制造琼脂或琼脂糖珠的方法
阅读说明：本技术 制造琼脂或琼脂糖珠的方法 (Method for producing agar or agarose beads ) 是由 S·林德贝格 J·古斯塔夫松 L·卡尔松 A·哈格瓦尔 E·林格贝格 D·扬松 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了制造琼脂或琼脂糖珠的方法,包括以下步骤：a)在40-100℃的温度下提供包含琼脂或琼脂糖的水溶液的水相；b)在40-100℃的温度下提供包含水不混溶性溶剂和乳化剂的油相；c)将所述水相在所述油相中乳化以形成油包水乳液；d)将所述油包水乳液冷却至低于所述琼脂或琼脂糖的胶凝温度的温度,以形成固化的琼脂或琼脂糖珠的分散体；以及e)从所述分散体中回收琼脂或琼脂糖珠,其中所述乳化剂包含烷氧基化脂肪醇的磷酸酯。(The invention discloses a method for manufacturing agar or agarose beads, which comprises the following steps: a) providing an aqueous phase comprising an aqueous solution of agar or agarose at a temperature of 40-100 ℃; b) providing an oil phase comprising a water-immiscible solvent and an emulsifier at a temperature of 40-100 ℃; c) emulsifying the aqueous phase in the oil phase to form a water-in-oil emulsion; d) cooling the water-in-oil emulsion to a temperature below the gelation temperature of the agar or agarose to form a dispersion of solidified agar or agarose beads; and e) recovering agar or agarose beads from the dispersion, wherein the emulsifier comprises a phosphate ester of an alkoxylated fatty alcohol.)
技术领域
本发明涉及琼脂/琼脂糖珠，更具体而言，涉及制造琼脂或琼脂糖珠的方法。本发明还涉及适用于该方法的乳化剂。
背景技术
数十年来，琼脂糖珠已在蛋白质和其它生物大分子的色谱分离中用作固定相。它们通常通过反相悬浮胶凝制备，其中将琼脂糖或琼脂的热水溶液在热油相中乳化以形成油包水(W/O)乳液。然后将乳液冷却至琼脂糖/琼脂的胶凝温度以下以产生凝胶珠，然后可以将其回收并用于分离目的。这些方法描述于例如S Hjertén: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964), WO1989011493A1和US20180171484中，其通过引用以其整体并入本文。在US20100084345中描述了一种变体，其中琼脂珠通过胶凝后硫酸酯基团的水解而转化成琼脂糖珠，该文献也通过引用以其整体并入。
在该方法中，使用乳化剂来稳定W/O乳液是必要的。乳化剂对于所得珠的尺寸分布和它们的形状也是重要的。此外，乳化剂应该易于通过洗涤从珠中除去，并且它应该是环境友好的，并且当珠用于制造药物时不产生任何有毒的可浸出物。
先前公开的乳化剂缺少这些方面中的几个，因此，需要另外的乳化剂。
发明内容
本发明的一个方面是提供一种用于制造琼脂或琼脂糖珠的方法。这是通过包括以下步骤的方法实现的：
a)在40-100℃的温度下提供包含琼脂或琼脂糖的水溶液的水相；
b)在40-100℃的温度下提供包含水不混溶性溶剂和乳化剂的油相；
c)将所述水相在所述油相中乳化以形成油包水(W/O)乳液；
d)将W/O乳液冷却至低于琼脂或琼脂糖的胶凝温度的温度，以形成固化的琼脂或琼脂糖珠的分散体；以及
e)从所述分散体中回收琼脂或琼脂糖珠，
其中所述乳化剂包含烷氧基化脂肪醇的磷酸酯。
一个优点是防止了步骤d)中珠的聚集，从而产生了良好分散的高球形度珠。其它优点是乳化剂是水溶性的，便于通过水洗涤除去，并且它不含内分泌干扰物如烷基酚衍生物。
本发明的另一方面是提供可通过上述方法获得的琼脂或琼脂糖珠。
本发明的其它合适的实施方案在从属权利要求中描述。
附图说明
图1显示了由良好稳定的W/O琼脂糖乳液形成的良好分散的球形琼脂糖珠的实例。
图2显示了具有聚集体(由箭头指示)的琼脂糖珠的实例，所述聚集体可以在W/O琼脂糖乳液的冷却过程中形成。
图3显示了具有非球形、部分聚结的珠(由箭头指示)的琼脂糖珠的实例。
图4显示了琼脂糖珠的实例，其中珠中具有球形内含物(由箭头指示)，这是由O/W/O双重乳液形成引起的。
具体实施方式
在一个方面，本发明公开了一种用于制造琼脂或琼脂糖珠的方法。该方法包括以下步骤：
a)在40-100℃的温度下提供包含琼脂或琼脂糖水溶液的水相。水相可例如包含1-8重量%的琼脂或琼脂糖，例如2-7重量%的琼脂或琼脂糖，例如约2重量%、约4重量%或约6重量%。水相可进一步包含一种或多种缓冲液组分，例如弱碱。琼脂或琼脂糖可以是天然琼脂、天然琼脂糖或琼脂或琼脂糖的衍生物，例如烯丙基琼脂糖或羟乙基琼脂糖，进一步描述于US6602990和US7396467中，其通过引用以其整体并入本文；
b)在40-100℃的温度下(合适地在低于溶剂沸点的温度下)提供包含水不混溶性溶剂和乳化剂的油相。水不混溶性溶剂可以是例如烃、酯或酮。为了促进有效的溶剂回收，溶剂可以具有在大气压下在约90-170℃范围内的沸点，例如90-150℃或100-120℃。它可以是例如甲苯(沸点111℃)或二甲苯(沸点约140℃：间二甲苯139℃和邻二甲苯144℃)。或者，它可以是环状酮，例如2-甲基环己酮(沸点162-163℃)。也可使用较高沸点的溶剂，例如矿物油或植物油，尽管溶剂可能更难以回收。乳化剂的性质进一步描述如下。乳化剂可以是单一乳化剂，或者油相可以包含几种乳化剂的混合物。油相中乳化剂的浓度(或总乳化剂浓度)可以是例如0.01-2重量%，例如0.015-1重量%。适宜地，乳化剂均不包含烷基酚或烷基酚衍生物。油相可以例如包含小于0.1重量%，例如小于0.01或小于0.001重量%的烷基酚或烷基酚衍生物。甚至可以不含烷基酚和烷基酚衍生物；
c)将所述水相在所述油相中乳化以形成油包水(W/O)乳液。乳化可以包括在搅拌容器中混合水相和油相以形成W/O乳液。该步骤可进一步包括使W/O乳液通过转子-定子混合器、静态混合器或多孔膜以减小W/O乳液的液滴尺寸。在形成乳液的另一种方式中，水相可通过多孔膜或筛板进入油相以形成W/O乳液；
d)将W/O乳液冷却至低于琼脂或琼脂糖的胶凝温度的温度，以形成固化的琼脂或琼脂糖珠的分散体。该步骤可以通过在搅拌容器中逐渐冷却乳液来进行，或者它可以通过使W/O乳液通过具有纵向降低的温度梯度的导管以连续模式进行；
e)从分散体中回收琼脂或琼脂糖珠。回收可以包括向步骤d)中获得的分散体中加入水或水溶液，倾析油相，并回收作为沉淀物的琼脂或琼脂糖珠。可以进一步用水或水溶液洗涤珠以除去残留的乳化剂和/或其它物质。也可将用有机溶剂的洗涤用于除去乳化剂残留物和其它可浸出物。
在步骤e)之后，可以在步骤f)中通过加入交联剂例如表氯醇使珠交联。它们可以进一步在步骤g)中用配体官能化，其中使用本领域技术人员已知的方法共价偶联配体。步骤g)可以在步骤f)之后适当地进行，尽管也可以将配体偶联到非交联珠上。
通过该方法制备的珠可以用于色谱分离方法或分批吸附方法。它们可以例如具有5-500μm范围内的直径(表示为体积加权中值直径d50，v)，例如10-350μm或30-120μm。
上述乳化剂包括烷氧基化脂肪醇的磷酸酯。通常，其可包含烷氧基化脂肪醇的磷酸单酯和磷酸二酯的混合物。脂肪醇可以包含一种或多种C10-C20线性或支链的、伯或仲烷醇或烯醇和/或乙氧基化脂肪醇可以具有结构I
R1 – O – (R2-O)n-H (I)
其中：
R1是饱和或不饱和的、线性或支链的脂族C10-C20烃，例如饱和或不饱和的线性脂族C10-C18烃，
R2是-CH2-CH2-，或-CH2-CH2-和-CH2 (CH3) -CH2-的混合物，和
n为2-20，例如2-10或2-5。
该结构描述了乙氧基化或混合的乙氧基化/丙氧基化脂肪醇，其平均烷氧基化度为n。然后将烷氧基化脂肪醇转化为结构II和III的磷酸酯，其中II是磷酸单酯，III是磷酸二酯：
R1-O- (R2-O) n-P (O) (OH) -OH (II)
R1-O- (R2-O) n-P (O) (OH) - (O-R2) n-O-R1 (III)
其中：
R1是饱和或不饱和的、线性或支链的脂族C10-C20烃，例如饱和或不饱和的线性脂族C10-C18烃，
R2是-CH2-CH2-，或-CH2-CH2-和-CH2 (CH3) -CH2-的混合物，和
n为2-20，例如2-10或2-5。
磷酸单酯II和二酯III两者都是酸性化合物，具有可离解出的酸性氢。因此，本发明的磷酸酯乳化剂可以酸形式或中和形式(例如钠盐或钾盐或铵盐)提供。如果使用酸形式的乳化剂，可将碱适当地加入到水相中以将pH调节至接近中性，因为琼脂和琼脂糖在酸性条件下对降解敏感。除了单酯II和二酯III之外，乳化剂也可包含烷氧基化脂肪醇的相应磷酸三酯和游离的未酯化的烷氧基化脂肪醇。这两种化合物都是非酸性的，通常以少量存在，例如乳化剂的＜25 重量%或小于15 重量%。
特别地，乳化剂可以包含C10-C16烷醇的混合环氧乙烷+环氧丙烷加合物的磷酸单酯和磷酸二酯的混合物。这样的产品可以LubrhophosTM LF-800 (Solvay)的名称购得。或者，乳化剂可包含具有n =3 (每个油烯基醇的乙二醇单元平均数)的乙氧基化油烯基醇的磷酸单酯和磷酸二酯的混合物。这样的产品通常以INCI (化妆品成分国际命名法)名称油醇聚醚-3-磷酸酯(oleth-3-phosphate)为人所知，并且可以以商品名CrodafosTM O3A(Croda)商购。
实施例
乳化方法
在95℃制备35g琼脂糖在490 ml水中的溶液，随后在加入7.0 mM磷酸酯后冷却至70℃，得到pH 7.0。制备乳化剂在850 ml甲苯中的溶液，并在3L恒温夹套圆柱形玻璃反应器中加热到60℃。在用顶置式搅拌器搅拌下，在80 rpm搅拌下将琼脂糖溶液加入反应器中，并在60℃下以逐步增加的rpm继续搅拌，直到琼脂糖液滴尺寸为约100μm，这由取出的样品评价并通过激光衍射分析。在分析之前，用冰将这些样品快速冷却以避免任何聚结/聚集。然后将反应器夹套的温度降低至20℃以固化琼脂糖液滴。用甲苯和/或水洗涤得到的琼脂糖珠，倾析洗涤液，同时回收作为沉淀物的琼脂糖珠。
评价方法
使用Mastersizer 3000激光衍射仪(Malvern Panalytical)测量乙醇分散体中以乙基纤维素作为分散剂的琼脂糖珠的粒度分布。将分布绘制为微分体积对直径的曲线，并且通过仪器计算每个分布的众数。该众数是分布的峰，即在分布曲线中看到的最高峰。因此，该众数代表最通常在分布中发现的粒度。在乳液冷却之前和之后两者取样，冷却之后的众数和冷却之前的众数之间的差值表示为Δ众数。这是冷却期间粒度增加的量度，指示在敏感冷却阶段期间发生聚结和/或聚集。
还在显微镜中在珠中的内含物(其可由油包水包油双重乳液形成产生)和球形方面视觉评价珠，其中球形的偏差可能是由于液滴的部分聚结。图2-4显示了聚集体、非球形珠和具有内含物的珠的实例。
乳化剂
表1.所用乳化剂
产品名称
供应商
化学结构
脂肪醇部分
环氧乙烷单元(n)
Lubrhophos LF-800
Solvay
C10-16乙氧基化/丙氧基化的磷酸酯
C10-16
Lubrhophos LB-400
Solvay
聚氧乙烯油烯基醚磷酸酯
C16-18:1
5
Rhodafac PA/32
Solvay
聚氧乙烯油烯基醚磷酸酯
C16-18:1
2
Rhodafac PA/35
Solvay
聚氧乙烯油烯基醚磷酸酯
C16-18:1
5
Crodafos SG-LQ
Croda
PPG-5-鲸蜡醇聚醚-10 磷酸酯
C16
10(PO5)
Crodafos O10A
Croda
油醇聚醚-10 磷酸酯(oleth-10-phosphate)
C18:1
10
Crodafos O3A
Croda
油醇聚醚-3 磷酸酯
C18:1
3
Crodafos CS2A
Croda
鲸蜡硬脂醇聚醚-2 磷酸酯
C16-18
2
Lakeland PAE 185
Lakeland
乙氧基化十八烷醇5 EO的磷酸酯
C18
5
Hostaphat KL340D
Clariant
月桂基聚乙氧基(4EO)磷酸酯
C12
4
Rhodafac RM-510
Solvay
二壬基酚乙氧基化物磷酸酯
10
SPAN 60
Croda
脱水山梨糖醇单硬脂酸酯
SPAN 80
Croda
脱水山梨糖醇单油酸酯
SPAN 120
Croda
脱水山梨糖醇异硬脂酸酯
实施例1-乳化剂比较
表2.乳化结果
乳化剂
甲苯相中乳化剂浓度(wt./vol%)
内含物 (Y/N)
球形(Y/N)
乳化时间 (min)
最大搅拌速度 (rpm)
冷却前的众数 (µm)
Δ众数(µm)
Lubrhophos LF-800
0.016
N
Y
1450
234
57
Lubrhophos LF-800
0.05
N
Y
157
1350
103
35
Lubrhophos LF-800
0.08
N
Y
105
1450
96
8
Lubrhophos LF-800
0.16
N
Y
800
19
17
Lubrhophos LF-800
0.20
N
Y
800
15
6
Lubrhophos LB-400
0.016
Y
N
106
1500
177
143
Lubrhophos LB-400
0.05
N
Y
168
1350
106
86
Lubrhophos LB-400
0.16
N
Y
100
1450
97
17
Rhodafac PA/32
0.16
Y
Y
151
1600
108
20
Rhodafac PA/35
0.16
N
Y
108
1550
108
12
Crodafos SG-LQ
0.16
N
N
144
1600
115
98
Crodafos SG-LQ
0.16
N
N
118
1550
103
45
Crodafos O10A
0.16
Y
N
148
1650
161
548
Crodafos O3A
0.16
N
Y
87
1300
102
5
Crodafos CS2A
0.16
N
Y
70
1250
21
2
Lakeland PAE 185
0.16
Y
N
153
1650
125
130
Hostaphat KL340D
0.16
N
Y
64
1200
112
34
Rhodafac RM-510
0.16
N
Y
74
1350
96
25
Span 60
0.2
Y
N
218
1550
778
176
Span 80
0.1
Y
N
156
1250
559
Span 80
0.2
Y
N
148
1200
810
Span 80
0.5
Y
N
195
1600
218
123
Span 80
2
N
Y
70
1250
99
5
Span 120
0.2
Y
N
139
1250
907
Span 120
0.5
N
Y
118
1450
413
-102
Span 120
2.3
N
Y
111
1450
100
7
基本上，所有测试的材料都起乳化剂的作用。然而它们之间存在差异。非离子乳化剂，例如三种脱水山梨糖醇酯，必须以2%的浓度使用以得到良好的结果。这意味着在回收过程中必须从珠中洗出大量的乳化剂，这是不希望的，特别是因为那些乳化剂是不溶于水的并且必须用溶剂洗出。可以以较低浓度(低于0.2%)使用磷酸酯，并且其通常是可溶于水的。用Lubrhophos LF-800、Lubrhophos LB-400、Rhodafac PA/35、Crodafos CS2A和CrodafosO3A获得了特别好的结果，选择Lubrhophos LF-800和Crodafos O3A作为最佳候选物。Rhodafac RM-510也得到良好的结果，但由于环境原因不被选择，因为它基于烷基酚乙氧基化物。
实施例2-2-甲基环己酮作为溶剂
如上进行两个实验，但用2-甲基环己酮代替甲苯。乳化剂是Lubrhophos LF-800，乳化剂的量分别为0.017 wt./vol. %。%和0.23 wt./vol. %。达到100 µm 的目标粒度，且珠的视觉外观良好。但是在冷却期间发生一些聚集。
本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，并且还使本领域技术人员能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统以及进行任何结合的方法。本发明的可专利范围由权利要求限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其他实例。如果这样的其它实例具有与权利要求的字面语言没有不同的结构元件，或者如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差异的等同结构元件，则旨在这样的其它实例处于权利要求的范围内。本文中提到的所有专利和专利申请通过引用以其整体并入本文，如同单独并入一样。