饮料可以通过常规方法加工成例如颗粒状、粒状、片剂、胶囊、凝胶状、霜状、膏状、悬浊液状、水溶液状、乳液状、粉末状等适合用于饮食的形态。此外，还可以添加食品饮料中通常使用的赋形剂、粘合剂、润滑剂、着色剂、崩解剂、增稠剂、防腐剂、稳定剂、pH调节剂等。进一步，为了改善味道，在不损害本发明效果的范围内，可以添加糖类、糖醇类、盐类、油脂类、氨基酸类、有机酸类、甘油等。需说明的是，使本实施方式的免疫刺激用食品饮料包含在现有食品饮料中而使用的情况下，作为基础食品饮料，只要是能够实现本发明效果的食品饮料，即可适当选择。

本实施方式的免疫刺激用食品饮料例如可作为特定保健用食品、营养功能食品、显示功能性的食品、补充剂、所谓饮用剂、家畜用饲料等使用。

实施例

以下，列举实施例具体地对本发明进行说明。但本发明不受这些实施例的限定。

(实施例1)

如图1所示，合成式II的化合物(AU-1833C)。化合物1～6如图1所示。

(化合物5的合成)

将3g(20mmol)的化合物1(富士胶片和光纯药株式会社制)溶解在40mL的吡啶(富士胶片和光纯药株式会社制)中，在其中加入1.9g(16mmol)的化合物2(富士胶片和光纯药株式会社制)，在80℃搅拌4小时。进一步加入3g(20mmol)的化合物1，在80℃搅拌20小时。接下来，用EtOAc稀释后，按照1M的HCl溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液的顺序进行分液。在EtOAc层中加入Na₂SO₄干燥后，浓缩，得到化合物3(5g，12mmol，收率63％)。将化合物3(5g，12mmol)、1.2g(1mmol)的4-二甲氨基吡啶(DMAP，富士胶片和光纯药株式会社制)和10.3g(5mmol)的N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC，富士胶片和光纯药株式会社制)溶解在无水二氯甲烷(70mL)中，在其中加入2.2g(30mmol)的化合物4(富士胶片和光纯药株式会社制)，搅拌过夜。接下来用氯仿稀释后，按照1M的HCl溶液、饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液的顺序进行分液。在氯仿层中加入Na₂SO₄干燥后，浓缩，用EtOAc:己烷＝40:60(v/v)的硅胶柱(200g)纯化后，得到化合物5(3.5g，6.7mmol，从化合物3的收率为56％)。将化合物5的¹H-NMR分析结果示于下文：¹H-NMR(CDCl_3,270MHz)δ7.68(4H，dd，J＝5.7,3.5Hz)，δ7.49(4H，dd，J＝5.4,3.2Hz)，δ5.80(2H，m)，δ5.10(4H，m)，δ4.30(8H，m)，δ2.46(4H，m)，δ1.73(4H，m)，δ1.49(4H，m)。

(化合物6的合成)

将化合物5(3.5g，6.7mmol)和150mg(177mmol)的第2代Grubbs催化剂(Sigma-Aldrich公司制)溶解在无水二氯甲烷(100mL)中，搅拌过夜。接下来，用EtOAc:己烷＝35:65(v/v)的硅胶柱(200g)纯化后，得到化合物6(1.3g，2.6mmol，从化合物5的收率为39％)。将化合物6的¹H-NMR分析结果示于下文：¹H NMR(CDCl_3,270MHz)δ7.72(4H，m)，δ7.53(4H，m)，δ5.59(2H，m)，δ4.30(8H，m)，δ2.46(4H，m)，δ1.75(4H，m)，δ1.46(4H，m)。

(AU-1833C的合成)

将化合物6(1.3g，2.6mmol)溶解在甲醇(60mL)中，在其中加入60mg的钯-活性炭乙二胺复合物(富士胶片和光纯药株式会社制)，氢气气氛下搅拌3小时。接下来，用硅藻土过滤后，用EtOAc:己烷＝40:60(v/v)的硅胶柱(100g)纯化，得到AU-1833C(0.9g，1.8mmol，从化合物6的收率为68％)。

[化9]

将关于合成的化合物的¹³C NMR(100MHz)数据和¹H NMR(400MHz)数据示于图2(溶剂：MeOH-d₄)。根据这些数据，表明合成的化合物确实是式II的化合物(AU-1833C)。

(实施例2)

对AU-1833C的免疫刺激作用进行验证。

(细胞中的TNF-α产生诱导活性)

对小鼠来源巨噬细胞样细胞株(RAW264，提供者：日本理化学研究所生物资源研究中心)中的TNF-α产生诱导活性进行验证。作为供试样品，使用AU-1833C(实施例1中合成)、香菇多糖(制品名：香菇多糖，富士胶片和光纯药株式会社制)和褐藻糖胶(制品名：褐藻糖胶，Fucus vesiculosus(墨角藻)来源，Sigma-Aldrich公司制)，以供试样品的终浓度为50、100、200μg/mL的方式调整供试样品溶液。首先，将全部供试样品以形成终浓度1,000倍浓度的方式用二甲基亚砜(DMSO)溶解，然后用去离子水进行100倍稀释，制作终浓度10倍浓度(含有1％DMSO)的供试样品溶液。将RAW264悬浮在添加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(制品名：Dulbecco改良Eagle培养基“日水”2粉末，日水制药株式会社制)中，以10,000细胞(cells)/孔(well)/100μL的细胞密度接种于96孔微孔板，在37℃、5％CO₂下培养16小时。替换成新的DMEM培养基(180μL)，对于各供试样品区添加十分之一量(20μL)的供试样品溶液，或者对于无处理区添加1％DMSO水溶液，在37℃、5％CO₂下培养24小时。然后，回收培养上清，用于TNF-α产生诱导活性的评价试验。产生的TNF-α的浓度测定中使用ELISA试剂盒(制品名：Mouse TNF-alpha Quantikine ELISA Kit，R&D systems公司制)，按照实验方案来实施。由测得的TNF-α浓度算出各供试样品区中TNF-α浓度相对于无处理区中TNF-α浓度的比例，作为TNF-α产生诱导活性。

将TNF-α产生诱导活性的结果示于图3。50、100、200μg/mL的全部浓度中，AU-1833C的TNF-α产生诱导活性显示比相应的作为对照的无处理区显著高。此外，各浓度下AU-1833C的TNF-α产生诱导活性显示比同浓度的香菇多糖和褐藻糖胶显著高。

根据以上结果，可见，AU-1833C的TNF-α产生诱导活性比作为现有免疫刺激剂的香菇多糖和褐藻糖胶显著高，具有优异的免疫刺激作用。

(小鼠中的PEC数和TNF-α产生诱导量)

接下来，对小鼠中的腹腔内浸润细胞(peritoneal exudate cell：PEC)数和TNF-α产生诱导量进行验证。

将作为供试样品的AU-1833C以形成50mg/mL的方式用DMSO溶解后，用生理盐水(制品名：大塚生食注，大塚制药株式会社制)稀释5倍，制成10mg/mL(含有20％DMSO)的供试样品溶液。

使用的动物为Slc:ddY小鼠(雌，6周龄)，如下所述进行分组。

1)无处理区：n＝6

2)AU-1833C区：n＝6

将5周龄时购买的小鼠在自由摄取水、饲料(普通食品(制品名：CE-2，日本CLEA公司制))的状态下驯化5天。测定驯化后的6周龄小鼠的体重，基于测定值，以组间不产生体重差的方式进行分组。将200μL供试样品溶液或作为无处理区的20％DMSO生理盐水分别通过腹腔内注射对小鼠给药。使给药后经过22小时的小鼠在异氟醚麻醉下牺牲死亡，在腹腔内注入5mL生理盐水，将腹部揉捏10次左右后，从腹腔内回收生理盐水，从而回收腹腔内的细胞。使用一部分回收的生理盐水和TUERK溶液(制品名：TUERK溶液，和光纯药工业公司制)，测定浸润至腹腔内的白细胞等作为有核细胞的PEC的浓度(细胞/mL(cells/mL))。用测得的PEC浓度乘以注入至腹腔内的生理盐水的量(5mL)，从而算出每个小鼠个体的PEC数(细胞/小鼠(cells/mouse))。

为了测定脂多糖(LPS)(制品名：Lipopolysaccharide from Escherichia coliO111：B4，Sigma-Aldrich公司制)处理下PEC所具有的TNF-α产生诱导能力，对剩下的回收的生理盐水进行离心分离，回收PEC。用无血清RPMI1640培养基(制品名：RPMI1640培养基“日水”2粉末，日水制药株式会社制)将PEC悬浮后，再次离心分离，悬浮在添加有10％胎牛血清(FBS)的RPM1640培养基中，从而对PEC进行洗涤。使用TUERK溶液再次计算洗涤后的细胞数后，用含有血清的RPMI1640培养基调节浓度，以800,000细胞(cells)/孔(well)/180μL的细胞密度接种于96孔微孔板。以终浓度为100ng/mL的方式添加LPS，将总培养基液量设为200μL，在37℃、5％CO₂下培养3小时。然后，回收培养上清，用于TNF-α产生诱导量的评价试验。TNF-α浓度的测定使用ELISA试剂盒，按照实验方案来实施。由测得的TNF-α浓度(pg/1,000μL)，使用以下的计算式1算出每个细胞的TNF-α量，同时，使用以下的计算式2算出每个小鼠个体的PEC产生的TNF-α量。

计算式1

TNF-α浓度(pg/1,000μL)×(200μL/1,000)/800,000细胞(cells)＝TNF-α产生量(pg/cell)

计算式2

TNF-α浓度(pg/1,000μL)×(200μL/1,000)/800,000细胞(cells)×每个小鼠个体的PEC数(细胞/小鼠(cells/mouse))＝TNF-α产生量(pg/mouse)

将结果示于图4。表明与作为对照的无处理小鼠相比，用AU-1833C腹腔内给药的小鼠中PEC数显著多(图4(a))。此外还表明，用AU-1833C给药的小鼠中，与作为对照的无处理小鼠相比，PEC中每个细胞的TNF-α产生量显著多(图4(b))，同时，来自每个小鼠个体的PEC的TNF-α产生量也显著多(图4(c))。

根据以上结果，观察到AU-1833C给药导致的PEC数的增加和PEC中TNF-α产生诱导量的增加、来自每个小鼠个体的PEC的TNF-α产生诱导量的增加，可见AU-1833C具有优异的免疫刺激作用。

需说明的是，在不脱离本发明广义的精神和范围内，本发明可以采用各种实施方式和变形。此外，上述实施方式是用于对本发明进行说明的例子，并非对本发明范围的限定。也就是说，本发明的范围由权利要求来表示，而不是实施方式。而且，在权利要求和与之等同的发明意义范围内实施的各种变形均视为在本发明的范围内。

本发明以2019年3月29日提出的日本专利申请2019-67663号为基础。日本专利申请2019-67663号的说明书、权利要求书、附图整体作为参照并入本说明书。