一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物及其应用、试剂盒
阅读说明：本技术 一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物及其应用、试剂盒 (Antigen polypeptide composition for immune detection of SARS-CoV-2 infected cell, application and kit thereof ) 是由 王子腾 王新明 吴文娟 贺卓 赵兵杰 晋高伟 于 2021-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物及其应用、试剂盒。本发明抗原多肽组合物能够特异性地刺激CD4～(+)、CD8～(+)细胞分泌IFN-γ,用于SARS-CoV-2检测具有较高的灵敏度和特异性,且CD4～(+)、CD8～(+)联合检测可更为准确的反映被检测者对SARS-CoV-2抗原的细胞免疫状态,进而可配合抗体及核酸结果对患者感染SARS-CoV-2后患病的严重程度、治疗效果以及疫苗接种后的保护效应做出评估。(The invention relates to the technical field of biological medicine, in particular to an antigen polypeptide composition for immune detection of SARS-CoV-2 infected cells, and application and a kit thereof. The antigen polypeptide composition of the invention can specifically stimulate CD4 + 、CD8 + IFN-gamma is secreted by cells, has higher sensitivity and specificity when being used for SARS-CoV-2 detection, and CD4 + 、CD8 + The combined detection can more accurately reflect the cell immune state of a detected person to SARS-CoV-2 antigen, and further can be matched with antibody and nucleic acid results to make evaluation on the severity of the patient infected with SARS-CoV-2, the treatment effect and the protective effect after vaccination.)
技术领域
本发明涉及新冠病毒检测技术领域，尤其涉及一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物及其应用、试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒肺炎是一种由新型冠状病毒引起的急性传染病，患者和无症状感染者是主要传染源，主要传播途径是呼吸道传播和密切接触传播。宿主对SARS-CoV-2感染的体液和细胞免疫是决定患者预后的关键因素。
目前已开发出的SARS-CoV-2感染诊断试剂盒按检测目标可以分为两类：一类是检测病毒的核酸，针对病原体；一类是检测对应的抗体，针对体液免疫。二者均不能对患者的细胞免疫反应做出相应判断。
γ干扰素体外释放试验可一定程度的反应细胞免疫水平，目前在免疫平台上主要利用抗原刺激T细胞中的CD4+细胞产生γ干扰素，但仅依靠CD4+细胞反应水平只能对患者是否感染某一病原体进行判断，难以对患者感染某一病原体的严重程度、治疗效果、相关疫苗的保护效应等做出较为准确的评估。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物及其应用、试剂盒。抗原多肽组合物能够能够特异性地刺激CD4+、CD8+细胞分泌IFN-γ，用于SARS-CoV-2检测具有较高的灵敏度和特异性，且CD4+、CD8+联合检测可更为准确的反映被检测者对SARS-CoV-2抗原的细胞免疫状态。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
1、一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物，包括I)～IV)中至少一种：
I)、氨基酸序列如SEQID.No.1所示的NP抗原表位肽；
和氨基酸序列如SEQID.No.2所示的S1抗原表位肽；
II)、氨基酸序列如SEQID.No.3～5所示的NP抗原表位肽；
III)、氨基酸序列如SEQID.No.6～9所示的S1抗原表位肽。
具体地，I)所述的抗原多肽，即组1，为与HLA I类分子、HLA II类分子均能结合的病毒抗原多肽组，主要作用于CD8+、CD4+细胞，共包含两种多肽，分别编号为S-1、N-2，所述S-1多肽源自S蛋白，序列为：NNCTFEYVSQPFLMDLEGK(SEQID.No.1)；所述N-2多肽源自N蛋白，序列为：KMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGL(SEQID.No.2)；
II)所述的抗原多肽，即组2，为与HLA I类分子结合的病毒抗原多肽组，主要作用于CD8+细胞，共包含三种多肽，分别编号为N-1、N-3、ORF-1，所述N-1多肽源自N蛋白，序列为：MSDNGPQNQRNAPRITFGGP(SEQID.No.3)；所述N-3多肽源自N蛋白，序列为：DQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKK(SEQID.No.4)；所述ORF-1多肽源自ORF蛋白，序列为：LHSYFTSDYYQLYS(SEQID.No.5)；
III)所述的抗原多肽，即组2，为与HLA II类分子结合的病毒抗原多肽组，主要作用于CD4+细胞，共包含四种多肽，分别编号为S-2、S-3、M-1、M-2，所述S-2多肽来源为S蛋白，序列为：CSNLLLQYGSFCTQLNRA(SEQID.No.6)；所述S-3多肽源自S蛋白，序列为：LTDEMIAQYTSALLAGTIT(SEQID.No.7)；所述M-1多肽源自M蛋白，序列为：LVIGAVILRGHLRIAGHHLGRC(SEQID.No.8)；所述M-2多肽源自M蛋白，序列为：VATSRTLSYYKLGASQRVAGDS(SEQID.No.9)。
一些优选实施方案中，所述抗原多肽组合物包括组合物1和组合物2，其中，组合物1为I)～III)所示的抗原表位多肽。其中的各抗原表位多肽等比例混合；各抗原表位多肽的溶液浓度为0.02-0.1mg/ml，具体可为0.02mg/ml、0.04mg/ml或0.1mg/ml。组合物2为II)所示的抗原表位多肽，其中的各抗原表位多肽等比例混合；各抗原表位多肽的溶液浓度为0.02-0.1mg/ml，具体可为0.02mg/ml、0.04mg/ml或0.1mg/ml。
实验表明，利用本发明所述的抗原多肽组合物能够能够特异性地刺激CD4+、CD8+细胞分泌IFN-γ，用于SARS-CoV-2检测具有较高的灵敏度和特异性，且CD4+、CD8+联合检测可更为准确的反映被检测者对SARS-CoV-2抗原的细胞免疫状态。
基于以上结果，本发明还提供了所述抗原多肽组合物在制备用于体外检测SARS-CoV-2特异性细胞免疫反应的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种检测SARS-CoV-2特异性细胞免疫反应的试剂盒，包括细胞培养试剂和IFN-γ抗原检测试剂；
所述细胞培养试剂包括权利要求1所述的抗原多肽组合物和缓冲液。
一些实施方案中，所述细胞培养试剂还包括阴性对照培养液，所述阴性对照培养液包括缓冲液、2-7wt％的葡萄糖、体积分数为1-5vol％甘油，pH＝7.35。
一些实施方案中，所述细胞培养试剂还包括阳性对照培养液；所述阳性对照培养液包括缓冲液和0.8-4.8mg/ml的植物血凝素，用于非特异性的刺激细胞分泌IFN-γ。
本发明所述细胞培养试剂中，所用的缓冲液为PBS缓冲液和/或HEPES缓冲液。在一些具体实施例中具体为PBS缓冲液。
一些实施方案中，所述IFN-γ抗原检测试剂包括偶联有IFN-γ包被抗体的磁微粒混悬液、以辣根过氧化物酶(HRP)标记的IFN-γ标记抗体作为示踪物的酶结合物；以校准品以及化学发光底物液、条码卡。IFN-γ包被抗体和IFN-γ标记抗体识别IFN-γ抗原上不同的抗原表位，形成双夹心结构。
其中，所述磁微粒的直径为0.5～4um，所述抗IFN-γ抗体共价偶联在所述磁性微粒上，所述抗IFN-γ抗体的工作浓度为0.5-1.5ug/ml。
所述抗IFN-γ抗体为鼠源单克隆抗体。所述抗IFN-γ抗体结合人血浆中γ-干扰素(IFN-γ)，可形成抗原抗体免疫复合物。
所述条码卡可被全自动化学发光仪AutoLumo A2000等仪器的配套软件识别，用于校准曲线标定。
所述化学发光底物液包括底物A液和底物B液，其中底物A液为异鲁米诺衍生物，底物B液为过氧化氢。
所述校准品为混合IFN-γ抗原高值血浆，由下述方法得到：将人新鲜外周血混合，以10:1添加阳性对照培养液(P)进行培养16-24h；培养后离心抽取上层血浆后得到所述混合IFN-γ抗原高值血浆。校准品的浓度为0:0IU/ml；1：0.15IU/ml；2:0.5IU/ml；3:1IU/ml；4:3IU/ml；5:10IU/ml，依次编号为0、1、2、3、4、5，用于定量测定γ-干扰素(IFN-γ)抗原浓度，可配合条码卡用于申请人公司的全自动化学发光仪AutoLumoA2000等仪器的配套软件识别。
一些实施方案中，本发明试剂盒还包括细胞培养孔板和细胞培养管，所述细胞培养管的管身设有识别条码。所述细胞培养孔板为聚丙乙烯材质(PS)材质；所述细胞培养管为聚对苯二甲酸乙二醇酯材质(PET)材质。
本发明提供的抗原组合物一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物，其特征在于，包括I)～IV)中至少一种：I)、氨基酸序列如SEQID.No.1所示的NP抗原表位肽；和氨基酸序列如SEQID.No.2所示的S1抗原表位肽；II)、氨基酸序列如SEQID.No.3～5所示的NP抗原表位肽；III)、氨基酸序列如SEQID.No.6～9所示的S1抗原表位肽。本发明还提供了所述抗原多肽组合物在制备用于体外检测SARS-CoV-2细胞免疫反应的检测试剂中的应用，以及检测SARS-CoV-2特异性细胞免疫反应的试剂盒，其中，本发明试剂盒在细胞培养采用IGRA法，IFN-γ抗原检测采用双抗夹心法，实验表明，本发明抗原多肽组合物能够特异性的刺激CD4+、CD8+细胞分泌IFN-γ，用于SARS-CoV-2检测具有较高的灵敏度和特异性，且CD4+、CD8+联合检测可更为准确的反映被检测者对SARS-CoV-2抗原的细胞免疫状态，进而可配合抗体及核酸结果对患者感染SARS-CoV-2后患病的严重程度、治疗效果以及疫苗接种后的保护效应做出评估。
具体实施方式
本发明提供了一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物及其应用、试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1本发明试剂盒及检测方法
本发明试剂盒包括如下组分：
表1
阴性对照培养液(N)：向pH＝7.35的PBS缓冲液中加入葡萄糖和甘油，制得含葡萄糖2-7％、甘油1-5％的缓冲液。
阳性对照培养液(P)：含0.8-4.8mg/ml植物血凝素(PHA)的PBS缓冲液。
测试培养液(T1)：向PBS缓冲液中添加SARS-CoV-2特异性CD4+、CD8+的组1～组3的抗原多肽的测试培养液。各抗原等比例混合，浓度范围为0.02-0.1mg/ml。
测试培养液(T2)：向PBS缓冲液中添加SARS-CoV-2特异性CD8+的组2抗原多肽的测试培养液。各抗原等比例混合，各抗原的浓度为0.02-0.1mg/ml。
其中，组1抗原多肽为与HLA I类分子、HLA II类分子均能结合的病毒抗原多肽组，主要作用于CD8+、CD4+细胞，共包含两种多肽，分别编号为S-1、N-2，所述S-1多肽源自S蛋白，序列为：NNCTFEYVSQPFLMDLEGK(SEQID.No.1)；所述N-2多肽源自N蛋白，序列为：KMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGL(SEQID.No.2)；
组2抗原多肽为与HLA I类分子结合的病毒抗原多肽组，主要作用于CD8+细胞，共包含三种多肽，分别编号为N-1、N-3、ORF-1，所述N-1多肽源自N蛋白，序列为：MSDNGPQNQRNAPRITFGGP(SEQID.No.3)；所述N-3多肽源自N蛋白，序列为：DQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKK(SEQID.No.4)；所述ORF-1多肽源自ORF蛋白，序列为：LHSYFTSDYYQLYS(SEQID.No.5)；
所述组3为与HLA II类分子结合的病毒抗原多肽组，主要作用于CD4+细胞，共包含四种多肽，分别编号为S-2、S-3、M-1、M-2，，所述S-2多肽来源为S蛋白，序列为：CSNLLLQYGSFCTQLNRA(SEQID.No.5)；所述S-3多肽源自S蛋白，序列为：LTDEMIAQYTSALLAGTIT(SEQID.No.6)；所述M-1多肽源自M蛋白，序列为：LVIGAVILRGHLRIAGHHLGRC(SEQID.No.7)；所述M-2多肽源自M蛋白，序列为：VATSRTLSYYKLGASQRVAGDS(SEQID.No.8)。
校准品的制备：校准品为含有混合IFN-γ抗原的高值血浆，由下述方法得到：将人新鲜外周血混合，以10:1添加阳性对照培养液(P)进行培养16-24h；培养后离心抽取上层血浆后得到所述混合IFN-γ抗原高值血浆。
检测方法如下：
(一)利用以上四种培养液分别培养人新鲜外周静脉抗凝血，通过测定四种培养液刺激出的IFN-γ浓度，判断测试培养液(T1)，测试培养液(T2)的特异性细胞免疫反应强弱。
(二)IFN-γ的体外释放
1)采集采用静脉穿刺术，使用经无菌工艺处理的肝素钠或肝素锂抗凝真空采血管采集全血样本，采集量不低于5mL。
2)培养液的分装：
细胞培养孔板：在生物安全柜内将阴性对照培养液(N)、测试培养液(T1)、测试培养液(T2)和阳性对照培养液(P)按照手柄标示添加到至细胞培养板相应孔内，100μL/孔；
细胞培养管：可省略此步。
3)全血分装：
细胞培养孔板：全血采集后在采血管中轻柔颠倒混匀3～5次，8小时之内在生物安全柜内将其分装到细胞培养板相应孔内(含有“N”、“P”、“T1”、“T2”培养液各100μL)，1.0mL/孔；
细胞培养管：全血采集后在采血管中轻柔颠倒混匀3～5次，8小时之内在生物安全柜内将其分装到一组对应细胞培养管，1.0mL/孔。
4)培养：盖紧细胞培养板上盖/旋紧细胞培养管盖，迅速放入37℃电热恒温培养箱培养16～24小时，培养过程中保持细胞培养板平放，不能颠倒。
5)收集：
细胞培养孔板：培养结束后，将细胞培养板放置于平整桌面上，静置1分钟小心开盖，从每个细胞培养板孔中吸取上清进行IFN-γ检测。注意不可吸到细胞层，防止溶血。
细胞培养管：培养结束后，将细胞培养管3000-4000转离心10分钟，放置于平整桌面上，从每个细胞培养管中吸取上清进行IFN-γ检测。注意不可吸到细胞层，防止溶血。离心后步骤亦可通过申请人公司的全自动化学发光仪AutoLumo A2000等仪器自动执行。
IFN-γ的检测
6)在反应容器(以下简称“孔”)中依次加入校准品(用于定标)和培养后的上清，加样量均为100μl/孔。
7)每孔分别加入磁微粒混悬液20μL。
8)每孔分别加入酶结合物50μL。
9)混匀后37℃温育34分钟。
10)清洗液洗涤5次。
11)每孔加入发光底物A液和发光底物B液各50μL。
12)混匀后1～5分钟检测发光强度。
13)6-12步骤可通过申请人公司的全自动化学发光仪AutoLumo A2000等仪器自动执行。
结果计算
14)选择适当的曲线拟合方式进行结果计算，本试剂盒优选四参数拟合方式，以校准品浓度值为x轴，以校准品发光值的log值为y轴建立定标曲线。根据待测样本的发光值回算相应的浓度值。可通过以下两种方式对结果进行判读：
判读方式1：
(测试培养液(T1、T2)结果-阴性对照培养液(N)结果)/(阳性对照培养液(P)结果-阴性对照培养液(N)结果)；
(测试培养液(T2)结果-阴性对照培养液(N)结果)/(测试培养液(T1)结果-阴性对照培养液(N)结果)
判读方式2：
测试培养液(T1、T2)结果-阴性对照培养液(N)结果；
阳性对照培养液(P)结果-阴性对照培养液(N)结果。
感染与非感染鉴别检测/轻重症提示检测：选用判读方式1，后续实施例中以(测试培养液(T1)结果-阴性对照培养液(N)结果)/(阳性对照培养液(P)结果-阴性对照培养液(N)结果)或(测试培养液(T2)结果-阴性对照培养液(N)结果)/(阳性对照培养液(P)结果-阴性对照培养液(N)结果)＞2％为感染阳性，以(测试培养液(T2)结果-阴性对照培养液(N)结果)/(测试培养液(T1)结果-阴性对照培养液(N)结果)＜30％为重症提示。感染/接种疫苗人群的细胞免疫反应强度检测：选用判读方式2后续实施例中以测试培养液(T1)结果-阴性对照培养液(N)结果或测试培养液(T2)结果-阴性对照培养液(N)结果＞0.438IU/ml提示针对SARS-CoV-2病毒存在较强的细胞免疫反应。
实施例2
为验证本发明所述基于IFN-γ释放试验检测人新鲜外周静脉抗凝血中SARS-CoV-2特异性细胞免疫反应的试剂盒在SARS-CoV-2感染检测方面的作用，本实施例以临床确诊新冠肺炎患者为实验组，以健康人为对照组，进行验证。
在武汉市某医院，进行临床验证，检测了97份确诊(已治愈)患者新鲜全血肝素样本，所述97份确诊(已治愈)样本包含15例重症患者和82例轻症患者，并检测了40份健康人新鲜全血肝素样本作为对照。选用判读方式1，以2％为界值，结果如表2、表3所示：
表2
表3
结果显示，本发明试剂盒灵敏度和特异性均超过90％，重症患者与轻症患者在T2检测结果与T1检测结果的比值上表现出了较为明显的差别，可配合其他方法学对感染严重程度做出更为全面的评估。
实施例3
本案例以健康人接种疫苗为实验组，以健康人未接种疫苗为对照组，验证本发明实施例1的试剂盒在SARS-CoV-2疫苗接种中的应用。
在郑州市，检测了7份接种疫苗的健康人(接种第2针后3天)新鲜全血肝素样本，19例健康人未接种疫苗的新鲜全血肝素样本。选用判读方式2，以0.1IU/ml为界值，结果如表4所示，其中，RBD-Ab为病毒RBD区域结合的抗体。
表4
注：编号1-7为健康人接种疫苗(接种第2针后3天)后特异性细胞免疫反应与抗体结果；编号8-26为健康人未接种疫苗。
由以上结果可知，本发明试剂盒在健康人接种疫苗(接种第2针后3天)后和健康人未接种疫苗上表现出了较为明显的差别，且细胞免疫反应在个别个体中出现早于抗体反应(如编号6样本)。整体细胞免疫反应与抗体反应呈现正相关性，可配合抗体检测对疫苗保护效应提供更为全面的评估。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 一种SARS-CoV-2感染细胞免疫检测的抗原多肽组合物及其应用、试剂盒
<130> MP21004405
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu
1 5 10 15
Glu Gly Lys
<210> 2
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Pro Glu Ala Gly Leu
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro
20
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe
1 5 10 15
Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys
20
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu His Ser Tyr Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
1 5 10 15
Arg Ala
<210> 7
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
1 5 10 15
Thr Ile Thr
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly
1 5 10 15
His His Leu Gly Arg Cys
20
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln
1 5 10 15
Arg Val Ala Gly Asp Ser
20