一种埃博拉病毒包膜糖蛋白的优势表位肽、其编码基因及应用
阅读说明：本技术 一种埃博拉病毒包膜糖蛋白的优势表位肽、其编码基因及应用 (Dominant epitope peptide of Ebola virus envelope glycoprotein, coding gene and application thereof ) 是由 杨琨 姜东伯 刘洋 孙报增 孙昊 孙元杰 杨舒雅 张溪洋 潘婧宇 胡尘辰 刘天玥 于 2021-09-06 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物免疫技术领域,具体涉及一种埃博拉病毒包膜糖蛋白的优势表位肽、其编码基因及应用。所述表位肽由SEQ ID NO.1-25所示序列组成。本发明通过ELISpot试验预测并验证了来源于EBOV GP的潜在表位,并对其在世界各地不同分离株中的保护性质进行了多种深入分析,以验证筛选出的优势分离株。我们进一步预测了这些表位与各自MHC I类分子合适位点的结合亲和力及其免疫原性,这将最终有助于理解EBOV GP的免疫生物学,并在未来完善针对该病毒的表位疫苗设计。(The invention belongs to the technical field of microbial immunity, and particularly relates to dominant epitope peptide of Ebola virus envelope glycoprotein, and a coding gene and application thereof. The epitope peptide consists of a sequence shown in SEQ ID NO. 1-25. The invention predicts and verifies potential epitopes derived from EBOV GP through ELISpot test, and carries out a plurality of deep analyses on the protection properties of the potential epitopes in different isolates around the world so as to verify the screened dominant isolate. We further predicted the binding affinity of these epitopes to the appropriate sites of the respective MHC class I molecules and their immunogenicity, which will ultimately help to understand the immunobiology of EBOV GP and to refine epitope vaccine design against this virus in the future.)
技术领域
本发明属于微生物免疫技术领域，具体涉及一种埃博拉病毒包膜糖蛋白的优势表位肽、其编码基因及应用。
背景技术
由埃博拉病毒导致的埃博拉病毒病最早出现在扎伊尔和苏丹邻近地区。埃博拉病毒属可进一步细分为5个物种，分别命名为：扎伊尔埃博拉病毒(Zaire ebolavirus，ZEBOV/EBOV)、苏丹埃博拉病毒(Sudan ebolavirus，SUDV)，塔伊森林埃博拉病毒(Forestebolavirus，TAFV)，本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyo ebolavirus，BDBV)和雷斯顿埃博拉病毒(Reston ebolavirus，RESTV)。人与人之间的传播可通过接触被感染物品以及粘膜或皮肤破损处暴露于传染性体液以及组织中造成。已在多种体液中发现有埃博拉病毒的存在，包括唾液、血液、母乳、粪便和精液等。此外，还存在多种潜在的传播途径，包括直接接触、污染物、飞沫传播以及气溶胶等。埃博拉病毒属于丝状病毒科家族，为非分节段负链RNA病毒，基因组大小约为19kb。基因组有7个基因，包括编码核蛋白(NP)、病毒蛋白(VP)35、VP40、VP24、VP30、聚合酶(L基因)和糖蛋白(GP)。糖蛋白GP被广泛认为是该病毒表面的唯一蛋白，介导与细胞表面的附着和结合。因此，GP被视为免疫活性最强的病毒靶点。
抗病毒CD8+效应T细胞应答的激活，需要抗原呈递细胞(APC)通过主要组织相容性复合体(MHC)I类分子呈递病毒抗原。CD8+T细胞对病毒肽的识别在抵抗病毒感染中发挥重要作用。但是，只有与MHC I类分子高亲和力、紧密结合的多肽才能表达在APC细胞表面，提呈给CD8+T细胞识别，从而引发免疫反应。因此，免疫原性表位对阐明抗病毒免疫至关重要。同时，抗原的保守性也对病原体与宿主相互作用以及建立群体免疫至关重要。进化的保守表位的存在对于病毒生存至关重要，因此无论其毒株如何，表位保守性对这些病毒的长期免疫可能提供广泛的防护。
最近，基于表位的策略已用于替代疫苗设计和免疫治疗。基于表位疫苗的合理设计是非常有前景的，因为它通过减少引起不良反应的病毒成分来提高安全性，同时可通过多表位联合覆盖广泛的人群，从而达到最终提高疫苗效率的目的。因此，筛选鉴定EBOV GP的优势表位肽，对埃博拉病毒的表位疫苗设计非常重要。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的之一是提供一种埃博拉病毒包膜糖蛋白的优势表位肽，所述表位肽由SEQ ID NO.1-25所示序列组成。
本发明的目的之二是提供编码所述优势表位肽的基因。
本发明的目的之三是提供所述的优势表位肽在制备埃博拉病毒表位疫苗中的应用。
本发明的目的之四是提供所述的基因在制备埃博拉病毒表位疫苗中的应用。
本发明的目的之五是提供利用所述优势表位肽制备的埃博拉病毒表位疫苗，其活性成分来自于所述的优势表位肽。
本发明的目的之六是提供利用所述基因制备的埃博拉病毒表位疫苗，其活性成分来自于所述的基因。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过ELISpot试验预测并验证了来源于EBOV GP(基因号：AY354458.1)的潜在表位。并对其在世界各地不同分离株中的保护性质进行了多种深入分析，以验证筛选出的优势分离株。我们进一步预测了这些表位与各自MHC I类分子合适位点的结合亲和力及其免疫原性，这将最终有助于理解EBOV GP的免疫生物学，并在未来完善针对该病毒的表位疫苗设计。
本发明的优势表位肽可视为能有效刺激机体细胞免疫应答的病毒亚单位，即病毒体功能所需的高度保守区。可由此来设计多肽疫苗，这个策略的目的是接种“由明确抗原组成的最小结构”来激发有效的特异性细胞免疫应答，具备传统疫苗不可比拟的优点，而且使用安全方便，在抗病毒过程中有着广泛的应用前景。
附图说明
图1为五种预测工具预测小鼠和人MHC I类亚型对EBOV GP的高亲和力优势表位数目。
图2为EBOV GP所有预测9肽的层次聚类分析，箭头所指方向表示亲和力由强到弱。
图3为不同MHC I类亚型与9肽的预测结合亲和力，图中，纵坐标为668条9肽，数字为9肽第一个氨基酸在GP序列中的位置；横坐标为小鼠和人MHC I类亚型，箭头所指方向表示亲和力由强到弱。
图4为EBOV GP的MHC I类限制性优势表位保守性分析。
图5为种间保守的优势表位与相应MHC I类分子对接模型。
图6为ELISpot试验验证有免疫原性的9肽优势表位筛选结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
埃博拉病毒包膜糖蛋白的优势表位肽的获得
Step1：氨基酸序列检索：
从NCBI GenBank数据库获得扎伊尔埃博拉病毒的糖蛋白(GP，登录号：AY354458.1)，作为各种生物信息学工具的输入，用于表位预测、保守性分析、分子对接和实验。
Step2：表位预测：
对于H2-Db、H2-Dd、H2-Kb、H2-Kd、H2-Kk和H2-Ld表位预测，推荐基于网络的工具，如IEDB方法(http://tools.iedb.org/mhci/)、来自免疫表位数据库的SMMPMBEC(http://tools.immuneepitope.org/mhci/)，NetMHCpan 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)，SYFPEITHI(http://www.syfpeit hi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)和Rankpep(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)用于预测。选择占总预测表位前2％的预测表位。最后，选择至少通过三种预测工具预测的表位进行后续深入分析。
人类主要白细胞抗原(HLA)-I类亚型等位基因表位，如HLA-A1(HLA-A*2601、-A*3001、-A*3002)、HLA-A2(HLA-A*0201、-A*0203、-A*0206、-A*6802)、HLA-A3(HLA-A*0301、-A*1101、-A*3001、-A*3101、-A*3301、-A*6801)，HLA-A24(HLA-A*2301、-A*2402、-A*3201)、HLA-B7(HLA-B*0702、-B*3501、-B*5101、-B*5301)、HLA-B8(HLA-B*0801)、HLA-B15(HLA-B*1501、-A*0101)、HLA-B44(HLA-B*4001、-B*4402、-B*4403)和HLA-B58(HLA-B*5701、-B*5801)，累积覆盖超过97％人群的MHC I类亚型，使用上述相同工具进行表位预测。最终，选择这些工具预测的各自亚型的所有前2％表位，并进行后续研究。
对于小鼠MHC I类亚型，在5种预测软件中出现3次及以上视为优势表位。对于人HLA I类亚型，所有出现在预测结果前2％的9肽均被视为优势表位。如上所述，使用多种计算工具进行生物信息学分析，以预测跨EBOV包膜糖蛋白具有不同结合亲和力的潜在MHC I类表位。分析小鼠H-2亚型(H2-Db、H2-Dd、H2-Kb、H2-Kd、H2-Kk和H2-Ld)和主要HLA I类亚型等位基因。EBOV包膜糖蛋白的9肽亲和力预测衍生了668个肽。图1列举出了每种预测工具产生优势表位的数目。重新计算排除重复9肽后，我们在H-2亚型中获得了42个优势表位，在HLA I类亚型中得到301个优势表位。在H-2亚型中，H2-Db和H2-Kk优势表位数目最多，都是12条9肽。在HLA I类亚型中，HLA-B7优势表位数目最多，为90条9肽，远多于其他8个HLA I类亚型。
Step3：多肽合成：
依据预测的多肽序列合成相应多肽，实验中使用的所有9肽由上海强耀生物科技有限公司完成，纯度为95％，1mg/肽。将合成好的多肽粉离心后，先加入20μL二甲基亚砜(DMSO)溶解后，再加入480μL无菌ddH2O混匀后冻存于-20℃冰箱备用。
Step4：计算机分析：
(1)9肽聚类分析：对668条9肽进行聚类分析，用于研究不同MHC I类分子在呈递抗原时的相似性。对NetMHCpan数据进行归一化处理后，使用pheatmap软件包(version1.0.12)进行双向层次聚类，表达式值用热图表示。图2显示不同MHC I类亚型间的差异。33个MHC I类分子被分为3组，包括H-2亚型组，HLA I类亚型组以及交叉反应组。在H-2组中，H2-Dd、H2-Db和H2-Kb对抗原呈递结果较为相似。在交叉反应组中，存在明显的区域差异。H2-Kd与HLA-A24(HLA-A*2301，-A*2402)得分相似；H2-Ld则与HLA-B7(HLA-B*0702，-B*3501，-B*5101，-B*5301)得分更为相似；H2-Kk抗原呈递与HLA-B44(HLA-B*4001，-B*4402，-B*4403)结果相似。而在HLA I类亚型组中对于同一9肽，不同HLA I类亚型之间得分相差不大，表明其呈递同一9肽的能力差异也较小。
(2)结合亲和力分析：为了探索9肽与MHC I类亚型之间的结合强度，用GraphPadPrism 8.0.1绘制33个MHC I类亚型和668个表位的分层热图(图3)以显示它们之间的关系。数据来自NetMHCPan的排名。该度量不受某些分子对较高或较低平均预测亲和力固有偏差的影响，因此是较为良好的指标。
从图中可以看出，表位结合强度总体上呈现区域性分布，其中1-28、163-190、217-244、352-379、568-595和649-668表位与MHC I类分子的结合亲和力强，而109-136、298-325、379-460和595-649表位与MHC I类分子的结合亲和力弱。
(3)免疫原性分析：在R studio环境中采用PAAQD2.0软件包对所有预测9肽表位进行免疫原性分析。免疫原性仅与多肽序列有关，与空间结构无关。若分析结果可能性>0.5，则认为该肽具有免疫原性，否则不具有免疫原性。高亲和力的多肽可能不能充分诱导免疫反应。抗原除了具有免疫反应性外，还应具有免疫原性。使用PAAQD软件包分析了所有EBOVGP预测9肽的免疫原性，根据其预测概率判断它们是否具有免疫原性。若可能性>0.5，则认为该肽具有免疫原性。因此，在668条EBOV GP预测9肽中有309条被判定为具有免疫原性。具体地说，在301个HLA I类亚型优势表位中有148个9肽具有免疫原性，在42个H-2亚型优势表位中有25个9肽具有免疫原性。
(4)保守性分析
为了确定预测表位在不同EBOV毒株蛋白序列之间的保守性，我们使用BLASTP工具对所有筛选的优势预测表位进行埃博拉病毒种间和种内保守性分析。种内保守的评判标准为除扎伊尔埃博拉病毒(1995)(taxid:128951)之外的扎伊尔埃博拉病毒(taxid:186538)。种间保守的评判标准为除扎伊尔埃博拉病毒(taxid:186538)之外的埃博拉病毒(taxid:186536)。在分析结果中，若E值<e-5，则认为该肽是保守的。因此可根据保守状态将优势表位分为四大类：种间-种内-；种间-种内+；种间+种内-；和种间+种内+。
多个序列比对确定了EBOV GP优势表位的保守状态。根据泛MHC I类限制性表位的保守性分析，图4列举了所有优势表位保守性分析统计结果。
对于泛MHC I类优势表位的分析统计结果，从图4中可以看出泛HLA I限制性优势表位比H-2限制性优势表位更为保守。这是因为HLA I中的结果总结了许多等位基因中的超家族，而H-2限制性表位的鉴定需要3/5算法的批准。同时，可以明显看出，优势表位显示出种间保守性强但种内保守性弱。
(5)肽-MHC分子对接
HPEPDOCK是一种新型的网络服务器，它通过输入9肽优势表位序列与MHC I类分子RDB格式文件即可模拟分子对接，从而获得对接模型。使用RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)即可获得相关MHC I类分子3D结构数据{HLA-A1[HLA-A*0206(3OXR)]，HLA-B7[HLA-B*0702(5EO1)，HLA-B*3501(1A9E)，HLA-B*5101(1E28)，HLA-B*5301(1A1N)]，HLA-B8[HLA-B*0801(4QRP)]，HLA-B15[HLA-B*1501(1XR9)，HLA-A*0101(4NQV)]，HLA-B44[HLA-B*4402(3KPL)]，H2-Ld(6L9M)，H2-Kb(6JQ3)，H2-Db(1JUF)}。每一条9肽与同一个MHC I类分子对接会产生100条模拟对接结构，但认为前10条模拟对接结构为计算机最重要的预测结果。
按照上述方法对结合亲和力进行评估，并进行9肽-MHC I类分子对接。分子对接后，获得了MHC I类等位基因及其对应优势表位的结合构象，以及各自的结合能与对接模型。我们选择了5种具有种间保守性的鼠类优势表位与相应的MHC I类分子对接。同时这5条优势表位也是人HLA I类亚型的优势表位，然后再模拟9肽与对应HLA I类分子对接。分数越低表明对接性能越好。每一条9肽对接时都会产生10个不同的模拟对接结构。
从对接结果表1可以看出，9肽GPCAGDFAF、GAFFLYDRL和TVIYRGTTF与一些人HLA I类亚型的对接分数比小鼠H-2等位基因的对接分数低，这表示这些9肽在人类免疫反应中表现或许会更出色。相比之下，其他两个表位FHKEGAFFL和LPQAKKDFF表现出相反的趋势，表达了它们与小鼠H-2等位基因结合的偏好。图5显示了具有更低对接得分的人HLA I类分子与相应9肽的对接模型，以及该9肽与对应小鼠MHC I类分子的对接模型。
表1对接结果
肽TELRTFSIL因其对应的小鼠MHC I类分子暂无相应的RDB文件，所以未进行该9肽与小鼠MHC I类分子的模拟对接。而对应的人HLA I类分子可进行对接模拟，故也将此对接模型放入图中。
Step5：酶联免疫斑点(ELISpot)试验验证：
使用无菌PBS溶液稀释人工合成的小鼠高亲和力9肽至终浓度为20μg/mL用于ELISpot试验。先用无菌PBS溶液稀释IFN-γ特异性捕获抗体至终浓度为5μg/mL后，按照每孔100μL的体积加入96孔板中4℃孵育过夜。再用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基室温封闭96孔板2h。将收集的小鼠脾细胞悬液裂解红细胞后，用含10％胎牛血清、1％双抗的RPMI1640培养基重悬脾细胞，按照每孔1×106个脾细胞数量加入96孔板中。再加入等体积稀释好的9肽，37℃、5％CO2培养箱中孵育24h。阴性对照为单纯含10％胎牛血清、1％双抗的RPMI1640培养基，阳性对照为10μg/mL的刀豆蛋白A(Con A)。孵育结束后用双蒸水和PBST洗板。洗涤后在孔中加入100μL终浓度为2μg/mL生物素化抗IFN-γ检测抗体并在室温孵育2h。用PBST洗涤后加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶(streptavidin-HRP)室温孵育1h。PBST洗涤后加入AEC底物显色并用水洗涤终止反应。待96孔板风干后用CTL-immunoSpot读板机对96孔板中斑点进行扫描计数。所有结果均显示为每106个脾细胞的斑点形成单位(SFU)平均值。条形图采用GraphPad Prism 8.0.1绘制。
人工合成25条具有免疫原性H-2限制性9肽优势表位肽(SEQ ID NO.1-25所示)用于ELISpot试验验证。用肽刺激pVAX-GPEBOV质粒免疫过的小鼠脾细胞，观察IFN-γ的分泌量。结果在图6中显示为每106个脾细胞的斑点形成单位(SFU)平均值。从图中可以看出BALB/c和C3H小鼠的脾细胞分别被25条9肽刺激后均可分泌IFN-γ。有趣的是，无论是受到H-2d还是H-2k限制性表位的刺激，BALB/c小鼠脾细胞分泌IFN-γ的量都多于C3H小鼠脾细胞分泌的IFN-γ量。
实施例2
埃博拉病毒包膜糖蛋白的优势表位肽的应用
本发明通过对EBOV GP上的优势MHC I类表位肽的预测和各项计算机分析以及ELISpot试验验证，为EBOV新型基因工程疫苗的研究奠定了基础。
经过上述实验研究发现：EBOV GP上的优势MHC I类表位肽能有效的刺激机体的细胞免疫应答反应。
近年来，国内外虽已研制出有关于EBOV的疫苗，但从应用情况来看，该类疫苗仍存在诸多不足，其中最重要的一点是刺激机体产生的细胞免疫应答欠佳，以及存在着一定的安全隐患。采用本发明方法筛选出来的EBOV GP优势MHC I类表位肽，若将其应用在刺激机体细胞免疫应答反应中，将具有以下优点：
1、病毒感染后，抗原提呈细胞(APC)通过MHC I类分子抗原呈递激活CD8+T细胞。对于MHC I类分子而言，其抗原结合槽两端被保守的酪氨酸残基堵塞，导致结合肽的大小通常限制在8-10个氨基酸残基。因此，我们选择了9个氨基酸肽作为预测表位。同时，由CTL介导的细胞免疫应答在抗病毒感染中起重要作用。CTL识别病毒感染细胞(靶细胞)后，通过释放穿孔素、颗粒酶和经过FasL-Fas途径，导致靶细胞裂解死亡，进而达到有效清除机体内病毒感染的作用。机体内某种病毒特异性CTL的水平及其活性与该病毒的清除效果呈正相关。
2、以往研究表明，中和抗体可特异性结合病毒阻止其感染宿主细胞，因此研究者们将大多数精力都投入在与EBOV GP特异性结合的中和抗体研究中。但是对于已经感染的宿主细胞而言，需要CD8+T细胞发挥细胞毒性作用将胞内感染的病毒清除。
3、肽预测方法用于预测每个9肽与特定MHC I类分子的结合亲和力。目前，预测肽亲和力的算法有很多不同的原理，因此我们使用多种预测方法来预测具有较强结合亲和力的多肽。同时，我们对所有预测的9肽进行了免疫原性分析，以消除高亲和力的非免疫原性表位。
4、在对9肽优势表位进行埃博拉病毒种间和种内保守性分析后，可以对优势表位进行简单分类。与其他表位相比，物种间保守的优势表位更适合用于疫苗的开发和免疫研究。将种间保守的优势小鼠表位与相应的小鼠MHC I类和人HLA I类分子进行模拟对接。这些抗原表位通过ELISpot试验验证表明能够引起小鼠脾细胞的免疫应答。
5、有研究用EBOV GP疫苗免疫志愿者后收集志愿者外周血单个核细胞(PBMC)进行ELISpot试验，并对志愿者进行HLA分型。研究结果表明，多肽TELRTFSIL和TVIYRGTTF能够诱导人T细胞释放IFN-γ。而这两个多肽均在我们预测的25个9肽优势表位中。表明小鼠与人具有共同的EBOV GP表位，提示本文预测的其他小鼠优势表位可能会被人HLA I类分子进行抗原呈递。
在本部分研究中，通过使用生物信息学方法对EBOV GP进行多肽亲和力预测、免疫原性分析以及保守性分析，同时还进行了多肽与MHC I类分子对接模拟以及实验验证软件预测结果，为后续埃博拉病毒相关免疫学研究提供了另一种思路，有助于未来设计基于表位的抗EBOV表位疫苗。同时，高亲和力肽预测及后续相关分析的方法还可用于其他病原体的基础免疫研究和传染病预防控制。此外，也有文献证明表位预测可用于癌症的治疗及干预。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 第四军医大学
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<120> 一种埃博拉病毒包膜糖蛋白的优势表位肽、其编码基因及应用
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