具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解，本公开内容不限于描述的特定方法和实验条件，因为这样的方法和条件可以变化。还应该理解，本文所用术语仅用于描述特定实施方案的目的，且无意进行限制，因为本公开内容的范围将仅由所附权利要求书限制。

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与该技术所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。本文中使用的术语“约”，当用于提及特定列举的数值时，意指所述值可以与列举的值相差不超过1％。例如，如本文中使用的，表述“约100”包括99和101以及它们之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料都可以用于实践或试验本发明，但现在描述优选的方法和材料。在本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物通过引用整体并入本文。

MET蛋白

本文中使用的表述“MET”、“c-Met”等表示人跨膜受体酪氨酸激酶，其包含：(1)SEQID NO:145所示的氨基酸序列，和/或具有NCBI登记号NM_001127500.2所示的氨基酸序列，代表异形体“a”的未加工的前蛋白原，(2)SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列，和/或具有NCBI登记号NM_000236.2所示的氨基酸序列，代表异形体“b”的未加工的前蛋白原，(3)SEQID NO:147所示的氨基酸序列，和/或具有NCBI登记号NM_001311330.1所示的氨基酸序列，代表异形体“c”的未加工的前蛋白原，和/或(3)包含所有三种异形体共有的细胞质α亚基(SEQ ID NO:148)和跨膜β亚基(分别为异形体a、b和c的SEQ ID NO:149、150或151)的成熟蛋白。表述“MET”包括单体和多聚体MET分子。本文中使用的表述“单体人MET”是指不含或不具有任何多聚化结构域并且在正常条件下作为单个MET分子存在而不与另一个MET分子直接物理连接的MET蛋白或其部分。示例性单体MET分子是在本文中被称作“hMET.mmh”的分子，其包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列(参见，例如，本文实施例3)。本文中使用的表述“二聚体人MET”是指包含两个MET分子的构建体，所述MET分子通过接头、共价键、非共价键或通过多聚化结构域如抗体Fc结构域彼此连接。示例性二聚体MET分子是在本文中被称作“hMET.mFc”的分子，其包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列(参见，例如，本文实施例3)。

本文对蛋白、多肽和蛋白片段的所有提及意图表示各种蛋白、多肽或蛋白片段的人类形式，除非明确指出其来自非人物种。因此，表述“MET”是指人MET，除非指定来自非人物种，例如，“小鼠MET”、“猴MET”等。

本文中使用的表述“细胞表面表达的MET”是指在体外或体内细胞表面上表达使得MET蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的细胞外侧并且可接近抗体的抗原结合部分的一种或多种MET蛋白或其细胞外结构域。“细胞表面表达的MET”可以包含在通常表达MET蛋白的细胞表面上表达的MET蛋白或由其组成。可替换地，“细胞表面表达的MET”可以包含在细胞的表面上表达的MET蛋白或由其组成，所述细胞通常在其表面上不表达人MET，但是已经人工工程改造成在其表面上表达MET。

治疗眼癌的治疗方法

本文提供了治疗眼癌例如葡萄膜黑素瘤、眼眶淋巴瘤、视网膜母细胞瘤和髓上皮瘤的方法。在某些方面，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗组合物，其包含抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子(例如，包含本文表1所示的任何HCVR/LCVR或CDR序列的抗-MET，或包含本文表5所示的任何D1和D2组分的MET x MET双特异性抗原结合分子，或选自奥那妥组单抗、依玛妥珠单抗、特立妥珠单抗、SAIT301、ARGX-111、Sym015、HuMax-cMet和CE-355621的抗-MET抗体)。在某些实施方案中，所述抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子缀合至细胞毒性的化合物诸如拟美坦辛，如在下面详细描述的。治疗组合物可以包含本文中公开的任何抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子(包括缀合至细胞毒性剂的抗-MET ADC或MET x MET双特异性抗原结合分子)和药学上可接受的载体或稀释剂。

葡萄膜黑素瘤是成人最常见的恶性原发性眼内肿瘤。这些肿瘤可发生在脉络膜、虹膜和睫状体中，有时被称为虹膜或睫状体黑素瘤。葡萄膜黑素瘤具有高转移性。其它眼癌包括眼眶淋巴瘤、视网膜母细胞瘤和髓上皮瘤，后者可发生在睫状体和葡萄膜中。预期本文公开的方法可用于治疗眼癌诸如眼眶淋巴瘤、视网膜母细胞瘤和髓上皮瘤。在某些方面，治疗包括抑制或减轻来自原发肿瘤的侵袭和/或转移。

抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子及其药物缀合物尤其可用于治疗、预防和/或改善这样的任何疾病或障碍：其与MET表达、信号传递或活性有关或由MET表达、信号传递或活性介导，或可通过阻断MET和HGF之间的相互作用、或以其它方式抑制MET活性和/或信号传递、和/或促进受体内化和/或减少细胞表面受体数量来治疗。具体地，抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子、及其药物缀合物可用于治疗葡萄膜黑素瘤。治疗包括在受试者中减少葡萄膜黑素瘤肿瘤生长和/或引起葡萄膜黑素瘤的消退。治疗还包括抑制或减轻葡萄膜黑素瘤细胞的侵袭，或抑制或减轻葡萄膜黑素瘤从原发肿瘤的转移。

例如，本公开内容的抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子可用于治疗表达(或过表达)MET的葡萄膜黑素瘤。例如，抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子可用于治疗在眼睛中出现的原发性和/或转移性肿瘤。

这样，本文提供了一种在受试者中治疗眼癌、减少眼癌的生长、抑制或减轻侵袭和/或转移、和/或引起眼癌消退的方法。例如，本文提供了在受试者中治疗葡萄膜黑素瘤、减少葡萄膜黑素瘤肿瘤生长、抑制或减轻侵袭和/或转移、和/或引起葡萄膜黑素瘤消退的方法。在某些方面，眼癌(例如，葡萄膜黑素瘤)表达MET。在某些方面，所述方法包括给有此需要的受试者施用包含双特异性抗原结合分子和细胞毒素的抗体-药物缀合物(ADC)，其中所述双特异性抗原结合分子包含：第一抗原结合结构域(D1)；和第二抗原结合结构域(D2)；其中D1特异性地结合人MET的第一表位；且其中D2特异性地结合人MET的第二表位。

本文进一步提供了一种抑制葡萄膜黑素瘤细胞的增殖、抑制其侵袭、引起其细胞凋亡和/或降低其存活率的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使所述细胞与包含双特异性抗原结合分子和细胞毒素的抗体-药物缀合物(ADC)接触。在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子包含：第一抗原结合结构域(D1)；和第二抗原结合结构域(D2)；其中D1特异性地结合人MET的第一表位；且其中D2特异性地结合人MET的第二表位。

本文还进一步提供了一种诱导葡萄膜黑素瘤细胞的有丝分裂停止的方法。在某些实施方案中，所述方法包括使所述细胞与包含双特异性抗原结合分子和细胞毒素的抗体-药物缀合物(ADC)接触，其中所述双特异性抗原结合分子包含：第一抗原结合结构域(D1)；和第二抗原结合结构域(D2)；其中D1特异性地结合人MET的第一表位；且其中D2特异性地结合人MET的第二表位。

本文还提供了一种在遭受表达c-Met的肿瘤的受试者中治疗眼癌的方法。在某些实施方案中，所述方法包括给所述受试者施用双特异性抗原结合分子，其包含：第一抗原结合结构域(D1)；和第二抗原结合结构域(D2)；其中D1特异性地结合人MET的第一表位；且其中D2特异性地结合人MET的第二表位。在某些方面，所述双特异性抗原结合分子缀合至细胞毒素以形成抗体-药物缀合物(ADC)。在某些方面，所述细胞毒素是拟美坦辛。

在以下段落中提供了双特异性抗原结合分子的各个方面和细胞毒素的各个方面，尽管在本文别处有更详细的描述。

在某些方面，D1和D2不相互竞争对人MET的结合。在某些方面，人MET的第一表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸192-204。在某些方面，人MET的第二表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸305-315和421-455。在某些方面，人MET的第一表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸192-204；且人MET的第二表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸305-315和421-455。

在某些实施方案中，D1包含：在包含SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)内的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和在包含SEQ IDNO:138的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。在某些实施方案中，D2包含：在包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)内的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和在包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。

在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子包含在SEQ ID NO:58的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子包含在SEQ ID NO:18的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。

在某些方面，所述双特异性抗原结合分子D1包含：在包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)内的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和在包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。

在某些方面，D1 HCDR1包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；和LCDR3包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。

在某些方面，所述双特异性抗原结合分子D1包含：包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的HCVR；和包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的LCVR。

在某些方面，所述双特异性抗原结合分子D1包含：包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的HCVR；和包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的LCVR。

在某些方面，所述双特异性抗原结合分子D2包含：在包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(HCVR)内的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和在包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(LCVR)内的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。

在某些方面，所述双特异性抗原结合分子D2 HCDR1包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列；和LCDR3包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列。

在某些方面，所述双特异性抗原结合分子D2包含：包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的HCVR；和包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列的LCVR。

在某些方面，所述双特异性抗原结合分子D2包含：包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的HCVR；和包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的LCVR。

在本文提供的方法的某些实施方案中，所述细胞毒素选自生物毒素、化学治疗剂和放射性同位素。例如，所述细胞毒素可以选自拟美坦辛类、耳他汀类、托马霉素类、多卡米星类、²²⁵Ac、²²⁷Th、及其任何衍生物。在某些方面，所述细胞毒素通过接头缀合至双特异性抗原结合分子。

一种示例性的细胞毒素是：

其中是与接头的键。在某些方面，所述接头是：

其中用表示的键代表与所述双特异性抗原结合分子的键，并且用表示的键代表与所述细胞毒素的键。

另一种示例性的细胞毒素是：

其中是与所述接头的键。在某些方面，所述接头是

其中用表示的键代表与所述双特异性抗原结合分子的键，并且用表示的键代表与所述细胞毒素的键。

本文提供的方法可用于治疗眼部癌症或眼癌。在某些实施方案中，所述眼癌选自葡萄膜黑素瘤、眼眶淋巴瘤、视网膜母细胞瘤和髓上皮瘤。

在本文所述的治疗方法的背景下，抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子、及其药物缀合物可以作为单一疗法(即作为唯一的治疗剂)或与一种或多种另外的治疗剂(其实例在本文别处描述)组合施用。

抗-MET抗体及其抗原结合片段

更详细地，和根据一个方面，根据本文提供的方法有用的抗-MET抗体列于本文的表1和2中。表1列出了可以衍生出本文公开的双特异性抗原结合分子(在本文中可与双特异性抗原结合蛋白互换使用)的示例性抗-MET抗体的重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)、重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识符。表2列出了示例性抗-MET抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2 HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识符。

根据本文提供的方法也有用的是选自奥那妥组单抗、依玛妥珠单抗、特立妥珠单抗、SAIT301、ARGX-111、Sym015、HuMax-cMet和CE-355621的抗-MET抗体。

根据本文提供的方法也有用的是特异性地结合MET并激动(例如，激活)细胞中的MET信号传递途径的抗体或其抗原结合片段，以及这样的抗体在治疗场合中的用途，其中MET信号传递的激活将是有益的或治疗上有用的。这样的激动剂抗-MET抗体的非限制性实例包括在本文中被称作“H4H14636D”的抗体，以及包含重链和轻链CDR(SEQ ID NO:28、30、32、140、142、144)和/或其重链和轻链可变结构域(SEQ ID NO:26/138)的抗体及其抗原结合片段。

在本文中有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR，所述HCVR包含选自表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

在本文中有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含LCVR，所述LCVR包含选自表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

在本文中有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，该对包含与表1中列出的任何LCVR氨基酸序列配对的表1中列出的任何HCVR氨基酸序列。根据某些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含在表1中列出的任何示例性抗-MET抗体内所含的HCVR/LCVR氨基酸序列对。在某些实施方案中，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自SEQ ID NO:2/138、10/138、18/138、26/138、34/138、42/138、50/138、58/138、66/138、74/138、82/138、90/138、98/138、106/138、114/138、122/138和130/138。

也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR1(HCDR1)，其包含选自表1中列出的任何HCDR1氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR2(HCDR2)，其包含选自表1中列出的任何HCDR2氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR3(HCDR3)，其包含选自表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR1(LCDR1)，其包含选自表1中列出的任何LCDR1氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR1和LCDR1氨基酸序列对(HCDR1/LCDR1)，该对包含与表1中列出的任何LCDR1氨基酸序列配对的表1中列出的任何HCDR1氨基酸序列。根据某些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含在表1中列出的任何示例性抗-MET抗体内所含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方案中，所述HCDR1/LCDR1氨基酸序列对选自SEQ ID NO:4/140、12/140、20/140、28/140、36/140、44/140、52/140、60/140、68/140、76/140、84/140、92/140、100/140、108/140、116/140、124/140和132/140。

也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR2(LCDR2)，其包含选自表1中列出的任何LCDR2氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR2和LCDR2氨基酸序列对(HCDR2/LCDR2)，该对包含与表1中列出的任何LCDR2氨基酸序列配对的表1中列出的任何HCDR2氨基酸序列。根据某些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含在表1中列出的任何示例性抗-MET抗体内所含的HCDR2/LCDR2氨基酸序列对。在某些实施方案中，所述HCDR2/LCDR2氨基酸序列对选自SEQ ID NO:6/142、14/142、22/142、30/142、38/142、46/142、54/142、62/142、70/142、78/142、86/142、94/142、102/142、110/142、118/142、126/142和134/142。

也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链CDR3(LCDR3)，其包含选自表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

在本文中也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，该对包含与表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列配对的表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列。根据某些实施方案，抗体或其抗原结合片段包含在表1中列出的任何示例性抗-MET抗体内所含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。在某些实施方案中，所述HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自SEQ ID NO:8/144、16/144、24/144、32/144、40/144、48/144、56/144、64/144、72/144、80/144、88/144、96/144、104/144、112/144、120/144、128/144和136/144。

在本文中也有用的是特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段，其包含在表1中列出的任何示例性抗-MET抗体内所含的六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。在某些实施方案中，所述HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合选自SEQ ID NO:4-6-8-140-142-144、12-14-16-140-142-144、20-22-24-140-142-144、28-30-32-140-142-144、36-38-40-140-142-144、44-44-48-140-142-144、52-54-56-140-142-144、60-62-64-140-142-144、68-70-72-140-142-144、76-78-80-140-142-144、84-86-88-140-142-144、92-94-96-140-142-144、100-102-104-140-142-144、108-110-112-140-142-144、116-118-120-140-142-144、124-126-128-140-142-144和132-134-136-140-142-144。

在一个有关的实施方案中，特异性地结合MET且在本文公开的方法中有用的抗体或其抗原结合片段包含在表1中列出的任何示例性抗-MET抗体所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。例如，特异性地结合MET的抗体或其抗原结合片段包含在选自以下的HCVR/LCVR氨基酸序列对内所含的HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3氨基酸序列集合：SEQ ID NO:4-6-8-140-142-144、12-14-16-140-142-144、20-22-24-140-142-144、28-30-32-140-142-144、36-38-40-140-142-144、44-44-48-140-142-144、52-54-56-140-142-144、60-62-64-140-142-144、68-70-72-140-142-144、76-78-80-140-142-144、84-86-88-140-142-144、92-94-96-140-142-144、100-102-104-140-142-144、108-110-112-140-142-144、116-118-120-140-142-144、124-126-128-140-142-144和132-134-136-140-142-144。

用于鉴别在HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域众所周知的，且可以用于鉴别在本文公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于鉴别CDR的边界的示例性惯例包括，例如，Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义是基于序列变异性，Chothia定义是基于结构环区域的位置，且AbM定义是Kabat和Chothia方案之间的折中。参见，例如，Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,”National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。公开的数据库也可用于鉴别抗体内的CDR序列。

根据本文提供的方法也有用的是具有修饰的糖基化模式的抗-MET抗体。在某些实施方案中，可以使用修饰以除去不希望的糖基化位点，或者缺乏在寡糖链上存在的岩藻糖部分的抗体，例如，以增加抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人(2002)JBC 277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖基化的修饰以改变补体依赖性的细胞毒性(CDC)。

MET x MET双特异性抗原结合分子

本发明的发明人已经观察到，阻断HGF与MET结合的某些单特异性抗-MET抗原结合分子倾向于有效地激活MET信号传递(对治疗分子而言不希望的后果)。但是，本发明的发明人已经惊奇地发现，同时结合MET蛋白细胞外结构域上的两个单独表位的双特异性抗原结合分子可有效阻断配体与MET的结合，同时几乎不引起MET信号传递的激动作用。此外，本发明的发明人已经惊奇地发现，所述双特异性抗原结合分子特别适用于治疗眼癌诸如葡萄膜黑素瘤、眼眶淋巴瘤、视网膜母细胞瘤和髓上皮瘤和/或抑制或减轻转移。

因此，根据本文所述的方法有用的是包含第一抗原结合结构域(在本文中也被称作“D1”)和第二抗原结合结构域(在本文中也被称作“D2”)的双特异性抗原结合分子。双特异性抗原结合分子对两个单独MET表位的同时结合导致有效的配体阻断，同时MET信号传递的激活最小化。

包含特异性地结合人MET的第一表位的第一抗原结合结构域(D1)和特异性地结合人MET的第二表位的第二抗原结合结构域(D2)的双特异性抗原结合分子在本文中可以被称作“MET x MET双特异性抗体”、“MET x MET”或其它有关术语。在某些实施方案中，人MET的第一表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸192-204。在某些实施方案中，人MET的第二表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸305-315和421-455。在某些实施方案中，人MET的第一表位包含SEQID NO:155的氨基酸192-204；且人MET的第二表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸305-315和421-455。

在某些实施方案中，MET x MET双特异性抗体的D1和D2结构域彼此不竞争。在D1和D2之间关于结合MET的不竞争意味着，用于衍生出D1和D2的各种单特异性抗原结合蛋白彼此不竞争结合人MET。示例性抗原结合蛋白竞争测定是本领域已知的，其非限制性实例在本文其它地方描述。

在某些实施方案中，D1和D2结合MET上的不同的(例如，非重叠的或部分重叠的)表位，如本文别处所述。

使用两种单独的单特异性抗-MET抗体的抗原结合结构域，可以构建MET x MET双特异性抗原结合分子。例如，可以使用本领域已知的标准方法产生单克隆单特异性抗-MET抗体的集合。由此产生的各个抗体可以彼此成对测试与MET蛋白的交叉竞争。如果两种不同的抗-MET抗体能够同时结合MET(即，不相互竞争)，那么可以将来自第一抗-MET抗体的抗原结合结构域和来自第二非竞争性的抗-MET抗体的抗原结合结构域工程改造进根据本公开内容的单个MET x MET双特异性抗体中。

根据本公开内容，双特异性抗原结合分子可以是单个多功能多肽，或者它可以是两个或更多个彼此共价或非共价缔合的多肽的多聚体复合物。通过本公开内容将明显知道，任何能够同时结合MET分子的两个单独的不相同表位的抗原结合构建体均被视作双特异性抗原结合分子。如本领域普通技术人员已知的，使用标准的分子生物学技术(例如，重组DNA和蛋白表达技术)可以构建本文描述的任何双特异性抗原结合分子或其变体。

抗原结合结构域

在本文公开的方法中有用的双特异性抗原结合分子包含两个单独的抗原结合结构域(D1和D2)。本文中使用的表述“抗原结合结构域”是指能够特异性结合特定目标抗原(例如，人MET)的任何肽、多肽、核酸分子、支架型分子、肽展示分子或含多肽的构建体。本文中使用的术语“特异性结合”等意指抗原结合结构域与特定抗原形成复合物，其特征在于解离常数(K_D)为500pM或更低，并且在普通测试条件下不结合其它不相关抗原。“不相关抗原”是彼此具有小于95％氨基酸同一性的蛋白、肽或多肽。

可以在本公开内容的上下文中使用的抗原结合结构域的示例性类别包括抗体、抗体的抗原结合部分、与特定抗原(例如，肽体)特异性相互作用的肽、与特定抗原特异性相互作用的受体分子、包含特异性结合特定抗原的受体的配体结合部分的蛋白、抗原结合支架(例如，DARPins、HEAT重复蛋白、ARM重复蛋白、三十四肽重复蛋白和基于天然存在的重复蛋白的其它支架等[参见，例如，Boersma和Pluckthun,2011,Curr.Opin.Biotechnol.22:849-857，和其中引用的参考文献])、以及适体或其部分。

用于确定两个分子是否彼此特异性结合的方法是本领域众所周知的，包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。例如，如在本公开内容的上下文中使用的，抗原结合结构域包括结合特定抗原(例如，靶分子[T]或内化效应蛋白[E])或其部分的多肽，其中如在表面等离子体共振测定中所测得的，K_D小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约90pM、小于约80pM、小于约70pM、小于约60pM、小于约50pM、小于约40pM、小于约30pM、小于约20pM、小于约10pM、小于约5pM、小于约4pM、小于约2pM、小于约1pM、小于约0.5pM、小于约0.2pM、小于约0.1pM或小于约0.05pM。

本文中使用的术语“表面等离子体共振”表示一种光学现象，其允许通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度的改变来分析实时相互作用，例如使用BIAcore^TM系统(BiacoreLife Sciences division of GE Healthcare,Piscataway,NJ)。

本文中使用的术语“K_D”是指特定蛋白-蛋白相互作用(例如，抗体-抗原相互作用)的平衡解离常数。除非另外指出，否则本文公开的K_D值表示在25℃通过表面等离子体共振测定确定的K_D值。

如上面指出的，“抗原结合结构域”(D1和/或D2)可以包含抗体或抗体的抗原结合片段或由其组成。本文中使用的术语“抗体”是指包含至少一个与特定抗原(例如人MET)特异性结合或相互作用的互补性决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四个多肽链(两个重(H)链和两个轻(L)链)的免疫球蛋白分子及其多聚体(例如，IgM)。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或V_H)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(C_L1)。V_H和V_L区域可以进一步细分为被称为互补性决定区(CDR)的高变异性区域，其散布有更保守的被称为框架区(FR)的区域。每个V_H和V_L由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在不同的实施方案中，本文提供的抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或可以是天然地或人工地修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并排(side-by-side)分析来定义氨基酸共有序列。

本文提供的双特异性抗原结合分子的D1和/或D2组分可包含全抗体分子的抗原结合片段或由其组成。本文中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或遗传工程改造的多肽或糖蛋白。使用任意合适的标准技术诸如蛋白水解消化或重组基因工程技术(其涉及操作和表达编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA)，可以从例如完整抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段。这样的DNA是已知的，和/或可以容易地从例如商业来源、DNA文库(包括，例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以被合成。可以对DNA测序，并化学地或通过使用分子生物学技术进行操作，例如，以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列为合适的构型，或导入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或删除氨基酸等。

抗原结合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补性决定区(CDR)诸如CDR3肽)或受限制的FR3-CDR3-FR4肽。其它经工程改造的分子，诸如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、双体、三体、四体、微体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也被包括在本文所用的表述“抗原结合片段”内。

抗体的抗原结合片段通常包括至少一个可变结构域。所述可变结构域可以具有任意大小或氨基酸组成，并且通常包括与一个或多个框架序列相邻或者与其在框架内的至少一个CDR。在具有与V_L结构域缔合的V_H结构域的抗原结合片段中，V_H和V_L结构域可以相对于彼此以任何合适的排列定位。例如，所述可变区可以是二聚体并含有V_H-V_H、V_H-V_L或V_L-V_L二聚体。可替换地，抗体的抗原结合片段可以含有单体V_H或V_L结构域。

在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。在本公开内容的抗体的抗原结合片段内可以发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)V_H-C_H1；(ii)V_H-C_H2；(iii)V_H-C_H3；(iv)V_H-C_H1-C_H2；(v)V_H-C_H1-C_H2-C_H3；(vi)V_H-C_H2-C_H3；(vii)V_H-C_L；(viii)V_L-C_H1；(ix)V_L-C_H2；(x)V_L-C_H3；(xi)V_L-C_H1-C_H2；(xii)V_L-C_H1-C_H2-C_H3；(xiii)V_L-C_H2-C_H3；和(xiv)V_L-C_L。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包括上面列出的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或者可以通过全长或部分铰链或接头区相连。铰链区可以由至少2个(例如5、10、15、20、40、60或更多个)氨基酸组成，其导致在单个多肽分子中的相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性的或半柔性的连接。此外，抗原结合片段可以包含彼此非共价结合和/或与一个或多个单体V_H或V_L结构域非共价结合(例如，通过二硫键)的上文列出的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)。

在本文提供的方法中有用的双特异性抗原结合分子可以包含人抗体和/或重组人抗体或其片段或由其组成。本文中使用的术语“人抗体”包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。尽管如此，人抗体还可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机的或位点特异性的体外诱变或体内体细胞突变而导入的突变)，例如在CDR中且特别是在CDR3中。但是，本文中使用的术语“人抗体”不意图包括这样的抗体：其中从另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系衍生出的CDR序列已经移植至人框架序列上。

在本文提供的方法中有用的双特异性抗原结合分子可以包含重组人抗体或其抗原结合片段或由其组成。本文中使用的术语“重组人抗体”意图包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的所有人抗体，诸如使用转染进宿主细胞中的重组表达载体(在下面进一步描述)表达的抗体，从重组的组合人抗体文库(在下面进一步描述)分离的抗体，从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor等人(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287-6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、建立或分离的抗体。这样的重组人抗体具有从人种系免疫球蛋白序列衍生出的可变区和恒定区。但是，在某些实施方案中，对这样的重组人抗体进行体外诱变(或，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因而重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是这样的序列：其尽管源自人种系V_H和V_L序列和与人种系V_H和V_L序列有关，但是不可能天然存在于体内人抗体种系谱系内。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的，并且可以用于构建本文公开的双特异性抗原结合分子。可以在本公开内容的上下文中使用的示例性双特异性形式包括、但不限于，例如，基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合体、双重可变结构域(DVD)-Ig、四源杂交瘤(quadroma)、凸起-进入-孔洞、共同轻链(例如，具有凸起-进入-孔洞的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab²双特异性形式(关于前述形式的综述，参见，例如，Klein等人.2012,mAbs 4:6,1-11，和其中引用的参考文献)。

可以被包括在本文提供的MET x MET双特异性抗原结合分子中的示例性抗原结合结构域(D1和D2)包括从本文公开的任何抗-MET抗体衍生出的抗原结合结构域。例如，在如本文所述的治疗葡萄膜黑素瘤的方法中有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含HCVR，所述HCVR包含选自表1中列出的任何HCVR氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含LCVR，所述LCVR包含选自表1中列出的任何LCVR氨基酸序列的氨基酸序列、或与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，该对包含与表1中列出的任何LCVR氨基酸序列配对的表1中列出的任何HCVR氨基酸序列。根据某些实施方案，有用的MET x MET双特异性抗原结合分子包含D1或D2抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含在表1中列出的任何示例性抗-MET抗体内所含的HCVR/LCVR氨基酸序列对。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含重链CDR1(HCDR1)，其包含选自表1中列出的任何HCDR1氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含重链CDR2(HCDR2)，其包含选自表1中列出的任何HCDR2氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，其包含选自表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含轻链CDR1(LCDR1)，其包含选自表1中列出的任何LCDR1氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含轻链CDR2(LCDR2)，其包含选自表1中列出的任何LCDR2氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含轻链CDR3(LCDR3)，其包含选自表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列的氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本类似序列。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，该对包含与表1中列出的任何LCDR3氨基酸序列配对的表1中列出的任何HCDR3氨基酸序列。根据某些实施方案，本公开内容提供了抗体或其抗原结合片段，其包含在表1中列出的任何示例性抗-MET抗体内所含的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含在表1中列出的任何示例性抗-MET抗体内所含的六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。

根据本文提供的方法也有用的是包含D1或D2抗原结合结构域的MET x MET双特异性抗原结合分子，所述抗原结合结构域包含由表1中列出的任何示例性抗-MET抗体定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对所含的六个CDR的集合(即，HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。

在本文提供的方法中有用的MET x MET双特异性抗原结合分子可以包含衍生自表1的任何抗-MET抗体的D1抗原结合结构域和衍生自表1的任何其它抗-MET抗体的D2抗原结合结构域。MET x MET双特异性抗体的非限制性实例描绘于图1中。图1是示出272种示例性MET x MET双特异性抗体的组分的矩阵。矩阵的每个编号单元(编号1至272)表示包含“D1”抗原结合结构域和“D2”抗原结合结构域的独特双特异性抗体，其中所述D1抗原结合结构域包含来自沿Y轴列出的相应抗-MET抗体的免疫球蛋白可变结构域(HCVR/LCVR氨基酸序列对)或CDR，并且其中所述D2抗原结合结构域包含来自沿X轴列出的相应抗-MET抗体的免疫球蛋白可变结构域(HCVR/LCVR氨基酸序列对)或CDR。因此，例如，在矩阵中显示的MET xMET双特异性抗原结合分子“编号10”包含来自示例性抗-MET抗体H4H13290P2的包含HCVR/LCVR对或6-CDR集合的D1抗原结合结构域，和来自示例性抗-MET抗体H4H13321P2的包含HCVR/LCVR对或6-CDR集合的D2抗原结合结构域。本文提供的MET x MET双特异性抗体的其它例子描述于本文的实施例4中。

根据本文提供的方法有用的示例性MET x MET双特异性抗原结合分子包含D1抗原结合结构域和D2抗原结合结构域，其中所述D1抗原结合结构域包含SEQ ID NO:58/138的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包含SEQ ID NO:60-62-64-140-142-144的重链和轻链CDR的集合(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，且其中所述D2抗原结合结构域包含SEQ IDNO:82/138的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包含SEQ ID NO:84-86-88-140-142-144的重链和轻链CDR的集合(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。具有这些序列特征的示例性MET x MET双特异性抗体是命名为H4H14639D的双特异性抗体，也被称作双特异性抗体No.122，其包含衍生自H4H13306P2的D1和衍生自H4H13312P2的D2(参见本文实施例4、表5)。

作为另一个非限制性的示例性实施例，在本文中有用的MET x MET双特异性抗原结合分子包含D1抗原结合结构域和D2抗原结合结构域，其中所述D1抗原结合结构域包含SEQ ID NO:18/138的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包含SEQ ID NO:20-22-24-140-142-144的重链和轻链CDR的集合(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)，且其中所述D2抗原结合结构域包含SEQ ID NO:82/138的HCVR/LCVR氨基酸序列对，或包含SEQ ID NO:84-86-88-140-142-144的重链和轻链CDR的集合(HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)。具有这些序列特征的示例性MET x MET双特异性抗体是命名为H4H14635D的双特异性抗体，也被称作双特异性抗体No.42，其包含衍生自H4H13295P2的D1和衍生自H4H13312P2的D2(参见本文实施例4、表5)。

多聚化组分

在某些实施方案中，根据本文提供的方法有用的双特异性抗原结合分子也可以包含一种或多种多聚化组分。多聚化组分可以起作用以维持抗原结合结构域(D1和D2)之间的缔合。本文中使用的“多聚化组分”是能够与具有相同或相似结构或构成的第二多聚化组分缔合的任何大分子、蛋白、多肽、肽或氨基酸。例如，多聚化组分可以是包含免疫球蛋白C_H3结构域的多肽。多聚化组分的非限制性实例是免疫球蛋白的Fc部分，例如选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG以及每个同种型组内的任何同种异型的Fc结构域。在某些实施方案中，多聚化组分是Fc片段或长度为1至约200个氨基酸的氨基酸序列，其含有至少一个半胱氨酸残基。在其它实施方案中，多聚化组分是半胱氨酸残基或含半胱氨酸的短肽。其它多聚化结构域包括包含亮氨酸拉链、螺旋环基序或卷曲螺旋基序或由其组成的肽或多肽。

在某些实施方案中，所述双特异性抗原结合分子包含两个多聚化结构域M1和M2，其中D1连接至M1并且D2连接至M2，并且其中M1与M2的缔合促进在单个双特异性抗原结合分子中D1和D2与彼此的物理连接。在某些实施方案中，M1和M2彼此相同。例如，M1可以是具有特定氨基酸序列的Fc结构域，且M2是具有与M1相同的氨基酸序列的Fc结构域。可替换地，M1和M2可以在一个或多个氨基酸位置彼此不同。例如，M1可以包含第一免疫球蛋白(Ig)C_H3结构域，且M2可以包含第二Ig C_H3结构域，其中第一和第二Ig C_H3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与具有相同M1和M2序列的参考构建体相比，至少一个氨基酸差异会降低靶向构建体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，M1的Ig C_H3结构域结合蛋白A并且M2的Ig C_H3结构域含有降低或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号的H435R)。M2的C_H3可进一步包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU的Y436F)。可以存在于M2的C_H3内的其它修饰包括：在IgG1 Fc结构域的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2 Fc结构域的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU的N384S、K392N和V422I)；和在IgG4 Fc结构域的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。

根据本文提供的方法有用的双特异性抗原结合分子可以是“分离的”。本文中使用的“分离的双特异性抗原结合分子”是指已经从其自然环境的至少一种组分鉴定和分离和/或回收的双特异性抗原结合分子。例如，为了本公开内容的目的，已从生物体的至少一种组分或从在其中产生抗体的组织或细胞分离或移出的双特异性抗体是“分离的双特异性抗体”。分离的双特异性抗原结合分子还包括在重组细胞内的原位分子。分离的双特异性抗原结合分子是已经进行至少一个纯化或分离步骤的分子。根据某些实施方案，分离的双特异性抗原结合分子可以基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。

与衍生出抗原结合蛋白或抗原结合结构域的相应种系序列相比，根据本文提供的方法有用的双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)可以在重链和轻链可变结构域的框架区和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可得自例如公共抗体序列数据库的种系序列进行对比，可以容易地确定这样的突变。双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)衍生自本文中公开的任何氨基酸序列，其中在一个或多个框架区和/或CDR区内的一个或多个氨基酸被突变成衍生出所述抗体的种系序列的对应残基，或被突变成另一个人种系序列的对应残基，或被突变成对应种系残基的保守氨基酸置换(这样的序列变化在本文中统称为“种系突变”)。

本领域普通技术人员从本文公开的重链和轻链可变区序列出发可容易地产生众多双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)，其包含一个或多个个体种系突变或其组合。在某些实施方案中，在V_H和/或V_L结构域内的所有框架和/或CDR残基被回复突变为在衍生出所述抗体的原始种系序列中发现的残基。在其它实施方案中，仅某些残基被回复突变为原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸内或FR4的后8个氨基酸内存在的突变残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内存在的突变残基。在其它实施方案中，框架和/或CDR残基中的一个或多个被突变成不同种系序列的对应残基(即，与最初衍生出所述抗体的种系序列不同的种系序列)。

此外，在本文中有用的双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)可以含有在框架区和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些单独残基被突变成特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其它残基被维持或被突变成不同种系序列的对应残基。一旦获得，可以容易地测试含有一个或多个种系突变的双特异性抗原结合分子,或其抗原结合结构域(D1和/或D2)的一种或多种所需特性，例如提高的结合特异性、增加的结合亲和力、提高或增强的拮抗或激动生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。预见到以这种一般方式获得的双特异性抗原结合分子或其抗原结合结构域(D1和/或D2)是在本文中有用的。

变体

在本文中也有用的是抗-MET抗体和双特异性抗原结合分子，其包含本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的变体。被包括在该方面内的示例性变体包括本文中公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一种的变体，其具有一个或多个保守置换。例如，本公开内容包括抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子，其HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列相对于本文表1所示的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸置换。

示例性的变体包括与本文公开的任何HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有实质序列同一性的变体。如本文在氨基酸序列的上下文中所使用的，术语“实质同一性”或“实质相同的”是指，两个氨基酸序列，当最佳比对时，例如通过使用默认缺口权重的程序GAP或BESTFIT，共享至少95％、98％或99％序列同一性。在某些实施方案中，不相同的残基位置因保守氨基酸置换而不同。“保守氨基酸置换”是这样的置换：其中一个氨基酸残基被置换为另一个含有具有类似化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基。一般而言，保守氨基酸置换不会实质上改变蛋白的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列彼此差别在于保守置换的情况下，可以向上调节序列同一性百分比或相似性程度以校正置换的保守性质。进行这种调整的手段是本领域技术人员众所周知的。参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331，通过引用并入本文。含有具有相似化学性质的侧链的氨基酸组的例子包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸盐和谷氨酸盐，和(7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替换地，保守替换是在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445(通过引用并入本文)中公开的PAM250 log-似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”替换是在PAM250 log似然矩阵中具有非负值的任何变化。

通常使用序列分析软件测量两个不同氨基酸序列之间的序列同一性。序列分析软件使用分配给各种置换、缺失和其它修饰(包括保守氨基酸置换)的相似性量度来匹配相似序列。例如，GCG软件含有程序诸如GAP和BESTFIT，其可以与默认参数一起用来确定密切相关的多肽(例如来自不同生物物种的同源多肽)之间或野生型蛋白和其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见，例如，GCG 6.1版。使用FASTA(GCG 6.1版中的一个程序)使用默认或推荐的参数，也可以对比多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了在查询和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)出处同上)。当将本文提供的序列与含有来自不同生物的大量序列的数据库进行对比时，另一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见，例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，各自通过引用并入本文。

包含FC变体的抗-MET抗体和MET X MET双特异性抗原结合分子

根据本文提供的某些实施方案，在本文中有用的抗-MET抗体和MET xMET双特异性抗原结合蛋白包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个突变，所述突变增强或减弱抗体与FcRn受体的结合，例如与中性pH相比在酸性pH。例如，这样的变体包括在Fc结构域的C_H2或C_H3区中包含突变的抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其中所述突变增加Fc结构域在酸性环境中(例如，在pH范围为约5.5至约6.0的胞内体中)对FcRn的亲和力。当将抗体施用于动物时，这样的突变可导致抗体的血清半衰期的增加。这样的Fc修饰的非限制性实例包括，例如，在位置250(例如，E或Q)；250和428(例如，L或F)；252(例如，L/Y/F/W或T)、254(例如，S或T)和256(例如，S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或在位置428和/或433(例如，H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如，H/F或Y)处的修饰；或在位置250和/或428处的修饰；或在位置307或308(例如，308F、V308F)和434处的修饰。在一个实施方案中，修饰包含428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L、259I(例如，V259I)和308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；和307和/或308修饰(例如，308F或308P)。

因此，在本文中有用的是抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含Fc结构域，所述Fc结构域包含选自以下的一个或多个突变对或突变组：250Q和248L(例如，T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如，M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如，M428L和N434S)；和433K和434F(例如，H433K和N434F)。前述Fc结构域突变的所有可能组合和在本文公开的抗体可变结构域内的其它突变都被涵盖在本公开内容的范围内。

在本文中有用的抗原结合分子的生物学特征

根据本文提供的方法有用的是抑制葡萄膜黑素瘤细胞的增殖、抑制其侵袭、引起其细胞凋亡和/或降低其存活率的抗体及其抗原结合片段、以及包含抗体和抗原结合片段的ADC。

根据本文提供的方法也有用的是影响葡萄膜黑素瘤细胞的细胞周期的抗体及其抗原结合片段、以及包含抗体和抗原结合片段的ADC。在某些方面，所述细胞经历有丝分裂停止。在某些方面，所述细胞保持在SubG1期，指示所述细胞正在经历细胞凋亡。

根据本文提供的方法也有用的是在葡萄膜黑素瘤细胞中引起细胞凋亡的抗体及其抗原结合片段、以及包含抗体和抗原结合片段的ADC。在某些方面，所述葡萄膜黑素瘤细胞表现出PARP切割。在某些方面，所述葡萄膜黑素瘤细胞表现出组蛋白H3磷酸化。

根据本文提供的方法也有用的是以高亲和力结合单体人MET的抗体及其抗原结合片段。例如，本公开内容包括以小于约230nM的K_D结合单体人MET(例如，hMET.mmh)的抗-MET抗体，如在25℃或37℃通过表面等离子体共振所测得的，例如使用如本文实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定。根据某些实施方案，提供了结合单体人MET的抗-MET抗体，其在37℃具有小于约230nM、小于约200nM、小于约150nM、小于约100nM、小于约50nM、小于约25nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约8nM、小于约6nM、小于约5nM、小于约4nM或小于约3nM的K_D，如通过表面等离子体共振所测得的，例如使用如本文实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定。

这样的抗体及其抗原结合片段以大于约1分钟的解离半衰期(t1/2)结合单体人MET(例如，hMET.mmh)，如在25℃或37℃通过表面等离子体共振所测得的，例如，使用如本文实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定。这样的抗-MET抗体在37℃以大于约1分钟、大于约2分钟、大于约4分钟、大于约6分钟、大于约8分钟、大于约10分钟、大于约12分钟、大于约14分钟、大于约16分钟、大于约18分钟或大于约20分钟或更长的t1/2结合单体人MET，如通过表面等离子体共振所测得的，例如，使用如本文实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定。

这样的抗体及其抗原结合片段以高亲和力结合二聚体人MET(例如，hMET.mFc)。例如，抗-MET抗体以小于约3nM的K_D结合二聚体人MET，如在25℃或37℃通过表面等离子体共振所测得的，例如，使用如本文实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定。根据某些实施方案，抗-MET抗体在37℃以小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约0.9nM、小于约0.8nM、小于约0.7nM、小于约0.6nM、小于约0.5nM、小于约0.4nM、小于约0.3nM或小于约0.25nM的K_D结合二聚体人MET，如通过表面等离子体共振所测得的，例如，使用如本文实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定。

这样的抗体及其抗原结合片段可以以大于约4分钟的解离半衰期(t1/2)结合二聚体人MET(例如，hMET.mFc)，如在25℃或37℃通过表面等离子体共振所测得的，例如，使用如本文实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定。根据某些实施方案，抗-MET抗体可以在37℃以大于约4分钟、大于约5分钟、大于约10分钟、大于约20分钟、大于约30分钟、大于约40分钟、大于约50分钟、大于约60分钟、大于约70分钟、大于约80分钟、大于约90分钟、大于约100分钟、大于约105分钟或更长的t1/2结合二聚体人MET，如通过表面等离子体共振所测得的，例如，使用如本文实施例3中定义的测定形式，或基本上相似的测定。

根据本文提供的方法也有用的是以大于约10分钟的解离半衰期(t1/2)结合二聚体人MET(例如，hMET.mFc)的MET x MET双特异性抗原结合蛋白，如在25℃或37℃通过表面等离子体共振所测得的，例如，使用如本文实施例5中定义的测定形式，或基本上相似的测定。根据某些实施方案，MET x MET双特异性抗原结合蛋白在37℃以大于约10分钟、大于约20分钟、大于约30分钟、大于约40分钟、大于约50分钟、大于约60分钟、大于约70分钟、大于约80分钟、大于约90分钟、大于约100分钟、大于约200分钟、大于约300分钟、大于约400分钟、大于约500分钟、大于约600分钟、大于约700分钟、大于约800分钟、大于约900分钟、大于约1000分钟、大于约1100分钟或更长的t1/2结合二聚体人MET，如通过表面等离子体共振所测得的，例如，使用如本文实施例5中定义的测定形式，或基本上相似的测定。

根据本文提供的方法也有用的是阻断HGF和MET之间的相互作用的抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合蛋白，例如，在体外配体结合测定中。根据本文提供的某些实施方案，MET x MET双特异性抗原结合蛋白阻断HGF与表达人MET的细胞的结合，并且在没有HGF信号传递存在下诱导最小的MET激活或不诱导MET激活。例如，MET x MET双特异性抗原结合蛋白在基于细胞的MET活性报告分子测定中表现出的MET激动剂活性程度是在使用仅包含D1或D2的单特异性抗体的等效活性报告分子测定中观察到的MET激动剂活性的小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于3％、小于2％或小于1％。

根据本公开内容有用的抗体和抗原结合蛋白可以具有一种或多种前述生物学特征，或其任何组合。所述抗体的生物学特征的前述列表并非旨在穷举。通过审阅本公开内容(包括本文中的工作实施例)，本领域普通技术人员会明白本文提供的抗体的其它生物学特征。

抗体-药物缀合物(ADC)

根据本文提供的方法有用的是抗体-药物缀合物(ADC)，其包含缀合至治疗部分(诸如细胞毒性剂、化疗药物或放射性同位素)的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白。

细胞毒性剂包括对细胞的生长、存活或繁殖有害的任何试剂，包括、但不限于微管蛋白相互作用剂和DNA损伤剂。根据本公开内容的该方面，可缀合至抗-MET抗体的合适细胞毒性剂和化学治疗剂的例子包括，例如，1-(2氯乙基)-1,2-二甲磺酰基酰肼、1,8-二羟基-二环[7.3.1]十三烷-4,9-二烯-2,6-二炔-13-酮、1-脱氢睾酮、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、9-氨基喜树碱、放线菌素D、鹅膏蕈碱、氨基蝶呤、蛇形菌素、蒽环类抗生素、安曲霉素(AMC)、耳他汀类、博来霉素、白消安、丁酸、卡奇霉素类(例如，卡奇霉素γ₁)、喜树碱、洋红霉素类、卡莫司汀、西马多丁类、顺铂、秋水仙碱、考布他汀类、环磷酰胺、阿糖胞苷、细胞松弛素B、更生霉素、柔红霉素、氨烯咪胺、二乙酰氧基戊基多柔比星、二溴甘露醇、二羟基炭疽菌素二酮、disorazoles、多拉司他汀(例如，多拉司他汀10)、多柔比星、多卡米星、棘霉素类、软珊瑚醇类、依米丁、埃博霉素类、埃斯波霉素、雌莫司汀类、溴化乙锭、依托泊苷、氟尿嘧啶类、格尔德霉素类、短杆菌肽D、糖皮质激素类、伊立替康类、驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂、来普霉素类、环氧长春碱类、利多卡因、洛莫司汀(CCNU)、拟美坦辛类、氮芥、美法仑、巯基嘌呤类、甲氨蝶呤类、甲氨蝶呤、普卡霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、N8-乙酰基精脒、鬼臼毒素类、普鲁卡因、普萘洛尔、喋啶类、嘌呤霉素、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯类(PBD)、根霉素类、链脲霉素、太利苏霉素类、泰素、替尼泊苷(tenoposide)、丁卡因、thioepachlorambucil、托马霉素类、托泊替康类、tubulysin、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨类和前述任何的衍生物。根据某些实施方案，缀合至抗-MET抗体的细胞毒性剂是拟美坦辛诸如DM1或DM4、托马霉素衍生物或多拉司他汀衍生物。根据某些实施方案，缀合至抗-MET抗体的细胞毒性剂是耳他汀诸如MMAE、MMAF或其衍生物。本领域已知的其它细胞毒性剂被包括在本公开内容的范围内，包括、例如，蛋白毒素诸如蓖麻蛋白、艰难梭菌(C.difficile)毒素、假单胞菌外毒素、蓖麻蛋白、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、异株腹泻毒蛋白、皂草素、美洲商陆毒素(即，商陆毒素和商陆皂甙元)和其它，诸如在Sapra等人,Pharmacol.&Therapeutics,2013,138:452-469中所述的那些。

在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是拟美坦辛，例如美坦辛的衍生物。合适的拟美坦辛包括DM1、DM4或其衍生物、立体异构体或同位素体。合适的拟美坦辛也包括、但不限于在WO 2014/145090A1、WO 2015/031396A1、US 2016/0375147A1和US 2017/0209591A1(通过引用整体并入本文)中公开的那些。

在某些实施方案中，所述拟美坦辛具有以下结构：

其中A是任选地被取代的亚芳基或亚杂芳基。

在某些实施方案中，所述拟美坦辛具有以下结构：

其中A是任选地被取代的亚芳基或亚杂芳基。

在某些实施方案中，所述拟美坦辛具有以下结构：

其中n是1-12的整数且R¹是烷基。

在某些实施方案中，所述拟美坦辛是：

在某些实施方案中，所述拟美坦辛是：

在某些实施方案中，所述拟美坦辛是：

根据本文提供的方法也有用的是抗体-放射性核素缀合物(ARC)，其包含与一种或多种放射性核素缀合的抗-MET抗体。可以在本公开内容的该方面的上下文中使用的示例性放射性核素包括、但不限于例如²²⁵Ac、²¹²Bi、²¹³Bi、¹³¹I、¹⁸⁶Re、²²⁷Th、²²²Rn、²²³Ra、²²⁴Ra和^90Y。

在某些实施方案中，ADC包含通过接头分子与细胞毒性剂(例如，上文公开的任何细胞毒性剂)缀合的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白。接头是将本文描述的抗体或抗原结合蛋白与治疗部分(例如细胞毒性剂)连接、联结或键合的任何基团或部分。合适的接头可以参见例如Antibody-Drug Conjugates and Immunotoxins；Phillips,G.L.,编；Springer Verlag:New York,2013；Antibody-Drug Conjugates；Ducry,L.,编；Humana Press,2013；Antibody-Drug Conjugates；Wang,J.,Shen,W.-C.,和Zaro,J.L.,编；Springer International Publishing,2015，每篇的内容通过引用整体并入本文。通常，本文描述的抗体缀合物的合适的结合剂接头是这样的接头，其足够稳定以利用抗体的循环半衰期，并且同时能够在抗原介导的缀合物内化后释放其有效负载。接头可以是可切割的或不可切割的。可切割的接头包括在内化后被细胞内代谢切割的接头，例如通过水解、还原或酶促反应切割。不可切割的接头包括在内化后通过抗体的溶酶体降解而释放附着的有效负载的接头。合适的接头包括、但不限于酸不稳定的接头、水解不稳定的接头、酶可切割的接头、还原不稳定的接头、自降解的(self-immolative)接头和不可切割的接头。合适的接头还包括、但不限于为或包含以下的那些：肽、葡萄糖醛酸苷、琥珀酰亚胺-硫醚、聚乙二醇(PEG)单元、腙、马来酰亚胺基-己酰基(mal-caproyl)单元、二肽单元、缬氨酸-瓜氨酸单元和对-氨基苄基(PAB)单元。

本领域已知的任何接头分子或接头技术可以用于产生或构建根据本公开内容有用的ADC。在某些实施方案中，所述接头是可切割的接头。根据其它实施方案，所述接头是不可切割的接头。可以在本公开内容的上下文中使用的示例性接头包括包含或由以下组成的接头：例如，MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、蛋白酶可切割接头中的二肽位点、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、蛋白酶可切割接头中的二肽位点、PAB(对氨基苄氧基羰基)、SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯)、SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸酯)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸盐)及其变体和组合。可以在本公开内容的上下文中使用的接头的其它例子提供于，例如，US 7,754,681和Ducry,Bioconjugate Chem.,2010,21:5-13,和其中引用的参考文献，它们的内容通过引用整体并入本文。

在某些实施方案中，所述接头在生理条件下是稳定的。在某些实施方案中，所述接头是可切割的，例如，在酶存在下或在特定pH范围或值下能够释放至少有效负载部分。在某些实施方案中，接头包含酶可切割的部分。示例性的酶可切割部分包括、但不限于肽键、酯键、腙和二硫键。在某些实施方案中，接头包含组织蛋白酶可切割的接头。

在某些实施方案中，所述接头包含不可切割的部分。

合适的接头还包括、但不限于与单个结合剂(例如抗体)的两个半胱氨酸残基化学键合的那些。这样的接头可用于模仿由于缀合过程而被破坏的抗体的二硫键。

在某些实施方案中，所述接头包含一个或多个氨基酸。合适的氨基酸包括天然的、非天然的、标准的、非标准的、蛋白原性的、非蛋白原性的和L-或D-α-氨基酸。在某些实施方案中，所述接头包含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸或瓜氨酸、其衍生物或其组合。在某些实施方案中，氨基酸的一个或多个侧链与侧链基团连接，如下所述。在某些实施方案中，所述接头包含缬氨酸和瓜氨酸。在某些实施方案中，所述接头包含赖氨酸、缬氨酸和瓜氨酸。在某些实施方案中，所述接头包含赖氨酸、缬氨酸和丙氨酸。在某些实施方案中，所述接头包含缬氨酸和丙氨酸。

在某些实施方案中，所述接头包含自降解的基团。自降解的基团可以是技术人员已知的任何这样的基团。在特定的实施方案中，自降解的基团是对氨基苄基(PAB)或其衍生物。有用的衍生物包括对氨基苄氧基羰基(PABC)。技术人员将认识到，自降解的基团能够进行化学反应，所述反应从有效负载释放接头的剩余原子。

在一些实施方案中，所述接头是：

其中是与抗体或抗原结合蛋白的键(例如，经由赖氨酸残基)且是与细胞毒性剂(例如，DM1)的键。在一些实施方案中，所述接头是：

其中是与抗体或抗原结合蛋白的键(例如，经由赖氨酸残基)且是与细胞毒性剂(例如，DM1)的键。在某些实施方案中，所述接头是：

在某些实施方案中，所述接头是：

在一些实施方案中，所述接头衍生自马来酰亚胺基甲基-4-反式-环己烷羧基琥珀酸酯：

在一些实施方案中，所述接头是：

其中是与抗体或抗原结合蛋白的键(例如，经由赖氨酸残基)且是与细胞毒性剂(例如，具有下式的化合物)的键：

根据公开的方法有用的分子包含ADC，其中接头通过在抗体或抗原结合分子内的特定氨基酸处的连接将抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白连接至药物或细胞毒素。可以在该方面的上下文中使用的示例性氨基酸连接，例如，赖氨酸(参见，例如，US 5,208,020；US 2010/0129314；Hollander等人,Bioconjugate Chem.,2008,19:358-361；WO2005/089808；US 5,714,586；US 2013/0101546；和US 2012/0585592)、半胱氨酸(参见，例如，US 2007/0258987；WO 2013/055993；WO 2013/055990；WO 2013/053873；WO 2013/053872；WO 2011/130598；US 2013/0101546；和US 7,750,116)、硒代半胱氨酸(参见，例如，WO 2008/122039；和Hofer等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2008,105:12451-12456)、甲酰基甘氨酸(参见，例如，Carrico等人,Nat.Chem.Biol.,2007,3:321-322；Agarwal等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,2013,110:46-51,和Rabuka等人,Nat.Protocols,2012,10:1052-1067)、非天然氨基酸(参见，例如，WO 2013/068874,和WO 2012/166559)和酸性氨基酸(参见，例如，WO 2012/05982)。接头也可以通过与碳水化合物(参见，例如，US 2008/0305497,WO 2014/065661,和Ryan等人,Food&Agriculture Immunol.,2001,13:127-130)和二硫键接头(参见，例如，WO 2013/085925,WO 2010/010324,WO 2011/018611,和Shaunak等人,Nat.Chem.Biol.,2006,2:312-313)的连接而缀合至抗原结合蛋白。还可以使用位点特异性的缀合技术来指导缀合至抗体或抗原结合蛋白的特定残基(参见，例如，Schumacher等人.J Clin Immunol(2016)36(增刊1):100)。位点特异性的缀合技术包括、但不限于通过转谷氨酰胺酶的谷氨酰胺缀合(参见例如，Schibli,Angew Chemie Inter Ed.2010,49,9995)。

根据某些实施方案，根据本文提供的方法有用的ADC包含在国际专利公开WO2014/145090中阐述的缀合至接头-药物组合物的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白(例如，化合物“7”，在本文中也被称作“M0026”并在下面描述)，其公开内容特此通过引用整体并入本文：

根据本文提供的方法也有用的是包含单特异性抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗体的抗体-药物缀合物，其中所述抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗体缀合至细胞毒性剂。在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是拟美坦辛。在某些实施方案中，所述拟美坦辛是具有下式的化合物：

其中n是1-12的整数且R¹是烷基。在某些实施方案中，所述拟美坦辛是

在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是拟美坦辛，且所述拟美坦辛通过不可切割的接头共价连接至抗体。在某些实施方案中，所述细胞毒性剂是拟美坦辛，且所述拟美坦辛通过可切割的接头共价连接至抗体。

在一个实施方案中，所述抗体缀合至：

其中是与抗体的键。

在一个实施方案中，所述抗体缀合至：

其中是与抗体的键。

在一个实施方案中，所述抗体缀合至：

其中是与抗体的键。

在一个实施方案中，所述抗体缀合至：

其中是与抗体的键。

在一个实施方案中，所述抗体缀合至具有以下结构的化合物的非对映异构体

其中所述非对映异构体的特征在于以(300MHz,CDCl₃)δ6.85(d,1H,J＝4Hz),6.72(m,1H),6.65(d,1H,J＝4Hz),6.44(dd,1H,J＝15Hz,11Hz),6.25(s,1H),5.67(dd,1H,J＝16Hz,9Hz),5.41(m,1H),4.79(d,1H,J＝11Hz),4.30(t,1H,J＝11Hz),3.72(m,2H),3.51(d,1H,J＝9Hz),3.37(m,4H),3.27(m,1H),3.23(s,3H),3.16-2.99(m,4H),2.85(m,7H),2.62(m,3H),2.39(ddd,1H,J＝19Hz,12Hz,4Hz),2.18(br m,2H),1.77(br m,3H),1.66(s,3H),1.60-1.47(m,4H),1.31(m,6H),1.05(m,2H),和0.82(s,3H)的δ位移为特征的¹H NMR。

在一个实施方案中，所述抗体缀合至具有以下结构的化合物的非对映异构体

其中所述非对映异构体的特征在于基本上如在图31中所示的¹H NMR。

在一个实施方案中，所述抗体缀合至具有以下结构的化合物：

该化合物通过包括下述步骤的方法制备：使

(i)式III的化合物：

(ii)式IV的化合物：

(iii)硅胶；与

(iv)包含有机溶剂和水的稀释剂接触。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是如本文所述的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白；

L是接头；

Pay是细胞毒性剂；且

n是1-10的整数。

在某些实施方案中，Ab是抗-MET抗体，其包含在SEQ ID NO:82/138的HCVR/LCVR氨基酸序列对内的CDR。在某些实施方案中，Ab是抗-MET抗体，其包含SEQ ID NO:82的HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:138的LCVR氨基酸序列。

在某些实施方案中，Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含在SEQ ID NO:58的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。在某些方面，所述MET x MET双特异性抗原结合蛋白进一步包含在SEQ ID NO:138的LCVR氨基酸序列内的CDR。在某些实施方案中，Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:58的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列。在某些方面，所述MET xMET双特异性抗原结合蛋白进一步包含SEQ ID NO:138的LCVR氨基酸序列。

在某些实施方案中，Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含在SEQ ID NO:18的D1-HCVR氨基酸序列内的CDR和在SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列内的CDR。在某些方面，所述MET x MET双特异性抗原结合蛋白进一步包含在SEQ ID NO:138的LCVR氨基酸序列内的CDR。在某些实施方案中，Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:18的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列。

在某些实施方案中，L是可切割的接头。在某些实施方案中，L是不可切割的接头。在某些实施方案中，L包含二肽。在某些实施方案中，L包含PAB部分。

在某些实施方案中，L包含具有以下结构的部分：

在某些实施方案中，L包含具有以下结构的部分：

在某些实施方案中，L包含具有以下结构的部分：

在某些实施方案中，L包含具有以下结构的部分：

在某些实施方案中，Pay是拟美坦辛。

在某些实施方案中，Pay是：

其中R¹是烷基。

在某些实施方案中，Pay是：

在某些实施方案中，Pay是：

在某些实施方案中，n是2至5的整数。

在某些实施方案中，-L-Pay是：

其中是与抗体的键。

在某些实施方案中，-L-Pay是：

其中是与抗体的键。

在某些实施方案中，-L-Pay是

其中是与抗体的键。

在某些实施方案中，-L-Pay是：

其中是与抗体的键。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是抗-MET抗体，其包含SEQ ID NO:82的HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:138的LCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗体的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是抗-MET抗体，其包含SEQ ID NO:82的HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:138的LCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗体的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是抗-MET抗体，其包含SEQ ID NO:82的HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:138的LCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗体的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是抗-MET抗体，其包含SEQ ID NO:82的HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:138的LCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗体的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:58的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:58的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:58的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:58的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:18的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:18的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:18的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。

在某些实施方案中，所述缀合物具有以下结构：

Ab-[L-Pay]_n

其中：

Ab是MET x MET双特异性抗原结合蛋白，其包含SEQ ID NO:18的D1-HCVR氨基酸序列和SEQ ID NO:82的D2-HCVR氨基酸序列；

L-Pay是

其中是与抗原结合蛋白的键；且n是2-5的整数。

使用本领域普通技术人员已知的缀合条件(参见，例如，Doronina等人.NatureBiotechnology 2003,21,7,778，其通过引用整体并入本文)，可以制备在本文中有用的抗体药物缀合物。在某些实施方案中，如下制备抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白抗体药物缀合物：使本文描述的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白与包含期望接头和细胞毒性剂的化合物接触，其中所述接头具有可与抗体或抗原结合蛋白反应的部分，例如在抗体或抗原结合蛋白的期望残基处。

在某些实施方案中，用于制备根据本文提供的方法有用的抗体-药物缀合物的方法包括，使本文描述的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白与具有下式A¹的化合物：

和水性稀释剂接触。

在某些实施方案中，式A¹的化合物以化学计量过量存在。在某些实施方案中，式A¹的化合物以5-6倍的化学计量过量存在。在某些实施方案中，水性稀释剂包含HEPES。在某些实施方案中，水性稀释剂包含DMA。

在某些实施方案中，式A¹的化合物是式A²或A³的化合物：

在某些实施方案中，式A²或A³的化合物是立体异构纯的。在某些实施方案中，式A¹的化合物包含式A²或A³的化合物，其中A²或A³的化合物以超过50％的非对映异构体过量存在。在某些实施方案中，所述非对映异构体过量是超过70％。在某些实施方案中，所述非对映异构体过量是超过90％。在某些实施方案中，所述非对映异构体过量是超过95％。

术语“非对映异构体过量”表示期望的单一非对映异构体的摩尔分数与组合物中剩余的非对映异构体相比的差异。如下计算非对映异构体过量：(单一非对映异构体的量)-(其它非对映异构体的量)/1。例如，含有90％的1和10％的2、3、4或其混合物的组合物具有80％[(90-10)/1]的非对映异构体过量。含有95％的1和5％的2、3、4或其混合物的组合物具有90％[(95-5)/1]的非对映异构体过量。含有99％的1和1％的2、3、4或其混合物的组合物具有98％[(99-1)/1]的非对映异构体过量。对于1、2、3或4中的任何一种，可以类似地计算非对映异构体过量。

在某些实施方案中，如下制备式A¹的化合物，在有硅胶和稀释剂存在下使式(a)的化合物：

与式(b)的化合物

接触。在某些实施方案中，所述稀释剂包含有机溶剂和水。

本发明还提供了通过以下方法制备的产物：

(i)在有硅胶和稀释剂存在下，使式(a)的化合物：

与式(b)的化合物接触：

以合成中间体；和

(ii)使本文描述的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白与所述中间体和水性稀释剂接触。

在某些实施方案中，本发明提供了制备抗体-药物缀合物的方法，其包括使本文描述的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合蛋白与具有下式B的化合物和水性稀释剂接触：

其中LG是离去基团。

在某些实施方案中，式B的化合物以化学计量过量存在。在某些实施方案中，式B化合物以5-6倍的化学计量过量存在。在某些实施方案中，水性稀释剂包含HEPES。在某些实施方案中，水性稀释剂包含DMA。在某些实施方案中，-C(O)-LG是酯，例如，NHS或三氟苯基酯。

在某些实施方案中，式B的化合物是式B¹的化合物：

在某些实施方案中，如下制备式B¹的化合物：使式C的化合物：

与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、肽偶联剂和有机稀释剂接触。合适的肽偶联剂包括对于与亲核体的反应而言激活(即，使具有反应性)羧酸部分的那些。在某些实施方案中，所述肽偶联剂是N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。在某些实施方案中，所述有机溶剂是二氯甲烷。

在某些实施方案中，如下制备式C的化合物：使式D的化合物：

与己二酸、肽偶联剂和有机溶剂接触。在某些实施方案中，所述肽偶联剂是2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)。在某些实施方案中，所述有机溶剂包含二氯甲烷。可以如在WO2014/145090中所述制备化合物D。

表位作图和有关的技术

抗体和抗原结合结构域所结合的表位可以由MET蛋白的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单个连续序列组成。可替换地，相关表位可以由MET的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。在某些实施方案中，表位位于MET的配体结合结构域上或附近。在其它实施方案中，表位位于MET的配体结合结构域之外，例如，在MET表面上的位置，在该位置抗体当与这样的表位结合时不干扰HGF与MET的结合。

如本文别处所述，MET x MET双特异性抗原结合分子的各个抗原结合结构域(D1和D2)可以相对于彼此结合不同的、或非重叠的、或部分重叠的表位。本文中使用的“部分重叠的表位”是指，通过本领域已知的任何表位作图方法(例如，X-射线晶体学、丙氨酸扫描诱变、氢/氘交换[HDX]、结构域切换等)所确定的，第一和第二表位共享少于5个、少于4个、少于3个或仅一个共同的氨基酸。D1和D2结构域可能彼此不具有竞争性。例如，在某些实施方案中，特定MET x MET双特异性抗原结合分子的D1结构域与其在MET上的表位的结合不抑制(或仅极少地抑制)MET x MET双特异性抗原结合分子的D2结构域与其在MET上的表位的结合。由于D1和D2组分的各个表位的非重叠(或至多部分重叠)性质，MET x MET双特异性抗原结合分子能够结合细胞表面上的单个MET分子。

可以使用本领域普通技术人员已知的各种技术来确定与在本文中有用的抗体和抗原结合结构域相互作用的MET上的表位。可用于确定特定抗体或抗原结合结构域的表位或结合结构域的示例性技术包括例如点诱变(例如，丙氨酸扫描诱变、精氨酸扫描诱变等)、肽印迹分析(Reineke,2004,Methods Mol Biol 248:443-463)、蛋白酶保护和肽切割分析。此外，可以使用诸如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰的方法(Tomer,2000,ProteinScience 9:487-496)。可用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对感兴趣的蛋白进行氘标记，然后使抗体与氘标记的蛋白结合。接下来，将蛋白/抗体复合物转移到水中以允许在除抗体保护的残基(其保留氘标记)之外的所有残基处发生氢-氘交换。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱法分析，从而揭示氘标记的残基，其对应于抗体与之相互作用的特定氨基酸。参见，例如，Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。X-射线晶体结构分析也可用于鉴定抗体与之相互作用的多肽内的氨基酸。

根据本文提供的方法有用的是抗-MET抗体(包括双特异性抗体)，其与本文描述的任何特定示例性抗体或抗原结合结构域(例如，包含本文表1所示的任何氨基酸序列的抗体)结合相同的表位。同样地，本文还提供了与本文描述的任何特定示例性抗体(例如，包含本文表1所示的任何氨基酸序列的抗体)竞争结合MET的抗-MET抗体。在某些实施方案中，抗-MET抗体所结合的人MET表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸192-204、氨基酸305-315和/或氨基酸421-455。在某些实施方案中，人MET的第一表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸192-204；且人MET的第二表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸305-315和421-455。

通过使用本领域已知的和本发明示例的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参考抗-MET抗体结合相同的表位，或与参考抗-MET抗体竞争结合。例如，为了确定试验抗体是否与本文提供的参考抗-MET抗体结合相同的表位，允许参考抗体结合MET蛋白。接下来，评估试验抗体的结合MET分子的能力。如果试验抗体在参考抗-MET抗体饱和结合后仍能够结合MET，则可以得出结论，试验抗体与参考抗-MET抗体结合不同的表位。另一方面，如果试验抗体在参考抗-MET抗体饱和结合后不能与MET分子结合，则试验抗体可以结合与参考抗-MET抗体所结合的表位相同的表位。然后可以进行额外的例行实验(例如，肽突变和结合分析)以确认观察到的试验抗体的结合的缺乏是否实际上是由于与参考抗体结合相同的表位或者是否是空间阻断(或另一个现象)导致观察到的结合的缺乏。可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞计量术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定来进行这种实验。根据某些实施方案，如果在竞争性结合测定中测量到，例如一种抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量会使另一种抗体的结合抑制至少50％，但优选75％、90％或甚至99％，则两种抗体结合相同的(或重叠的)表位(参见，例如，Junghans等人,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。可替换地，如果抗原中基本上所有的减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变会减少或消除另一种抗体的结合，则认为这两种抗体结合相同的表位。如果减少或消除一种抗体结合的氨基酸突变的仅一个子集减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠的表位”。

为了确定抗体是否与参考抗-MET抗体竞争结合(或交叉竞争结合)，在两个方向进行上述结合方法：在第一个方向，使参考抗体在饱和条件下结合MET蛋白，然后评估试验抗体与MET分子的结合。在第二个方向，使试验抗体在饱和条件下结合MET分子，然后评估参考抗体与MET分子的结合。如果在两个方向仅第一(饱和)抗体能够结合MET分子，则得出结论：试验抗体和参考抗体竞争结合MET。如本领域普通技术人员会理解的，与参考抗体竞争结合的抗体可能不一定与参考抗体结合相同的表位，但可能通过结合重叠或相邻的表位在空间上阻断参考抗体的结合。

人抗体的制备

根据本文提供的方法有用的抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗体可以是全人抗体。产生单克隆抗体(包括全人单克隆抗体)的方法是本领域已知的。可以在本公开内容的上下文中使用任何这样的已知方法来制备特异性地结合人MET的人抗体。

例如，使用VELOCIMMUNETM技术或用于产生全人单克隆抗体的任何其它类似的已知方法，最初分离具有人可变区和小鼠恒定区的MET的高亲和力嵌合抗体。如在下面的实验部分中，关于合乎需要的特征，包括亲和力、配体阻断活性、选择性、表位等，对抗体进行表征和选择。如果必要的话，将小鼠恒定区替换为期望的人恒定区，例如野生型或修饰的IgG1或IgG4，以产生全人抗-MET抗体。尽管选择的恒定区可以随特定用途变化，高亲和力抗原结合和靶标特异性特征存在于可变区中。在某些情况下，直接从抗原阳性B细胞中分离出全人抗-MET抗体。

生物等效物

根据本文提供的方法有用的抗-MET抗体和抗体片段涵盖具有不同于所述抗体的氨基酸序列但保留结合人MET的能力的蛋白。当与亲本序列对比时，这样的变体抗体和抗体片段包含氨基酸的一个或多个添加、缺失或置换，但显示出与所述抗体的生物学活性基本上等效的生物学活性。同样地，与公开的序列相比，本公开内容的编码抗-MET抗体的DNA序列涵盖包含核苷酸的一个或多个添加、缺失或置换的序列，但其编码与本公开内容的抗-MET抗体或抗体片段基本上生物等效的抗-MET抗体或抗体片段。以上讨论了这样的变体氨基酸和DNA序列的例子。

例如，如果两种抗原结合蛋白或抗体是药物等效物或药物替代物，即，当在相似的实验条件下以相同的摩尔剂量(单剂量或多剂量)施用时，其吸收速率和吸收程度没有显示显著差异，则认为它们是生物等效的。如果一些抗体在吸收程度上相同而在吸收速率上不同，则可被视为等效物或药物替代物，但仍可被认为是生物等效的，因为吸收速率的这种差异是有意的并且反映在说明书中，对于有效体内药物浓度的达到而言不是必需的(例如在长期使用中)，并且对于所研究的特定药物产品而言被认为是医学上无关紧要的。

在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在它们的安全性、纯度和效力方面没有临床上有意义的差异，则它们是生物等效的。

在一个实施方案中，如果患者可以在参照产品和生物产品之间切换一次或多次，并且与没有这种切换的持续治疗相比没有预期的不良反应风险增加，包括免疫原性的临床显著变化或者降低的有效性，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。

在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白均通过对于使用条件常见的作用机制起作用，达到这些机制已知的程度，则它们是生物等效的。

可以通过体内和体外方法证明生物等效性。生物等效性测量包括，例如，(a)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中在血液、血浆、血清或其它生物流体中测量抗体或其代谢物的浓度随时间的变化；(b)与人体内生物利用度数据相关并可合理预测人体内生物利用度数据的体外试验；(c)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中测量抗体(或其靶标)的适当急性药理作用随时间的变化；(d)在良好控制的临床试验中，确定抗体的安全性、效力或生物利用度或生物等效性。

通过例如进行残基或序列的各种置换或删除生物活性不需要的末端或内部残基或序列，可以构建本文提供的抗-MET抗体的生物等效变体。例如，可以将不是生物活性所必需的半胱氨酸残基除去或用其它氨基酸替换，以防止在复性后形成不必要的或不正确的分子内二硫键。在其它情况下，生物等效抗体可以包括抗-MET抗体变体，其包含修饰抗体的糖基化特征的氨基酸变化，例如消除或除去糖基化的突变。

物种选择性和物种交叉反应性

根据某些实施方案，本公开内容提供了抗-MET抗体(和包含抗-MET抗原结合结构域的抗原结合分子)，其结合人MET但不结合来自其它物种的MET，且可用于治疗眼癌诸如葡萄膜黑素瘤、眼眶淋巴瘤、视网膜母细胞瘤和髓上皮瘤。本公开内容也包括抗-MET抗体(和包含抗-MET抗原结合结构域的抗原结合分子)，其结合人MET且结合来自一个或多个非人物种的MET，且可用于治疗眼癌诸如葡萄膜黑素瘤、眼眶淋巴瘤、视网膜母细胞瘤和髓上皮瘤。例如，抗-MET抗体和抗原结合分子可以结合人MET且可以结合或不结合(视情况而定)小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猴、绒猴、恒河猴或黑猩猩MET中的一种或多种。根据某些示例性实施方案，提供了特异性地结合人MET和食蟹猴(例如，成束猴(Macaca fascicularis))MET的抗-MET抗体和抗原结合分子。其它抗-MET抗体和抗原结合分子结合人MET，但不结合食蟹猴MET或仅弱结合食蟹猴MET。

多特异性抗体

如本文别处所述，根据本公开内容有用的是包含两个不同抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子，其中第一抗原结合结构域(D1)结合MET上的第一表位，并且其中第二抗原结合结构域(D2)结合MET上的第二表位。在某些实施方案中，D1和D2结构域所结合的MET上的第一和第二表位是不同的，或不重叠的，或部分重叠的。根据该方面，D1结构域可包含本文表1所示的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列，并且D2结构域可包含本文表1所示的任何其它HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列(只要D1结构域的结合特异性与D2结构域的结合特异性不同，和/或用于获得D1的抗原结合蛋白不与用于获得D2的抗原结合蛋白竞争结合MET)。在某些实施方案中，抗-MET抗体所结合的人MET表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸192-204、氨基酸305-315和/或氨基酸421-455。在某些实施方案中，人MET的第一表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸192-204；且人MET的第二表位包含SEQ ID NO:155的氨基酸305-315和421-455。

根据一个单独方面，还提供了在本文中有用的常规双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的一个臂结合人MET上的表位，并且所述双特异性抗体的另一个臂结合除MET之外的第二抗原。MET结合臂可包含本文表1所示的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。在某些实施方案中，MET结合臂结合人MET并阻断HGF与MET的结合。在其它实施方案中，MET结合臂结合人MET但不阻断HGF与MET的结合。

可以在本公开内容的上下文中使用的示例性双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)C_H3结构域和第二Ig C_H3结构域，其中第一和第二Ig C_H3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与不具有氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异降低双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，第一Ig C_H3结构域结合蛋白A并且第二Ig C_H3结构域含有降低或消除蛋白A结合的突变，例如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号的H435R)。第二C_H3可进一步包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU的Y436F)。可以存在于第二C_H3内的其它修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU的N384S、K392N和V422I)；和在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上述双特异性抗体形式的变化被涵盖在本公开内容的范围内。

可以在本公开内容的上下文中使用的其它示例性双特异性形式包括、但不限于，例如，基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合体、双重可变结构域(DVD)-Ig、四源杂交瘤(quadroma)、凸起-进入-孔洞、共同轻链(例如，具有凸起-进入-孔洞的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab²双特异性形式(关于前述形式的综述，参见，例如，Klein等人.2012,mAbs4:6,1-11，和其中引用的参考文献)。还可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如，其中使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后将其自组装成具有确定组成、价数和几何形状的多聚体复合物。(参见，例如，Kazane等人,J.Am.Chem.Soc.[Epub:2012年12月4日])。

治疗制剂和施用

本文提供了药物组合物，其包含根据本文所述的方法有用的抗-MET抗体或MET xMET双特异性抗原结合分子。所述药物组合物可以用合适的载体、赋形剂和提供改进的转移、递送、耐受性等的其它试剂配制。

在某些方面，将包含抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子的药物组合物配制成用于施用给眼睛以治疗眼癌诸如葡萄膜黑素瘤、眼眶淋巴瘤、视网膜母细胞瘤或髓上皮瘤。

本文提供了方法，其中被施用给患者的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子被包含在药物制剂内。所述药物制剂可以包含抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子以及至少一种无活性的成分，例如，药学上可接受的载体。可以将其它试剂掺入药物组合物中以提供改进的转移、递送、耐受性等。术语“药学上可接受的”是指被联邦或州政府的管理机构批准，或在美国药典或其它普遍公认的药典中列出用于动物，和更具体地用于人类。术语“载体”表示与抗体一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。可以在所有药物化学家已知的处方中发现许多适当的制剂：Remington's Pharmaceutical Sciences(第15版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.,1975)，特别是在其中Blaug,Seymour的第87章。这些制剂包括，例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡状物、油、脂质、含脂质的(阳离子的或阴离子的)囊泡(诸如LIPOFECTIN.TM.)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。任何前述混合物在本公开内容的方法的上下文中可能是合适的，前提条件是，抗-MET抗体或MET xMET双特异性抗原结合分子不被制剂灭活并且制剂在生理学上与施用途径相容和耐受。关于与药物化学家熟知的赋形剂和载体相关的其它信息，也参见Powell等人.PDA(1998)JPharm Sci Technol.52:238-311和其中的引文。

通过将抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子溶解、悬浮或乳化在常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中，可以制备在本公开内容的上下文中可用于通过注射施用的药物制剂。作为用于注射剂的水性介质，存在例如生理盐水、包含葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，其可与适当的增溶剂组合使用，所述增溶剂是诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成化合物)]等。作为油性介质，可以使用例如芝麻油、大豆油等，它们可以与增溶剂诸如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。如果需要的话，可以将如此制备的注射剂装入合适的安瓿中。

施用模式

通过任何已知的递送系统和/或施用方法，可以将抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子(或包含抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子的药物制剂)施用给患者。在某些实施方案中，通过眼部、眼内、玻璃体内或结膜下注射，将抗-MET抗体和METx MET双特异性抗原结合分子施用给患者。在其它实施方案中，通过局部施用可以将抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子施用给患者，例如，经由滴眼剂或含有抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子且可直接应用于眼睛的其它液体、凝胶、软膏剂或流体。其它可能的施用途径包括例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服。

联合治疗和制剂

本文提供了组合物和治疗制剂，其包含与一种或多种另外的治疗活性组分组合的本文描述的任何抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子，以及包含向有此需要的受试者施用这样的组合的治疗方法。

抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子可以与一种或多种另外的治疗活性组分共同配制和/或施用，所述另外的治疗活性组分选自：MET拮抗剂(例如，抗-MET抗体[例如，奥那妥组单抗、依玛妥珠单抗、特立妥珠单抗、SAIT301、ARGX-111、Sym015、HuMax-cMet、CE-355621和H4H14639D]或MET的小分子抑制剂)、EGFR拮抗剂(例如，抗-EGFR抗体[例如，西妥昔单抗或帕木单抗]或EGFR的小分子抑制剂[例如，吉非替尼或厄洛替尼])、另一个EGFR家族成员诸如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如，抗-ErbB2[例如，曲妥珠单抗或T-DM1]、抗-ErbB3或抗-ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、EGFRvIII的拮抗剂(例如，抗-EGFRvIII抗体)、IGF1R拮抗剂(例如，抗-IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如，威罗菲尼、索拉非尼、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如，抗-PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如，抗-PDGFR-β抗体或小分子激酶抑制剂例如，甲磺酸伊马替尼或苹果酸舒尼替尼)、PDGF配体抑制剂(例如，抗-PDGF-A、-B、-C或-D抗体、适体、siRNA等)、VEGF拮抗剂(例如，VEGF-Trap诸如阿柏西普，参见，例如，US 7,087,411(在本文中也被称作“VEGF抑制性融合蛋白”)、抗-VEGF抗体(例如，贝伐珠单抗)、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼))、DLL4拮抗剂(例如，在US2009/0142354中公开的抗-DLL4抗体诸如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如，在US 2011/0027286中公开的抗-Ang2抗体诸如H1H685P)、FOLH1拮抗剂(例如，抗-FOLH1抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如，抗-STEAP1抗体或抗-STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如，抗-TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如，抗-MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如，抗-CA9抗体)、uroplakin拮抗剂(例如，抗-uroplakin[例如，抗-UPK3A]抗体)、MUC16拮抗剂(例如，抗-MUC16抗体)、Tn抗原拮抗剂(例如，抗-Tn抗体)、CLEC12A拮抗剂(例如，抗-CLEC12A抗体)、TNFRSF17拮抗剂(例如，抗-TNFRSF17抗体)、LGR5拮抗剂(例如，抗-LGR5抗体)、单价CD20拮抗剂(例如，单价抗-CD20抗体诸如利妥昔单抗)、CD20 x CD3双特异性抗体、PD-1阻滞剂(例如，抗-PD-1抗体诸如派姆单抗或纳武单抗)等。可以与本文提供的抗体联合有益地施用的其它药剂包括例如他莫昔芬、芳香酶抑制剂和细胞因子抑制剂，包括小分子细胞因子抑制剂和与细胞因子诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18或其各自的受体结合的抗体。

示例性地，PD-1抑制剂诸如抗-PD-1抗体可以与如本文描述的抗-Met抗体-药物缀合物组合。目标患者群体特别包括具有过表达c-Met突变的肿瘤的那些患者，例如具有表达c-Met的葡萄膜黑素瘤或表达c-Met的非小细胞肺癌的患者。

本文提供了组合物和治疗制剂，其包含与一种或多种化学治疗剂组合的本文描述的任何抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子。化学治疗剂的例子包括：烷化剂类，例如，塞替派和环磷酰胺(CytoxanTM)；磺酸烷基酯类，例如，白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如，苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类，包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylomelamine)；氮芥类，例如，苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，例如，卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如，甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，例如，二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如，氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如，安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如，卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如，氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如，亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝他布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamnol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSKTM；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如，紫杉醇(TaxolTM,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)和多西紫杉醇(TaxotereTM；Aventis Antony,France)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如，顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸(retinoic acid)；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在该定义中还包括抗激素剂(其起作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用)，诸如抗雌激素类包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)和抗雄激素类诸如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

抗-MET抗体和MET x MET双特异性抗原结合分子也可以与抗病毒剂、抗生素、镇痛药、皮质类固醇、类固醇、氧、抗氧化剂、COX抑制剂、心脏保护剂、金属螯合剂、IFN-γ和/或NSAID联合施用和/或共同配制。

可以在即将施用抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子之前、同时或之后不久施用其它治疗活性组分，例如上面列出的任何药剂或其衍生物；(为了本公开内容的目的，这样的施用方案被认为是抗体与另外的治疗活性组分“组合”施用)。本公开内容包括药物组合物，其中抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子与一种或多种如本文别处所述的另外的治疗活性组分共同配制。

施用方案

根据某些实施方案，多剂量的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子(或包含抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子和本文提及的任何另外的治疗活性剂的组合的药物组合物)可以在限定的时程中施用给受试者。根据该方面的方法包括向受试者依次施用多个剂量的本文提供的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子。本文中使用的“依次施用”是指，将抗体的每个剂量在不同的时间点施用给受试者，例如在隔开预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)的不同天。本公开内容包括这样的方法，其包含向患者依次施用单个初始剂量的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子，然后施用一个或多个第二剂量的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子，并且任选地随后施用一个或多个第三剂量的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子。

术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”表示施用抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量后施用的剂量；“第三剂量”是在第二剂量后施用的剂量。初始、第二和第三剂量可以全部含有相同量的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子，但是在施用频率方面通常可以彼此不同。但是，在某些实施方案中，在初始、第二和/或第三剂量中所含的抗体的量在治疗过程中彼此不同(例如，在适当时向上或向下调整)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如，2、3、4或5个)剂量作为“负荷剂量”，然后是以更低的频率施用的后续剂量(例如，“维持剂量”)。

抗体的诊断用途

本公开内容的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子也可用于检测和/或测量样品中的MET或表达MET的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗-MET抗体或其片段可用于诊断以MET的异常表达(例如，过表达、表达不足、表达缺乏等)为特征的病症或疾病。MET的示例性诊断测定可包含，例如，使从患者获得的样品与抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子接触，其中所述抗体用可检测标记物或报告分子标记。可替换地，未标记的抗-MET抗体或MET x MET双特异性抗原结合分子可以与第二抗体组合用于诊断应用，所述第二抗体本身被可检测地标记。可检测标记物或报告分子可以是放射性同位素，诸如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光或化学发光部分诸如萤光素或罗丹明；或酶诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可用于检测或测量样品中MET的具体示例性测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫-PET(例如，⁸⁹Zr、⁶⁴Cu等)和荧光激活细胞分选术(FACS)。

可用于根据本公开内容的MET诊断测定中的样品包括可从患者获得的任何组织或流体样品，特别是在眼睛或眼部腔体中发现的组织或流体。通常，将测量从健康患者(例如，未患有与异常MET水平或活性相关的疾病或病症的患者)获得的特定样品中的MET水平，以初步建立MET的基线或标准水平。然后可以将该MET基线水平与从疑似患有MET相关疾病或病症的个体获得的样品中测量的MET水平进行对比。

实施例

提出以下实施例以给本领域普通技术人员提供如何制备和使用本文提供的方法和组合物的完整公开和描述，且无意限制发明人视作其发明的内容的范围。已经做出努力来确保关于使用的数字(例如，量、温度等)的准确度，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度为单位，且压强是在或接近大气压。

实施例1.抗-MET抗体的产生

通过用包含与人Fc融合的重组人MET细胞外结构域的免疫原(R&DSystems,目录号358-MT,Minneapolis,MN)免疫包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的基因工程小鼠，获得抗-MET抗体。用于免疫接种的小鼠表达“通用轻链”。也就是说，在该小鼠中产生的抗体具有不同的重链可变区，但具有基本上相同的轻链可变结构域。

通过MET特异性的免疫测定监测抗体免疫应答。当达到期望的免疫应答时，收获脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其生存力并形成杂交瘤细胞系。筛选并选择杂交瘤细胞系以鉴定产生MET特异性抗体的细胞系。使用该技术，获得了几种抗-MET嵌合抗体(即，具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)。另外，如US 2007/0280945A1中所述，直接从抗原阳性的B细胞分离几种全人抗-MET抗体而不与骨髓瘤细胞融合。

在下面列出的实施例中详细描述了根据本实施例的方法产生的示例性抗-MET抗体的某些生物学特性，以及由其构建的双特异性抗体。

实施例2.重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列

表1列出了本文描述的选定抗-MET抗体的重链和轻链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。(如上面所指出的，在实施例1中产生的所有抗体具有相同的轻链可变区，且因此也具有相同的轻链CDR序列)。相应的核酸序列标识符列于表2中。

表1：氨基酸序列标识符

表2：核酸序列标识符

抗体通常在本文中根据以下命名法提及：Fc前缀(例如“H4H”)，随后是数字标识符(例如“13290”、“13291”、“13295”等)，随后是“P2”后缀，如表1和2所示。因此，根据该命名法，抗体在本文中可以被称作，例如，“H4H13290P2”、“H4H13291P2”、“H4H13295P2”等。本文使用的抗体名称的前缀指示抗体的特定Fc区同种型。具体地，“H4H”抗体具有人IgG4 Fc(所有可变区都是全人的，如抗体名称中的第一个‘H’所示)。如本领域普通技术人员会理解的，具有特定Fc同种型的抗体可以转化为具有不同Fc同种型的抗体(例如，具有小鼠IgG4 Fc的抗体可以转化为具有人IgG1的抗体等)，但在任何情况下，可变结构域(包括CDR)-其由表1和2中所示的数字标识符表示-将保持相同，并且无论Fc结构域的性质如何，都预期结合特性相同或基本上相似。

实施例3.表面等离子体共振得出的人单克隆抗-MET(单特异性的)抗体的结合亲和力和动力学常数

通过表面等离子体共振(Biacore 4000或T-200)在37℃测定人抗-MET抗体的结合亲合力和动力学常数。在该实施例中测试的抗-MET抗体是MET的二价单特异性结合剂。将表达为人IgG4的抗体(称为“H4H”)捕获到通过与单克隆小鼠抗-人Fc抗体(GE,BR-1008-39)进行胺偶联而衍生的CM4或CM5 Biacore传感器表面上。将不同浓度的可溶性单体(人(h)Met.mmh；SEQ ID NO:152；成束猴(mf)Met.mmh；SEQ ID NO:154)或二聚体(hMet.mFc；SEQID NO:153)Met蛋白以30或50μL/分钟的流速注射到捕获抗-MET-抗体的表面上。将hMET.mmh或hMET.mFc与捕获的单克隆抗体的缔合监测4或5分钟，并且将hMET.mmh或hMET.mFc在HBS-ET(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05％v/v表面活性剂P20)或PBS-P(0.01M磷酸钠pH 7.4,0.15M NaCl,0.05％v/v表面活性剂P20)运行缓冲液中的解离监测10分钟。

通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时传感图拟合至1:1结合模型，确定动力学缔合(k_a)和解离(k_d)速率常数。如下从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(K_D)和解离半衰期(t1/2)：

和

单特异性抗-Met抗体与单体和二聚体Met蛋白的结合动力学参数如下表3所示。

表3：在37℃单特异性抗-MET mAb的Biacore结合亲合力

NB＝在所用条件下未观察到结合

如表3所示，几种抗体显示出与人和猴MET蛋白的高亲和力结合。

实施例4.抗-MET抗体结合Met受体上的不同表位

为了评估两种抗-MET抗体是否能够彼此竞争结合它们各自在MET上的表位，在HTX生物传感器(FortéBio Corp.,Menlo Park,CA)上使用实时无标记生物层干扰量度法(BLI)进行结合竞争测定。

简而言之，通过将抗-五-His抗体包被的生物传感器(FortéBioCorp.,#18-5079)浸没在含有20μg/mL的hMET.mmh溶液的孔中5分钟，将大约0.25nM与C-端myc-myc-六组氨酸标签一起表达的人MET细胞外结构域(hMet.mmh)首先捕获到所述生物传感器上。然后通过浸入含有50μg/mL的mAb-1溶液的孔5分钟，用第一抗-MET单克隆抗体(随后称为mAb-1)使捕获抗原的生物传感器饱和。然后将生物传感器浸入含有50μg/mL的第二抗-MET单克隆抗体(随后称为mAb-2)溶液的孔中3分钟。在实验的每个步骤之间，在HEPES-缓冲盐水-EDTA聚山梨酯20(HBS-EP)缓冲液中洗涤所有生物传感器。在实验过程中监测实时结合应答，并记录每个步骤结束时的结合应答。对比mAb-2与预先与mAb-1复合的抗-MET结合的应答，并使用50％抑制阈值确定不同抗-MET单克隆抗体的竞争/非竞争行为。表4明确定义了在两个方向上竞争的抗体的关系，与结合的顺序无关。

表4：抗-MET抗体与hMET.mmh结合的交叉竞争

实施例5.包含对MET的不同表位具有特异性的两种不同抗原结合结构域的双特异性抗体的构建

本实施例描述了包含两个不同抗原结合结构域(D1和D2)的双特异性抗体的构建，其中D1和D2衍生自不同的抗-MET抗体，并因此结合MET细胞外结构域上的单独表位。

用于构建本实施例的双特异性抗体的各个抗-MET抗原结合结构域衍生自本文实施例1至3中描述的各种二价单特异性抗-MET抗体。本文描述的所有抗-MET抗体包含相同的(“共同的”)轻链(包含SEQ ID NO:138的轻链可变区[LCVR]氨基酸序列，和SEQ ID NO:140、142和144的轻链CDR[LCDR1、LCDR2和LCDR3]氨基酸序列)。另外，在该实施例中说明的所有双特异性抗体含有衍生自示例性抗-MET抗体H4H13312P2的“D2”臂。因此，在该实施例中描述的所有双特异性抗体的抗原结合结构域(D1和D2)都包含该共同的轻链可变区，并且所有的D2结合臂包含来自H4H13312P2的重链可变区；但是，就其D1重链可变区(HCVR)和重链CDR(HCDR)而言，双特异性抗体彼此不同。该实施例的双特异性抗体的组分总结于表5中。

表5：MET x MET双特异性抗体组分总结

*在双特异性抗体标识符下的括号中的数字标记(例如，“No.10”)指示在图1的METx MET双特异性抗体矩阵中描绘的双特异性抗体编号。

实施例6.表面等离子体共振得出的MET x MET人双特异性单克隆抗体的结合亲合力和动力学常数

通过表面等离子体共振(Biacore 4000或T-200)在37℃测定根据本文实施例4构建的MET x MET双特异性抗体的结合亲和力和动力学常数。将表达为人IgG4的双特异性抗体(称为“H4H”)捕获到通过与单克隆小鼠抗-人Fc抗体(GE,BR-1008-39)进行胺偶联而衍生的CM4或CM5 Biacore传感器表面上。将不同浓度的可溶性单体MET蛋白(hMet.mmh,SEQ IDNO:152)以30或50μL/分钟的流速注射到捕获抗-MET x MET双特异性抗体的表面上。将分析物与捕获的双特异性抗体的缔合监测4或5分钟，并且将分析物在HBS-ET(0.01M HEPES pH7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05％v/v表面活性剂P20)或PBS-P(0.01M磷酸钠pH 7.4,0.15M NaCl,0.05％v/v表面活性剂P20)运行缓冲液中的解离监测10分钟。

如实施例3中所述确定动力学缔合(k_a)和解离(k_d)速率常数。

双特异性抗-Met抗体与单体Met蛋白(hMET.mmh)的结合动力学参数显示于表6中。

表6：在37℃双特异性抗-MET mAb的Biacore结合亲合力

如表6中所示，本文描述的双特异性“MET x MET”抗体显示高达大于1155分钟的T1/2值。

如表7所示，双特异性抗体H4H14639D的解离速率显著低于其亲本抗体H4H13306P2和H4H13312P2中的每一种的解离速率。

表7：在37℃双特异性抗-MET mAb和单特异性亲本抗体的Biacore结合亲合力

实施例7.在SRE-萤光素酶报告分子生物测定中，抗-Met抗体阻断HFG介导的Met激活

在基于萤光素酶的报告分子测定中检查了抗-MET抗体的阻断肝细胞生长因子(HGF)介导的MET激活的能力。生长因子HGF结合其受体c-Met(MET)的细胞外结构域，从而引发快速同源二聚化并激活几个下游信号传递级联。在该实施例中测试的抗-MET抗体是MET的二价单特异性结合剂，或抗-MET“双特异性抗体”，其中所述双特异性抗体的每个臂结合MET上的不同且独特的表位。

使用基于经工程改造的细胞的萤光素酶报告分子测定(图2)来确定抗-MET抗体的激活MET信号传递(图3,小图A；表8，列3和4)和阻断配体介导的MET激活(图3,小图B；表8，列1和2)的能力。简而言之，将CIGNAL^TMLenti SRE Reporter(luc)试剂盒(SABiosciences,Hilden,DE)用于产生HEK293/SRE-Luc细胞。选择HEK293(人胚胎肾)细胞，因为它们内源性表达c-Met。将HEK293/SRE-Luc细胞稳定地掺入血清应答元件(SRE)依赖性的萤光素酶(Luc)报告分子(参见Dinter等人,PLoS ONE 10(2):e0117774,2015)。将HEK293/SRE-Luc细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素/谷氨酰胺和1μg/ml嘌呤霉素的DMEM中培养。

接下来，将2.0x10⁵个HEK293/SRE-Luc细胞接种在96孔板中的萤光素酶测定培养基中，并在37℃、5％CO₂中温育过夜。通过向细胞加入连续稀释的HGF(0.01pM至1.0nM)并在没有抗体存在下在37℃温育四至六小时后记录萤光素酶信号，产生肝细胞生长因子(HGF)剂量响应曲线。为了产生抗体抑制曲线，将细胞在37℃与连续稀释的抗-人MET抗体(1.1pM至200nM)预温育一小时。然后在记录信号之前加入73pM或100pM浓度的HGF另外四至六小时。另外，还评估了在没有配体存在下抗体的激活c-Met的能力。

使用ONE-Glo^TM萤光素酶测定系统(Promega,Madison,WI)检测萤光素酶活性，并在Victor或Envision光度计(Perkin Elmer,Shelton,CT)上测量发射的光，并以相对光单位(RLU)表示。使用GRAPHPAD在12-点响应曲线上从四参数逻辑方程确定EC50/IC50值。报道了最高抗体剂量的HGF阻断百分比和MET激活倍数(单独mAb)。结果显示于表8中。

表8：抗-MET抗体阻断HGF介导的信号传递和在没有配体存在下SRE-Luc的激活

抗-MET二价单特异性抗体

抗-MET双特异性抗体(hIgG4-Fc)

NT＝未试验；ND＝由于非-S形曲线或不完全阻断，未确定EC50/IC50。

如表8中所总结的，大多数抗体抑制SRE报告分子的激活，IC50值范围为<2.0pM至约1.0nM。几种示例性的单特异性二价抗-MET抗体诸如H4H13306P2和H4H13309P2是SRE-luc激活的有效抑制剂，抑制百分比值分别为67％和77％。抗-MET双特异性抗体(MET x MET)总体上表现出对SRE-luc激活的更大抑制。例如，MET x MET双特异性抗体H4H14639D显示出95％的抑制。另外，几种阻断抗体在没有配体存在下弱激活，倍数激活应答在基线水平以上0.8至14.4的范围内。

也如图3所示，二价单特异性抗体H41413306P2和H4H13312P2各自在没有HGF配体存在下激活Met途径(小图A)，并且还阻断Met的HGF激活(小图B)。

还使用HEK293/SRE-Luc系统评估了双特异性MET x MET抗体(例如，H4H14639D)对HGF依赖性的和HGF非依赖性的MET激活的作用。在用各种浓度的MET抗体H4H14639D(MET xMET双特异性抗体)、单价抗-MET抗体和H4H14639D亲本抗体H4H13312P2处理的HEK293T细胞中测量SRE驱动的萤光素酶活性，以确定HGF非依赖性的MET激动作用的水平。虽然亲本抗-MET单特异性二价抗体显示出MET激动剂活性，但单价和MET x MET双特异性抗体均未显示出MET激动剂活性(图4,小图A)。

在用各种浓度的MET抗体H4H14639D(MET x MET双特异性抗体)、单价抗-MET抗体和H4H14639D亲本抗体H4H13312P2处理的HEK293T细胞中测量SRE驱动的萤光素酶活性，以确定HGF依赖性的MET激动作用的抑制或阻断水平。虽然亲本抗-MET单特异性二价抗体显示出一些HGF阻断活性，但单价和MET x MET双特异性抗体均显示出更大的HGF阻断(图4,小图B)。

MET x MET双特异性抗体阻断HGF信号传递并表现出低MET激动剂活性。

实施例8.抗-Met抗体抑制Met扩增的细胞的生长

接下来，关于其抑制MET扩增的SNU5细胞生长的能力，测试选择的抗-Met抗体。简而言之，在浓度范围为1.5pM至100nM的抗-MET抗体存在下，将2.5x10³个人胃癌(SNU5)细胞接种于完全生长培养基中。SNU5完全生长培养基含有Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基、10％FBS和青霉素/链霉素/谷氨酰胺。将细胞温育5天，并使用发光细胞生存力测定试剂盒(Promega,Madison,WI)根据生产商的说明书测定活细胞的数目。

如表9中所总结的，几种抗-MET抗体诸如H4H13312P2和H4H13325P2阻断SNU5生长超过50％，总IC50范围为44pM至780pM。

图5描绘了用各种抗-MET二价单特异性抗体(即，常规抗体)处理的SNU5细胞的相对细胞生长。常规MET抗体中的一部分抑制SNU5 MET扩增的胃癌细胞的生长(图5)。用10μg/ml的每种抗体处理在96孔板中的SNU5细胞，并在5天后通过试剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)的还原测定细胞生长。使用如美国专利7,892,550B2(其通过引用整体并入本文)中所述的MetMab的重链和轻链可变序列产生单价MET抗体(图5第2列)。常规抗体8是H4H13306P2，常规抗体11是H4H13312P2，它们用于构建MET xMET双特异性抗体H4H14639D。

在单独的生长测定中，在SNU5和非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系EBC-1中评估了METx MET双特异性抗体(即，H4H14639D)的阻断活性，所述细胞系还表现出扩增的Met基因和过表达MET(Lutterbach等人,Cancer Res.67(5):2081-2088,2007)。EBC-1细胞的完全生长培养基含有MEM Earle氏盐、10％胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素/谷氨酰胺和MEM的非必需氨基酸。根据SRE-萤光素酶读数，H4H14369D表现出MET活性的最大抑制百分比。在当前实验中，在浓度范围为15pM至100nM的H4H14639D存在下，将3.0x10³个SNU5或EBC-1细胞接种于完全生长培养基中。将细胞在37℃、5％CO₂中温育3天。然后将细胞在4％甲醛中固定并用3μg/ml Hoechst33342染色以标记细胞核。在Micro XL(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)上获得图像，并通过图像分析软件(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)确定细胞核计数。从所有孔中减去用40nM洋地黄皂苷处理的细胞的背景细胞核计数，并将存活率表示为未处理对照的百分比。通过10-点响应曲线(GRAPHPAD)上的四参数逻辑方程确定IC50值。IC50值和细胞杀死百分比显示在表9中。

表9：抗-MET抗体阻断SNU5生长

ND＝由于非-S形曲线或不完全阻断，未确定IC₅₀

如下表10中所总结的，MET x MET双特异性抗体H4H14639D分别使EBC-1和SNU5细胞的生长抑制了37％和40％，并且IC50分别为0.82nM和0.3nM。

表10：抗-Met双特异性抗体阻断EBC-1和SNU5生长

用0.1μg/mL、1μg/mL或10μg/mL的对照抗体、单价MET抗体或MET x MET双特异性抗体处理在96孔板中的SNU5细胞(胃)。5天后通过试剂(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)的还原测定细胞生长。与对照和单价抗体相比，MET x MET双特异性抗体显著降低了SNU5细胞的相对细胞生长(图6,小图A)。

同样，评估了MET x MET双特异性抗体对EBC-1细胞生长的作用。将2,500个EBC-1细胞接种在96孔板中，并在补充有10％FBS的Dulbecco氏培养基中培养。用0.1μg/mL或1μg/mL的对照抗体或MET x MET双特异性抗体处理细胞，并随后在37℃、5％CO₂下温育。5天后，通过在M3平板读数器(Molecular Devices,LLC,Sunnyvale,CA)中测量指示剂染料向其高荧光形式的还原来测定相对细胞生长。结果显示在表11和图6、小图B中。与对照抗体相比，MET x MET双特异性抗体(H4H14639D)显著降低了EBC-1细胞的相对细胞生长(图6、小图B)。

几种抗-MET抗体(二价单特异性的抗体和MET x MET二价抗体)是SRE-Luc激活的有效抑制剂，并且抑制Met扩增和MET过表达细胞系的生长。

表11：抗-Met双特异性抗体阻断EBC-1细胞生长

实施例9.MET x MET双特异性抗体诱导NCI-H596 NSCLC细胞中的适度和瞬时MET途径活性

在体外评估了MET x MET双特异性抗体对人肺腺鳞状癌细胞中MET途径的作用。

将250,000个NCI-H596细胞接种在12孔板中，并在补充有10％FBS的RPMI培养基中培养。一式两份地用50ng/ml的肝细胞生长因子(HGF)或10μg/ml的MET x MET双特异性抗体H4H14639D处理细胞。随后将细胞在5％CO₂中于37℃温育。在0、2、6或18小时后，制备细胞裂解物，将蛋白含量标准化并进行免疫印迹分析。用ImageJ图像处理程序(T.Collins,BioTechniques 43:S25-S30,2007)量化MET磷酸化和ERK磷酸化。将磷酸化水平相对于微管蛋白上样对照标准化，并表示为相对于对照处理的倍数变化。结果总结在表12中。

表12：MET和ERK的磷酸化

NCI-H596细胞的HGF处理诱导了MET和ERK的强烈激活，其在2小时达到峰值并在18小时后持续。用H4H14636D双特异性抗体处理检测到适度的MET和ERK磷酸化，其分别在18或6小时之前恢复至基线水平。

实施例10.MET x MET双特异性抗体在Hs746T胃癌细胞中比单特异性抗体更有效地诱导MET降解并抑制途径活性

在体外评估了MET x MET双特异性抗体对人胃癌细胞的MET活性的作用。将250,000个Hs746T人胃癌细胞(H.Smith,J.Nat’l.Cancer Inst.62(2):225-230,1979)接种在12孔板中并在补充有10％FBS的改良Dulbecco氏培养基中培养。将细胞用(1)5μg/ml的hFc对照分子、(2)5μg/ml的亲本二价单特异性抗-MET抗体H4H13306P2、(3)5μg/ml的亲本二价单特异性抗-MET抗体H4H13312P2、(4)2.5μg/mL H4H13306P2和2.5μg/mL H4H13312P2的组合或(5)5μg/ml的MET x MET双特异性抗体H4H14639D处理。随后将细胞在5％CO₂下在37℃温育。18小时后，制备细胞裂解物，将蛋白含量标准化并进行免疫印迹分析。用ImageJ图像处理程序(T.Collins,BioTechniques 43:S25-S30,2007)量化MET表达、MET磷酸化和ERK磷酸化。结果总结于表13和图7、小图A中，其描绘了原始免疫印迹数据。图7的小图B描绘了用10μg/ml的MET x MET双特异性抗体处理0、2或6小时的细胞中的MET蛋白表达。用MET x MET双特异性抗体处理后，Hs747T细胞中的总MET水平随时间下降。对于MET扩增的人乳头状腺癌NCI-H820细胞系获得了类似的结果(Bean等人,“MET amplification occurs with orwithout T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistanceto getfitnib or erlotinib,”Proc.Natl.Acad.Sci.2007年12月26日,104(52):20932-20937)。

表13：MET蛋白和MET/ERK途径激活的相对水平

双特异性抗体H4H14639D比其亲本常规抗体更有效地诱导MET降解。用H4H14636D处理比用亲本抗体或亲本抗体的组合更有效地抑制MET和ERK磷酸化。

用对照抗体、MET x MET双特异性抗体H4H14639D、抗-MET亲本抗体H4H13306P2、抗-MET亲本抗体H4H13312P2(每种抗体在10μg/ml)以及亲本抗体1和2的组合(对于亲本抗体的组合，每种抗体在5μg/ml)处理Hs746T胃癌细胞18小时。通过用指定的抗体进行免疫印迹法，测定MET表达(MET)和途径激活(pMET和pErk)(图8)。MET x MET双特异性抗体在Hs746T胃癌细胞中比其亲本抗体更有效地抑制MET途径激活。

实施例11.MET x MET双特异性抗体在NCI-H596肺癌细胞中比单特异性抗体更有效地诱导MET降解

评估了MET x MET双特异性抗体和亲本二价单特异性抗-MET抗体对人肺腺鳞状癌细胞上的肝细胞生长因子受体(HGFR或MET)的表达水平的作用。将250,000个NCI-H596人肺腺鳞状癌细胞接种在12孔板中，并在补充有10％FBS的RPMI培养基中培养。将细胞用(1)5μg/ml的hFc对照分子、(2)5μg/ml的亲本二价单特异性抗-MET抗体H4H13306P2、(3)5μg/ml的亲本二价单特异性抗-MET抗体H4H13312P2、(4)2.5μg/mL H4H13306P2和2.5μg/mLH4H13312P2的组合或(5)5μg/ml的MET x MET双特异性抗体H4H14639D处理。随后将细胞在5％CO₂下在37℃温育。18小时后，制备细胞裂解物，将蛋白含量标准化并进行免疫印迹分析。用ImageJ图像处理程序(T.Collins,BioTechniques 43:S25-S30,2007)量化MET表达。结果总结在表14中。

表14：MET蛋白的相对水平

将NCI-H596(MET外显子14跳跃突变)肺癌细胞也用10μg/ml的对照或MET x MET双特异性抗体处理2、6或18小时。通过免疫印迹法测定MET表达(图9)，其显示了随着处理时间的增加MET x MET双特异性抗体诱导的MET降解。

双特异性抗体H4H14636D在NCI-H596肺癌细胞中比其亲本常规抗体更有效地诱导MET降解。

实施例12.MET x MET双特异性抗体在SNU5胃癌细胞中比单特异性抗体更有效地诱导MET降解和抑制途径活性

评估了二价单特异性抗-MET抗体和几种MET x MET双特异性抗体对胃癌细胞上的肝细胞生长因子受体(HGFR或MET)的表达水平的作用。将人胃癌SNU5细胞铺板在含有20％FBS+青霉素-链霉素-谷氨酰胺的Iscove氏培养基中。接种后24小时，用对照hFc、抗-MET亲本二价单特异性抗体H4H13312P2或MET x MET双特异性抗体(H4H14634D、H4H14635D、H4H14636D、H4H14637D、H4H14638D、H4H14639D、H4H14640D、H4H14641D)处理细胞18小时。然后制备细胞裂解物并通过蛋白质印迹法分析。检测免疫印迹的MET和微管蛋白。定量MET蛋白表达水平，并相对于微管蛋白上样对照标准化。结果呈现于表15和图10、小图B中。

表15：MET蛋白的相对水平

如上所述，用10μg/ml的对照抗体或MET x MET双特异性抗体或单价MET抗体处理SNU5癌细胞18小时。通过用指定的抗体进行免疫印迹法，测定MET表达(图10、小图A和B)和途径激活(即，pMET和pERK；小图A)。免疫印迹显示在图10中。

用MET x MET双特异性抗体对SNU5细胞的处理比用二价单特异性抗-MET抗体(H4H13312P2)(图10、小图B)、单价MET抗体或对照hFc的处理诱导更有效的MET降解。用METx MET双特异性抗体对SNU5细胞的处理抑制了MET途径的下游效应物。关于MET扩增的非小细胞肺癌腺癌细胞系NCI-H1993，获得了类似的结果(Kubo等人,“MET gene amplificationor EGFR mutation activate MET in lung cancers untreated with EGFR tyrosinekinase inhibitors,”Int.J.Cancer 2009年4月15日；124(8):1778-1784)。

实施例13.MET x MET双特异性抗体在EBC-1细胞中比单特异性抗体更有效地诱导MET降解、抑制途径活性和抑制肿瘤生长

如上所述，将MET扩增的人肺鳞状细胞癌EBC-1细胞(Lutterbach等人,“Lungcancer cell lines harboring MET gene amplification are dependent on Met forgrowth and survival,”Cancer Res.2007年3月1日；67(5):2081-8)用对照抗体或10μg/ml的MET x MET双特异性抗体处理18小时。通过用指定的抗体进行免疫印迹法确定MET表达和通过pMET和pErk表达确定的MET途径激活。免疫印迹显示在图11中。

用MET x MET双特异性抗体对携带MET基因扩增的EBC-1细胞的处理比用对照抗体的处理诱导更有效的MET降解。用MET x MET双特异性抗体对EBC-1细胞的处理抑制了MET途径的下游效应物。

在另一个实验中，将5百万个EBC-1细胞皮下植入C.B.-17SCID小鼠的胁腹中。一旦肿瘤体积达到约150mm³，将小鼠随机分成6组，每周用25mg/kg的对照抗体或25mg/kg的METx MET双特异性抗体H4H14639D处理两次。在植入后监测肿瘤生长30天，并测量每个实验组随时间的肿瘤体积(mm³)。结果显示在表16和图12中，其表明，MET x MET双特异性抗体显著抑制EBC-1肿瘤的生长。

表16：相对EBC-1肿瘤生长

实施例14.MET x MET双特异性抗体比单特异性抗体更有效地抑制Hs746T胃癌细胞的体外生长

在体外评估了MET x MET双特异性抗体对人胃癌细胞生长的作用。将2,500个Hs746T人胃癌细胞(H.Smith,J.Nat’l.Cancer Inst.62(2):225-230,1979)接种在96孔板中，并在补充有10％FBS的改良Dulbecco氏培养基中培养。将细胞用(1)5μg/ml的单一二价单特异性抗-MET抗体(H4H13306P2或H4H13312P2)、(2)各2.5μg/ml的两种二价单特异性抗-MET亲本抗体(H4H13306P2和H4H13312P2)的组合或(3)5μg/ml的含有来自H4H13306P2的一个结合臂和来自H4H13312P2的另一个结合臂的双特异性抗体(H4H14639D)处理。随后将细胞在5％CO₂下在37℃温育。5天后，通过在M3平板读数器(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)中测量指示剂染料ALAMAR(ThermoFischer Scientific,Waltham,MA)向其高荧光形式的还原来确定相对细胞生长。荧光的增加与细胞生长相关。表17描述了向对照(未处理)Hs746T细胞生长标准化的每种抗体处理的相对Hs746T细胞生长。双特异性抗体H4H14639D比单独的或组合的其亲本单特异性抗体更有效地抑制Hs746T细胞的增殖。

表17：标准化的Hs746T细胞生长

用对照抗体、MET x MET双特异性抗体H4H14639D、抗-MET亲本抗体H4H13306P2、抗-MET亲本抗体H4H13312P2以及亲本抗体1和2的组合处理Hs746T胃癌细胞，每种抗体在2μg/ml。5天后通过 试剂的还原测定细胞生长(图13、小图A)。MET x MET双特异性抗体相对于单独的或组合的亲本抗体抑制细胞生长，并且在Hs746T胃癌细胞中比其亲本抗体更有效地抑制MET途径激活。

将在96孔板中的Hs746T胃癌细胞用25μg/mL对照抗体、1μg/mL、10μg/mL或25μg/mL单价MET抗体、或1μg/mL、10μg/mL或25μg/mL MET x MET双特异性抗体处理。5天后，通过试剂的还原测定Hs746T胃癌细胞生长(图13、小图B)。MET x MET双特异性抗体有效地抑制MET扩增细胞的生长。

实施例15.MET x MET双特异性抗体在体外不诱导NCI-H596肺癌细胞的生长

在体外评估了MET x MET双特异性抗体对人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞(NCI-H596)的生长的作用。将10,000个NCI-H596肺腺鳞状癌细胞(Nair等人,J.Nat’l.CancerInst.86(5):378-383,1994)接种在96孔板中的补充有1％胎牛血清(FBS)的一层0.66％琼脂培养基上。将细胞在补充有1％FBS与0.3％琼脂糖的RPMI 1640培养基中培养。将细胞用(1)5μg/ml的单一亲本二价单特异性抗-MET抗体(H4H13306P2或H4H13312P2)、(2)各2.5μg/ml的两种亲本二价单特异性抗-MET抗体(H4H13306P2和H4H13312P2)的组合、(3)5μg/ml的含有来自H4H13306P2的一个结合臂和来自H4H13312P2的另一个结合臂的双特异性抗体(H4H14639D)或(4)100ng/mL的肝细胞生长因子(HGF)处理。随后将细胞在5％CO₂下在37℃温育。两周后，通过在M3平板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中测量指示剂染料(Thermo Fischer Scientific,Waltham,MA)向其高荧光形式的还原来确定相对细胞生长。荧光的增加与细胞生长相关。表18和图14描绘了向对照(未处理)NCI-H596细胞生长标准化的每种抗体处理的相对NCI-H596细胞生长。用HGF对NCI-H596肺癌细胞的处理导致在软琼脂中有效诱导生长。与对照处理的细胞相比，MET x MET(图14中的MM)双特异性抗体H4H14639D没有显著改变生长。用各亲本二价单特异性抗体H4H13306P2(M1)或H4H13312P2(M2)单独地或组合地(H4H13306P2和H4H13312P2)(M1M2)观察到适度的细胞生长诱导。

表18：标准化的NCI-H596细胞生长

实施例16.MET x MET双特异性抗体比单特异性抗体更有效地抑制SNU5胃癌细胞的体外生长

在体外评估了MET x MET双特异性抗体对人胃癌细胞生长的作用。将2,500个SNU5人胃癌细胞(Ku和Park,Cancer Res.Treat.37(1):1-19,2005)接种在96孔板中，并在补充有20％FBS的Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基中培养。将细胞用(1)5μg/ml的二价单特异性抗-MET抗体(H4H13306P2或H4H13312P2)、(2)各2.5μg/ml的两种二价单特异性抗-MET抗体(H4H13306P2和H4H13312P2)的组合或(3)5μg/ml的含有来自H4H13306P2的一个结合臂和来自H4H13312P2的另一个结合臂的双特异性抗体(H4H14639D)处理。随后将细胞在5％CO₂下在37℃温育。5天后，通过在M3平板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中测量指示剂染料(Thermo Fischer Scientific,Waltham,MA)向其高荧光形式的还原来确定相对细胞生长。荧光的增加与细胞生长相关。表19描述了向对照(未处理)SNU5细胞生长标准化的每种抗体处理的相对SNU5细胞生长。双特异性抗体H4H14639D比其亲本单特异性抗体更有效地抑制SNU5细胞的增殖。

表19：标准化的SNU5细胞生长

实施例17.MET x MET双特异性抗体诱导Hs746T肿瘤异种移植物的消退

评估了MET x MET双特异性抗体对免疫受损的小鼠模型中的人胃癌肿瘤的作用。将三百万个Hs746T人胃癌细胞皮下植入CB-17SCID小鼠的胁腹中(Bancroft等人,J.Immunol.137(1):4-9,1986)。一旦肿瘤体积达到约200mm³，将小鼠随机分成六组，每周用25mg/kg的对照抗体或25mg/kg的MET x MET双特异性抗体(H4H14639D)处理两次。将对照组在植入后监测肿瘤生长16天，此时对照处理的肿瘤达到方案大小限制。对于H4H14639处理组，在植入后监测肿瘤生长30天。

与处理开始时相比，用MET x MET双特异性抗体对肿瘤的处理在21天内诱导了肿瘤大小的消退。对照处理的肿瘤在16天的生长中显示约12倍的体积平均增加(表20)。随时间变化的肿瘤体积显示在图15中，其显示了由MET x MET双特异性抗体导致的Hs746T肿瘤消退。

表20：Hs746T胃肿瘤生长

实施例18.MET x MET双特异性抗体诱导SNU5肿瘤异种移植物的消退

评估了MET x MET双特异性抗体对免疫受损的小鼠模型中的人胃癌肿瘤的作用。将一千万个SNU5人胃癌细胞皮下植入CB-17SCID小鼠的胁腹。一旦肿瘤体积达到约500mm³，将小鼠随机分成五组，每周用10mg/kg的对照抗体或1mg/kg或10mg/kg的MET x MET双特异性抗体(H4H14639D)处理两次。在植入后监测肿瘤生长81天，此时对照处理的肿瘤达到方案大小限制。

用1mg/kg或10mg/kg的MET x MET抗体处理的小鼠的肿瘤分别显示约95％或98％的平均大小减小。对照处理的肿瘤显示比处理开始时约12倍的体积平均增加(表21)。

表21：SNU5胃肿瘤生长

每周用对照抗体、1mg/kg或10mg/kg的单价MET抗体、或1mg/kg或10mg/kg的MET xMET双特异性抗体处理皮下植入的SNU5肿瘤两次。在用MET x MET双特异性抗体处理的那些小鼠中随时间观察到MET扩增的SNU5肿瘤的有效和持续消退(即肿瘤体积减小)(图16、小图A)。从研究结束的肿瘤中提取蛋白，并通过免疫印迹法测定MET表达和由MET磷酸化(pMET表达)指示的途径激活。相对于对照，MET x MET处理的小鼠(肿瘤)显示MET和pMET表达的降低(图16、小图B)。MET x MET双特异性抗体是携带MET扩增的肿瘤的有效抑制剂。

实施例19.MET x MET双特异性抗体诱导U87-MG肿瘤异种移植物的消退

评估了MET x MET双特异性抗体对免疫受损的小鼠模型中的人胶质母细胞瘤肿瘤的作用。将五百万个U87-MG人胶质母细胞瘤细胞(Vordermark和Brown,Int.J.RadiationBiol.56(4):1184-1193,2003)皮下植入CB-17SCID小鼠的胁腹中。U87-MG胶质母细胞瘤异种移植物模型由自分泌HGF信号传递驱动。一旦肿瘤体积达到约100mm³，将小鼠随机分成六组，并用对照抗体或MET x MET双特异性抗体(H4H14639D)处理。每周给每只小鼠施用25mg/kg抗体(对照或MET x MET)两次。在植入后监测肿瘤生长29天，此时对照处理的肿瘤达到方案大小限制。

用MET x MET抗体处理的小鼠的肿瘤显示出约38％的平均大小减小，而对照处理的肿瘤在29天的生长中显示出约19倍的体积平均增加(表22)。随时间变化的肿瘤体积显示在图17中，其显示了由MET x MET双特异性抗体导致的U87-MG肿瘤消退。

表22：胶质母细胞瘤肿瘤生长

实施例20.MET x MET双特异性抗体抑制U118-MG肿瘤异种移植物的生长

评估了MET x MET双特异性抗体对免疫受损的小鼠模型中的人胶质母细胞瘤肿瘤的作用。U118-MG胶质母细胞瘤异种移植物模型由自分泌HGF信号传递驱动。将五百万个U118-MG人胶质母细胞瘤细胞(Olopade等人,Cancer Research 52:2523-2529,1992)皮下植入CB-17SCID小鼠的胁腹中。一旦肿瘤体积达到约100mm³，将小鼠随机分成六组，并用对照抗体或MET x MET双特异性抗体(H4H14639D)处理。每周给每只小鼠施用25mg/kg抗体(对照或MET x MET)两次。植入后监测肿瘤生长72天。

MET抗体在72天期间使肿瘤生长抑制99％(表23)。

表23：胶质母细胞瘤肿瘤生长

在另一个实验中，用25mg/kg对照抗体、单价MET抗体或MET xMET双特异性抗体每周处理小鼠中皮下植入的U118-MG胶质母细胞瘤肿瘤两次。随时间测量每个实验组的肿瘤体积(mm³)。结果如图18所示，其显示了MET x MET双特异性抗体抑制U118-MG肿瘤的生长。

实施例21：拟美坦辛合成

如下所述从化合物2(图19)合成美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-N-Me-β-丙氨酸-氨基甲酰基-(对氨基)苄基-瓜氨酸-缬氨酸-已二酰基-琥珀酸酯(图20中的化合物1)。

美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-Fmoc-N-Me-β-丙氨酸(化合物3,图19).将脱乙酰基-美坦辛(化合物2,图19,0.433g,0.666mmol)、Fmoc-N-Me-β-Ala(0.434g,1.33mmol)和HATU(0.757g,1.99mmol)称重至干燥烧瓶中，溶解在无水DMF(9mL)中，并用4-甲基吗啉(0.300mL,2.73mmol)处理。将烧瓶用橡胶隔片密封，用氩气吹扫，并将反应物在环境温度搅拌。3天后，将混合物蒸发成油，溶解在乙腈和水中，并通过快速色谱法在275g C18硅胶柱(30-90％乙腈水溶液，历时20分钟，0.05％乙酸在两相中)上纯化。将产物级分低压冻干，得到作为白色固体的标题化合物。将粗制品在80g硅胶柱(EtOAc-5:5:1EtOAc:DCM:MeOH，历时17分钟)上纯化。将纯的级分合并，蒸发，并在真空中干燥过夜，得到作为白色固体的标题化合物(0.424g,66％)。MS(ESI,pos.)：C₅₁H₆₁ClN₄O₁₂的计算值，956.4；实测值956.9(M+H),979.0(M+Na),939.0(M-H₂O+H)。

N-叔丁氧基羰基-N-甲基-β-丙氨酸琥珀酸酯(化合物4,图19).通过本领域众所周知的方法从市售的Boc-N-Me-β-Ala-OH制备标题化合物(参见-Widdison等人,J.Med.Chem.,2006,49(14),4401)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ3.62(bm,2H),2.88(m,9H),1.47(s,9H)。

美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-Boc-N-Me-β-丙氨酸(化合物5,图19).方法A：将上述步骤的产物(化合物4,图19,0.453g,1.51mmol)和脱乙酰基-美坦辛(化合物2,图19,0.304g,0.468mmol)溶解在3:1乙腈:水(8mL)中，用1MNaHCO₃水溶液(0.5mL)处理，并在环境温度搅拌18小时。当通过TLC确定反应结束时，然后将其与盐水一起搅拌10分钟并用乙酸乙酯(EtOAc)萃取三次。然后将合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并浓缩滤液，并在真空中干燥成金色浓浆，将其通过快速柱色谱法在20g硅胶柱(0至10％MeOH的EtOAc溶液，历时15分钟)上纯化，得到作为白色固体的标题化合物(0.084g,43％)。MS(ESI,pos.)：C₄₁H₅₉ClN₄O₁₂的计算值，834.4；实测值835.2(M+H),857.2(M+Na),817.4(M-H₂O+H)。

方法B：将Boc-N-Me-β-Ala-OH(0.294g,1.45mmol)溶解在无水DMF(5mL)中，用二苯基次膦酸五氟苯酯(FDPP,0.555g,1.44mmol)处理，并将反应物在环境温度搅拌30分钟。然后将混合物转移到含有脱乙酰基-美坦辛(化合物2,图19,0.462g,0.711mmol)和二异丙基乙胺(DIEA,0.250mL,1.44mmol)在无水DMF(7mL)中的混合物的较大烧瓶中，将烧瓶用橡胶隔片密封，用氩气吹扫，并在环境温度再次搅拌反应物。24小时后，将反应物在真空中浓缩成油，溶解在乙酸乙酯(EtOAc,2mL)中，并在40g硅胶柱(EtOAc-5:5:1EtOAc/DCM/MeOH，历时15分钟)上纯化，得到作为淡黄色固体的标题化合物(0.468g,79％)。MS(ESI,pos.)：C₄₁H₅₉ClN₄O₁₂的计算值，834.4；实测值857.2(M+Na),817.2(M-H₂O+H)。

美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-N-Me-β-丙氨酸(化合物6,图19).方法A：将美坦辛-N-Me-L-Ala-Boc-N-Me-β-Ala(化合物5,图19,0.464g,0.555mmol)溶解在乙腈/水/三氟乙酸的3:1:1混合物(7mL)中，将烧瓶用橡胶隔片密封，用氩气吹扫，并将反应物在环境温度搅拌24小时，然后盖帽和在-20℃储存3天。将粗制反应混合物温热至环境温度保持2小时，在真空中简单浓缩，在100g C18 RediSep Gold柱(20-80％乙腈水溶液，历时25分钟，0.1％TFA在两种溶剂中)上纯化，并将合并的纯的级分在环境温度部分蒸发，在干冰浴中冷冻，并低压冻干以得到作为淡黄色固体的标题化合物(0.295g,63％)。MS(ESI,pos.)：C₃₆H₅₁ClN₄O₁₀的计算值,734.3；实测值735.7(M+H),1471.3(2M+H)。

方法B：将美坦辛-N-Me-L-Ala-Fmoc-β-Ala(化合物3,图19,0.422g,0.441mmol)溶解在5％哌啶的DMF溶液(6.00mL,3.04mmol)中，将反应烧瓶用橡胶隔片密封，用氩气吹扫，并将混合物在环境温度搅拌。3小时后，通过LCMS确认反应结束，因此将其在真空中浓缩，密封，并在-20℃储存过夜。将粗产物温热至环境温度，用乙腈和10％乙酸水溶液(各3mL)处理，并通过快速色谱法在275g C18硅胶柱(10-90％乙腈水溶液，历时20分钟，0.05％乙酸在两种溶剂中)上纯化。将产物级分低压冻干，得到作为白色固体的标题化合物。将固体与无水乙醚一起研磨三次，过滤，将固体用DCM从玻璃料上洗掉，并蒸发滤液并在真空中干燥，得到作为白色固体的标题化合物(0.311g,89％)。MS(ESI,pos.)：C₃₆H₅₁ClN₄O₁₀的计算值，734.3；实测值735.0(M+H)。

美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-N-Me-β-丙氨酸-氨基甲酰基-(对氨基)苄基-瓜氨酸-缬氨酸-Fmoc(化合物7,图20).步骤1：将上述步骤的产物(化合物6,图19,0.310g,0.390mmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAT,0.164g,1.20mmol)、碳酸氢钠(0.138g,1.64mmol)和Fmoc-缬氨酸-瓜氨酸-(对氨基)苄基-(对硝基苯基)碳酸酯(0.595g,0.776mmol，通过本领域已知的方法制备，参见-Gangwar等人,美国专利7,714,016B2)溶解在无水DMF(10mL)中，将反应烧瓶用橡胶隔片密封，用氩气吹扫，并将混合物在环境温度搅拌。24小时后，将反应物在真空中部分蒸发至约2-3mL，用10％乙酸水溶液和水(各约1mL)处理，溶解在乙腈(约6mL)中，并通过快速色谱法在275g C18硅胶柱(30-90％乙腈水溶液，历时20分钟，0.05％乙酸在两种溶剂中)上纯化。部分蒸发，冷冻，和低压冻干，得到作为白色固体的标题化合物(0.362g,68％)。MS(ESI,pos.)：C₇₀H₈₈ClN₉O₁₇的计算值，1361.6；实测值1362.1(M+H),1384.1(M+Na),1344.1(M-H₂O+H)。

步骤2：将上述步骤的产物(0.360g,0.264mmol)溶解在5％哌啶的DMF溶液(7mL)中，将反应烧瓶用橡胶隔片密封，用氩气吹扫，并将混合物在环境温度搅拌。3小时后，将反应物在真空中蒸发，将残余物用10％乙酸水溶液(2mL)处理，溶解在乙腈(4mL)中，并通过快速色谱法在275g C18硅胶柱(10-70％乙腈水溶液，历时20分钟，0.05％乙酸在两种溶剂中)上纯化。将纯的级分合并，在-20℃储存过夜，在真空中在25-30℃部分蒸发，在干冰上冷冻，并低压冻干6天，得到作为淡黄色固体的标题化合物(0.303g,95％)。MS(ESI,pos.)：C₁₅H₇₈ClN₉O₁₅的计算值,1139.5；实测值1140.1(M+H),1162.0(M+Na)。

美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-N-Me-β-丙氨酸-氨基甲酰基-(对氨基)苄基-瓜氨酸-缬氨酸-己二酸(化合物8,图20).将上述步骤的产物(化合物7,图20,0.205g,0.171mmol)、己二酸(0.258g,1.77mmol)和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ,0.215g,0.869mmol)溶解在干燥DCM(10mL)和无水甲醇(5mL)中，将反应烧瓶用橡胶隔片密封，用氩气吹扫，并将混合物在环境温度搅拌。21小时后，将反应物在真空中蒸发，将残余物溶解在几毫升乙腈/水中，并通过快速色谱法在150g C18硅胶柱(20-80％乙腈水溶液，历时17分钟，0.05％乙酸在两种溶剂中)上纯化。将纯的级分部分蒸发、冷冻和低压冻干18小时，得到作为白色固体的标题化合物(0.140g,65％)。MS(ESI,pos.)：C₆₁H₈₆ClN₉O₁₈的计算值,1267.6；实测值1268.9(M+H),1290.9(M+Na)。

美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-N-Me-β-丙氨酸-氨基甲酰基-(对氨基)苄基-瓜氨酸-缬氨酸-已二酰基-琥珀酸酯(化合物1,图20).将上述步骤的产物(化合物8,图20,0.061g,0.048mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(0.063g,0.55mmol)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl,0.071g,0.37mmol)溶解在干燥DCM(7mL)中，将反应烧瓶用橡胶隔片密封，用氩气吹扫，并将混合物在环境温度搅拌。5天后，将反应物在真空中蒸发，将残余物溶解在几毫升乙腈/水中，并通过快速色谱法在100g C18硅胶柱(30-90％乙腈水溶液，历时15分钟，0.05％乙酸在两种溶剂中)上纯化。将最干净的产物级分部分蒸发、冷冻和低压冻干18小时，得到作为白色固体的标题化合物(0.044g,67％)。MS(ESI,pos.)：C₆₅H₈₉ClN₁₀O₂₀的计算值，1364.6；实测值1365.7(M+H),1387.7(M+Na),1347.7(M-H₂O+H)。¹H-NMR(500MHz；CDCl₃):δ7.56(d,J＝8.3Hz,2H),7.20(d,J＝8.7Hz,1H),6.80(s,1H),6.71(m,1H),6.62(d,J＝10.0Hz,1H),6.39(dd,J＝15.1,11.3Hz,1H),5.68(dd,J＝15.3,9.1Hz,1H),5.38-5.32(m,1H),5.03(t,J＝15.1Hz,1H),4.88(d,J＝12.3Hz,1H),4.73(d,J＝11.3Hz,1H),4.61(dd,J＝9.1,3.6Hz,1H),4.26(d,J＝7.0Hz,1H),4.17(t,J＝7.1Hz,1H),3.95(s,3H),3.61(d,J＝11.7Hz,1H),3.57(d,J＝12.4Hz,1H),3.46(d,J＝9.1Hz,2H),3.33(s,3H),3.27(t,J＝6.9Hz,1H),3.17-3.07(m,5H),2.97(dd,J＝16.6,9.9Hz,1H),2.88(d,J＝11.7Hz,3H),2.84(s,4H),2.77(s,2H),2.66(s,2H),2.62(t,J＝4.8Hz,2H),2.56(d,J＝13.1Hz,1H),2.32(t,J＝6.6Hz,2H),2.15(d,J＝14.0Hz,1H),2.10(q,J＝6.8Hz,1H),1.92(s,4H),1.75(m,5H),1.61(s,3H),1.52(s,3H),1.27(d,J＝6.3Hz,3H),1.22(dt,J＝12.7,6.3Hz,6H),0.95(t,J＝5.9Hz,7H),0.78(s,3H)。

基于WO 2015/031396(例如，实施例2,段落[00106])中描述的程序合成DM1作为单一非对映异构体，其通过引用整体并入本文。

实施例22.抗体缀合和缀合物的表征

抗体缀合

在环境温度，将在50mM HEPES、150mM NaCl(pH 8.0)和10-15％(v/v)DMA中的抗体(H4H14639D、H4H13312P、H4H14635D和同种型对照；10-20mg/ml)与5-6倍过量的如实施例21中所述制备的SMCC-DM1非对映异构体(拟美坦辛A)或美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-N-Me-β-丙氨酸-氨基甲酰基-(对氨基)苄基-瓜氨酸-缬氨酸-已二酰基-琥珀酸酯(化合物1,图20)(拟美坦辛B)在环境温度缀合2小时。将缀合物通过尺寸排阻色谱法或大量超滤进行纯化并无菌过滤。通过UV光谱分析测定蛋白浓度。尺寸排阻HPLC确定，所用的所有缀合物均>90％单体，并且RP-HPLC确定，存在<1％未缀合的接头有效负载。根据Hamblett等人(AmericanAssociation for Cancer Research.2004年10月15日；10(20):7063-70)和/或通过天然相对于缀合的质量差异，关于接头有效负载值通过UV分析所有缀合的抗体。在表24中报告了有效负载与抗体的比率。

表24：每种抗体药物缀合物的产率百分比和有效负载与抗体的比率

通过液相色谱法-质谱法表征缀合物

为了确定接头-有效负载在抗体上的加载，将缀合物去糖基化，并通过LC-MS分析。

对于测定，将50μg缀合物用milli-Q水稀释至1mg/mL的终浓度。将十μL PNGase F溶液[通过添加150μL PNGase F原液(New England Biolabs，目录号P0704L)和850μLmilli-Q水并混合均匀，制备PNGase F溶液]加入稀释的缀合物溶液中，然后在37℃温育过夜。在LC-MS(Waters Synat G2-Si)上注射5μL每种样品，并在25分钟内用0.1mL/分钟的20-40％梯度流动相(流动相A:0.1％v/v FA在H₂O中；流动相B:0.1％(v/v)FA在乙腈中)洗脱。在80℃在Waters Acquity BEH C4柱(1.0X 50mM,1.7μM)上实现LC分离。

使用Masslynx软件对质谱波谱进行解卷积，并使用以下方程式计算药物与抗体的比率(DAR)：

1.根据分布峰强度(PI)的药物相对百分比(％)(Dn)：

Dn％＝PIn/∑(PI0+PI1+PI2……+PIi)×100

(n＝0,1,2,3,…,i)

2.平均DAR计算：

DAR＝∑(1×D1％+2×D2％+3×D3％+……+i×Di％)

实施例23.表面等离子体共振得出的缀合的人单克隆抗-MET(单特异性的和双特异性的)抗体的结合亲和力和动力学常数

在Biacore 2000仪器上使用实时表面等离子体共振生物传感器测定法测定MET结合抗-MET抗体的平衡解离常数(K_D值)，所述抗-MET抗体缀合了MCC-DM1非对映异构体(拟美坦辛A)或美坦辛-3-N-甲基-L-丙氨酸-N-Me-β-丙氨酸-氨基甲酰基-(对氨基)苄基-瓜氨酸-缬氨酸-已二酰基-琥珀酸酯(化合物1,图20)(拟美坦辛B)。通过与单克隆小鼠抗-人Fc抗体(GE Healthcare,#BR-1008-39)的胺偶联来衍生Biacore传感器表面，以捕获表达有人恒定区的抗-MET ADC和亲本未修饰的抗体。在HEPES缓冲盐水(HBS)-EP运行缓冲液(0.01MHEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.05％v/v表面活性剂P20)中进行Biacore结合研究。在内部制备表达C-端myc-myc-六组氨酸标签的人MET(hMET-mmh)。将在HBS-EP运行缓冲液中制备的不同浓度(3倍稀释)的hMET-mmh(范围从30nM至1.1nM)以40μL/min的流速注射到抗-MET ADC或抗体捕获表面上。监测hMET-mmh与每种捕获的ADC和单克隆抗体的缔合4分钟。随后，在HBS-EP运行缓冲液中监测hMET-mmh解离6分钟。通过短暂注射20mM H₃PO₄再生抗-人Fc表面。所有结合动力学实验均在25℃进行。

通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时传感图拟合至1:1结合模型，确定动力学缔合(k_a)和解离(k_d)速率常数。通过从相应的分析物传感图减去缓冲液注射传感图信号来双重参考所有传感图，从而除去由抗体从捕获表面解离引起的伪像。如下从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(K_D)和解离半衰期(t1/2)：

和

拟美坦辛A或拟美坦辛B缀合的抗-Met单特异性和双特异性抗体的结合动力学参数如下表25所示，一些实验一式两份地进行。

表25：缀合的单特异性和双特异性单克隆抗-MET抗体在25℃的Biacore结合亲和力

实施例24：抗-MET抗体药物缀合物(ADC)的体外效能

为了确定本文描述的抗-MET抗体药物缀合物(ADC)的相对细胞杀死效能，在表达不同水平的内源性MET的多个细胞系上进行了细胞杀死测定。将EBC-1(Riken Cell Bank；#RBRC-RCB1965)、MKN-45(JCRB；#JCRB0254)、NCI-H1993(ATCC；#CRL-5909)和J.RT3(ATCC；#TIB-153)细胞系维持在RPMI+10％FBS+1X青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(P/S/G)中，将SNU-5(ATCC；#CRL-5973)维持在Iscove氏+10％FBS+1X P/S/G中，将Hs746t(ATCC；#HTB-135)和HEK293(ATCC；#003041)维持在DME+10％FBS+1X P/S/G中，将MDA-MB-231(ATCC；#HTB-26)维持在Liebowitz氏L-15+10％FBS+1X P/S/G+1X非必需氨基酸(NEAA)(没有CO₂)中，将U87MG(ATCC；#HTB-14)维持在MEM Earle氏盐+15％FBS+1X P/S/G+1X NEAA中，将T47D(ATCC；#HTB-133)维持在RPM1 1640+10％FBS+1X P/S/G+10mM HEPES+1mM丙酮酸钠+10ug/ml牛胰岛素中，和将A549(ATCC；#CCL-185)维持在Kaighn氏营养物混合物F-12(HAM's F-12K)+10％FBS+1X P/S/G中。

最初，通过流式细胞计量术在整个细胞系组中用未缀合的H4H14635D、H4H14639D和H4H13312P2抗体评估抗-MET抗体的相对结合。简而言之，将1x10⁶个细胞与10μg/ml的H4H14635D、H4H14639D、H4H13312P2或同种型对照抗体(REGN1945)在冰上在PBS+2％FBS(FACS缓冲液)中温育30分钟。用FACS缓冲液洗涤一次后，将细胞与10μg/ml的Alexa647缀合的抗-人第二抗体(Jackson ImmunoResearch,#109-606-170)在冰上温育30分钟。在用FACS缓冲液再洗涤一次后，将样品用Cytofix(BD Biosciences,#554655)固定，用FACS缓冲液过滤并在iQue流式细胞计(Intelicyte)上运行。使用FlowJo软件(FlowJo LLC)确定平均荧光强度(MFI)数据。将FACS结合表达为相对于同种型对照水平的倍数MFI结合，并且将结果总结在表26中。三种抗-Met抗体的相对结合在每种细胞系上是相当的，并且范围是同种型对照的447倍至7倍。在T47D、HEK293或J.RT3细胞上未观察到测试的3种抗-MET抗体中的任一种的可检测结合。

为了测量抗-MET ADC的体外细胞毒性，评估了用ADC处理3或6天后的细胞核计数。简而言之，将细胞以750-3000个细胞/孔接种于96孔胶原包被的平板(Greiner,VWR；#82050-812)内的完全生长培养基中，并在37℃、5％CO₂下生长过夜。对于细胞存活率曲线，将连续稀释的ADC、未缀合的抗体或游离的有效负载以范围为100nM至0.01nM的终浓度(基于毒素浓度)加给细胞，并在37℃、5％CO₂下温育3或6天。随后将细胞用3ug/ml Hoechst33342核染剂(Invitrogen,#H3570)处理，同时用4％甲醛固定。在Image Xpress micro XL(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)上获得图像，并通过MetaXpress图像分析软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)测定细胞核计数。从所有孔中减去用40nM洋地黄皂苷处理的细胞的背景细胞核计数，并将存活率表示为未处理对照的百分比。通过10-点响应曲线(GraphPad Prism)上的四参数逻辑方程确定IC₅₀值。每个剂量-响应曲线的未处理条件也被包括在分析中并表示为最低剂量。IC₅₀值和细胞杀死百分比显示在表27和28中。

如表27中所总结的，抗-MET抗体-药物缀合物H4H14639D-拟美坦辛A特异性地降低Met扩增的EBC-1、SNU-5、MKN-45、NCI-H1993和Hs746t细胞背景中的细胞存活率，IC₅₀值范围为0.35nM至0.96nM。杀死的细胞百分比(最大杀死％)范围为73％至100％。H4H14639D-拟美坦辛A也特异性地杀死了84％的A549细胞，IC₅₀值为13.91nM。H4H14639D-拟美坦辛A在低表达细胞系(MDA-MB-231和U87MG)和非表达细胞系(T47D、HEK293和J.RT3)中的IC₅₀值大于37nM。类似缀合的同种型对照抗体杀死所有细胞系，IC₅₀值大于35nM。甲基二硫化物形式的DM1(MeS-DM1)杀死所有测试的细胞系，IC₅₀值范围为0.07nM至2.86nM。

在另一个实验中，三种抗-Met抗体(H4H14639D、H4H14635D和H4H13312P2)与拟美坦辛A或拟美坦辛B拟美坦辛有效负载缀合，并在6天处理后在EBC-1、Hs746t、A549和T47D细胞中评估体外细胞毒性。如表28所总结的，所有抗-Met抗体-药物缀合物均有效地且特异性地降低了Met阳性细胞的细胞存活率，IC₅₀值在EBC-1细胞中低至10pM，在Hs746t细胞中低至0.82nM，在A549细胞中低至3.5nM。杀死的细胞百分比在EBC-1细胞中大于95％，在Hs746t细胞中大于86％，在A549细胞中大于72％。T47D细胞(Met阴性)未被抗-Met ADC特异性杀死。类似缀合的同种型对照抗体降低了所有测试细胞系中的细胞存活率，IC₅₀值在EBC-1细胞中大于5nM，在Hs746t细胞中大于33nM，在A549和T47D细胞中大于90nM。未缀合的H4H14639D降低了EBC-1、Hs746t和A549细胞的细胞存活率，但其比缀合抗体的百分比更低。未缀合的H4H14635D和H4H13312P2在任何测试的细胞系中对存活率几乎没有影响或根本没有影响。甲基二硫化物形式的DM1(MeS-DM1)杀死所有测试的细胞系，IC₅₀值范围为0.12nM至1.39nM。相反，M24(拟美坦辛B释放的有效负载)以>100nM的IC50杀死细胞。

表26：未缀合的MET抗体与肿瘤细胞系的FACS结合。

*表示为相对于NCI-H1993未染色的倍数。

表27：在3天体外细胞毒性测定中抗-MET ADC的IC₅₀和最大杀死％。

表28：在6天体外细胞毒性测定中抗-MET ADC的IC₅₀和最大杀死％。

实施例25：对胃癌细胞的体内效力

将3百万个Hs746T胃癌细胞皮下植入C.B.-17SCID小鼠的胁腹。一旦肿瘤体积达到约150mm³，将小鼠随机分成6组，并用10mg/kg的对照抗体REGN1945-拟美坦辛B或REGN1945-拟美坦辛A或3或10mg/kg的H4H14639D-拟美坦辛A或H4H14639D-拟美坦辛B处理。所有抗体以每周一次的频率施用三次。植入后监测肿瘤生长37天。

评估了H4H14639D-拟美坦辛A或H4H14639D-拟美坦辛B对免疫受损小鼠中人肿瘤异种移植物生长的作用，结果显示在表29中。用对照抗体REGN1945-拟美坦辛B或REGN1945-拟美坦辛A处理的肿瘤在20天内生长达到方案大小限制。用3mg/kg的H4H14639D-拟美坦辛A处理的肿瘤在27天内生长达到方案大小限制。在实验期间，用3mg/kg的H4H14639D-拟美坦辛B处理的肿瘤的生长受到抑制。用10mg/kg的H4H14639D-拟美坦辛A或H4H14639D-拟美坦辛B处理肿瘤与治疗开始相比诱导了肿瘤大小的消退。

表29：用抗-Met-C抗体缀合物处理的SCID小鼠中的肿瘤生长

实施例26：对肺癌细胞的体内效力

将5百万个EBC1肺癌细胞皮下植入C.B.-17SCID小鼠的胁腹。一旦肿瘤体积达到约170mm³，将小鼠随机分成6组，并用15mg/kg的对照抗体REGN1945-拟美坦辛B或2.5、5、10或15mg/kg的H4H14639D-拟美坦辛B处理。抗体以每周一次的频率施用两次。植入后监测肿瘤生长73天。

评估了H4H14639D对免疫受损小鼠中人肿瘤异种移植物生长的作用。用对照抗体REGN1945-拟美坦辛B处理的肿瘤在24天内生长达到方案大小限制(IACUC方案要求杀死具有超过2cm直径、大约1500mm³的肿瘤的动物)。用2.5、5、10或15mg/kg的H4H14639D-拟美坦辛B处理肿瘤与处理开始时相比诱导了肿瘤大小的消退。结果显示在表30中。

表30：用抗-Met-C抗体缀合物处理的SCID小鼠中的肿瘤生长

实施例27：对患者衍生的NSCLC肿瘤的体内效力

将表达Met的NSCLC CTG-0165患者衍生的肿瘤皮下植入nu/nu裸鼠的胁腹。一旦肿瘤体积达到约150mm³，将小鼠随机分成6组，并用10mg/kg的对照抗体REGN1945-拟美坦辛B或REGN1945-拟美坦辛A或3或10mg/kg的H4H14639D-拟美坦辛A或H4H14639D-拟美坦辛B处理。所有抗体以每周一次的频率施用三次。植入后监测肿瘤生长61天。

评估了H4H14639D-拟美坦辛A或H4H14639D-拟美坦辛B对免疫受损小鼠中人肿瘤异种移植物生长的作用。用对照抗体REGN1945-拟美坦辛A或REGN1945-拟美坦辛B处理的肿瘤在27天内生长达到方案大小限制。用3mg/kg的H4H14639D-拟美坦辛A或H4H14639D-拟美坦辛B处理的肿瘤的生长被抑制27天。用10mg/kg的H4H14639D-拟美坦辛A或H4H14639D-拟美坦辛B处理肿瘤与治疗开始相比诱导了肿瘤大小的消退。数据提供在表31中。

表31：用抗-Met-C抗体缀合物处理的裸鼠中的肿瘤生长

实施例28：基于氢/氘(H/D)交换的表位作图，与人MET结合的抗-Met抗体H4H13312P2、H4H13306P2和H4H14639D的表位作图

进行实验以确定与抗-Met抗体H4H13312P2、H4H13306P2和H4H14639D相互作用的人肝细胞生长因子受体胞外结构域(SEQ ID NO:155:表达有myc-myc-六组氨酸(.mmh)标签的人Met异形体1(Uniprot ID:P08581)；以下称为hMet)的特定区域。H4H13312P2和H4H13306P2是二价单特异性抗-Met抗体；H4H14639D是双特异性抗体，其包含两个结合Met上的不同表位的重链(分别来自H4H13312P2和H4H13306P2)以及通用轻链。(参见实施例5)。

使用氢/氘(H/D)交换表位作图与质谱法(HDX-MS)来确定上述抗体的结合表位。HDX方法的一般描述阐述在例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；以及Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A中。

实验规程

为了通过HDX绘制抗-Met抗体H4H13312P2、H4H13306P2和H4H14639D在hMET上的结合表位，将各种抗体分别共价连接到NHS激活的Sepharose 4Fast Flow珠子(GEHealthcare，Pittsburgh，PA)。如下所述，使用两种方法“抗原上(On-Antigen)”和“复合物上(On-Complex)”来确认抗-Met抗体的结合表位。

在‘抗原上’实验条件下，将hMET在用D₂O制备的PBS缓冲液中氘化5.0分钟或10.0分钟。通过短暂温育将氘化抗原与H4H13312P2或H4H13306P2抗体珠子结合，然后用冰冷的低pH淬灭缓冲液从珠子中洗脱。将洗脱的样品手动加载到Waters H/DX-MS系统，该系统由整合的在线肽消化、截留、9.0分钟液相色谱法(LC)分离和Synapt G2-Si MS数据采集组成。

在‘复合物上’实验条件下，首先将hMET与H4H13312P2或H4H13306P2珠子结合，然后通过在用D₂O制备的PBS缓冲液中温育，氘化5.0分钟或10.0分钟。如上所述，通过WatersH/DX-MS系统洗脱和分析氘化的hMET。

为了鉴定来自hMET的消化性肽，使用Waters ProteinLynx Global Server(PLGS)软件处理来自未氘化样品的LC-MS^E数据并针对人MET进行搜索。将鉴定的肽导入DynamX3.0软件，并按以下两个标准过滤：1)每个氨基酸的最小产物为0.3；2)复制文件阈值为3.0。随后，DynamX 3.0软件在5分钟和10分钟的氘化时间点上自动计算“抗原上”和“复合物上”之间每种鉴定的肽的氘吸收差异。通过DynamX软件为质心值计算拾取的每个肽的单个同位素峰也被手动检查以确保氘吸收计算的准确性。

一般而言，将高于0.2的氘化δ值用作确定特异性结合表位的截止点。

结果

通过Waters Enzymate^TMBEH胃蛋白酶柱(2.1x 30mm,5μm)进行在线胃蛋白酶消化，结合9.0分钟LC-MS^E数据采集，当使用H4H13312P2抗体珠子时，用‘抗原上’和‘复合物上’实验的可追踪氘吸收可再现地鉴定来自人MET的总共162种消化性肽。这些肽代表55.7％的序列覆盖率。在所有这些肽中，与单独抗原的氘化(‘抗原上’)相比，仅发现五个在结合H4H13312P2(‘复合物上’)后具有显著降低的氘化吸收。在这两种实验条件下这五种肽的质心值示于表32中。根据HDX数据，对应于由这五种肽覆盖的残基192-204的区域被定义为抗体H4H13312P2的结合表位。

表32：与H4H13312P2结合后具有降低的氘吸收的hMET消化性肽

对于使用H4H13306P2抗体珠子进行的HDX实验，在‘抗原上’和‘复合物上’实验期间用可追踪的氘吸收可再现地鉴定出来自hMET的总共98种消化性肽。这98种肽代表52.1％的序列覆盖率。在所有这些肽中，与单独抗原的氘化(‘抗原上’)相比，观察到十二个在结合H4H13306P2(‘复合物上’)后具有显著降低的氘化吸收。在这两种实验条件下这十二种肽的质心值示于表33中。根据HDX数据，对应于这些肽所覆盖的残基305-315和残基421-455的区域被定义为抗体H4H13306P2的结合表位。

表33：与H4H13306P2结合后具有降低的氘吸收的hMET消化性肽

使用与上述相同的方法确定双特异性抗-Met抗体H4H14639D的结合表位。通过该方法确定的hMET上的H4H14639D结合表位对应于针对亲本抗体确定的表位。

抗-Met抗体H4H13312P2的结合表位：SEQ ID NO:155的氨基酸192-204:VRRLKETKDGFMF(SEQ ID NO:156)。

抗-Met抗体H4H13306P2的结合表位：SEQ ID NO:155的氨基酸305-315：LARQIGASLND(SEQ ID NO:157)和SEQ ID NO:155的氨基酸421-455：FIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNF(SEQ ID NO:158)。

实施例29：MET x MET双特异性抗体ADC在葡萄膜黑素瘤细胞系中对细胞增殖和细胞存活率的抑制

将双特异性c-Met抗体H4H14639D缀合至两种拟美坦辛有效负载之一并命名为H4H14639D-拟美坦辛A和H4H14639D-拟美坦辛B，然后在葡萄膜黑素瘤细胞系中进行测试以确定相对于细胞系中的c-Met表达对细胞增殖和细胞存活率的影响。

在第一个实验中，将表达c-Met、OMM1.3、Mel202、Mel270和MP65的葡萄膜黑素瘤细胞以每孔1,000个细胞接种在96-孔平板内的含10％FBS的RPMI中过夜，并在37℃、5％CO₂下温育。将细胞用从0.01nM直到100nM的递增剂量的REGN1945、REGN1945-拟美坦辛A、REGN1945-拟美坦辛B、H4H14639D、H4H14639D-拟美坦辛A和H4H14639D-拟美坦辛B处理七天。7天后，使用Emax Plus Microplate Reader(Molecular Devices)，通过在比色测定(Dojindo Cell Counting Kit 8)中测量WST-8的减少来确定相对细胞存活率。

在第二个实验中，将表达c-Met的葡萄膜黑素瘤细胞OMM1.3、以及c-Met阴性的OCM3细胞以每孔1,000个细胞接种在96-孔平板内含10％FBS的RPMI中过夜，并在37℃、5％CO₂下温育。将细胞用从0.3125nM直到10nM的递增剂量的REGN1945、REGN1945-拟美坦辛B、H4H14639D和H4H14639D-拟美坦辛B处理。7天后，使用Emax Plus Microplate Reader(Molecular Devices)，通过在比色测定(Dojindo Cell Counting Kit 8)中测量WST-8的减少来确定相对细胞存活率。

表34-38以及图21和22显示，与拟美坦辛有效负载缀合的双特异性c-Met抗体H4H14639D-拟美坦辛B相对于对照处理降低了表达c-Met蛋白的葡萄膜黑素瘤细胞的存活率。H4H14639D-拟美坦辛B对c-Met阴性细胞系的存活率没有影响。图21以对数标度描述了在较低ADC浓度对细胞存活率的影响。H4H14639D-拟美坦辛A数据也显示在图21中。未缀合的抗体H4H14639D没有显著降低表达c-Met的葡萄膜黑素瘤细胞的存活率，表明这些细胞不依赖于Met信号传递即可存活。来自第三个实验的数据显示在图33中，其中在3天中用递增剂量的REGN1945、REGN1945-拟美坦辛B、H4H14639D和H4H14639D-拟美坦辛B处理十三个细胞系。H4H14639D-拟美坦辛B以剂量依赖性的方式降低表达MET的葡萄膜黑素瘤细胞系的存活率，IC50小于1nM。

表34：H4H14639D-拟美坦辛B处理后Mel270细胞的存活率百分比

表35：H4H14639D-拟美坦辛B处理后Mel202细胞的存活率百分比

表36：H4H14639D-拟美坦辛B处理后OMM1.3细胞的存活率百分比

表37：H4H14639D-拟美坦辛B处理后MP65细胞的存活率百分比

表38：H4H14639D-拟美坦辛B处理后OCM3细胞的存活率百分比

实施例30：MET x MET双特异性抗体ADC诱导葡萄膜黑素瘤细胞中的细胞凋亡

将表达c-Met的葡萄膜黑素瘤细胞OMM1.3和Mel202以及c-Met阴性细胞系OCM3以每板800,000个细胞接种在60mm³平板内的含10％FBS的RPMI中过夜，并在37℃、5％CO₂下温育。将细胞用1.25、2.5nM或10nM REGN1945(同种型对照抗体)、REGN1945-拟美坦辛A、H4H14639D或H4H14639D-拟美坦辛B处理48小时。然后将细胞用胰蛋白酶收获，用PBS洗涤，用4％低聚甲醛在室温固定30分钟，并在4℃用DAPI染色过夜。将细胞置于显微镜载玻片上并用Cytoseal 40密封。在显微镜下用紫外光激发DAPI荧光，对细胞凋亡的细胞进行定量。

缀合至拟美坦辛有效负载的双特异性c-Met抗体H4H14639D-拟美坦辛B相对于对照处理和c-Met阴性细胞系(参见表41)以剂量依赖性的方式显著诱导表达c-Met蛋白的葡萄膜黑素瘤细胞的细胞凋亡(参见表39和40)。也参见图23和24。在另一个实验中，当用10nM的METxMET-ADC处理48小时时，在表达c-Met的细胞系OMM1.3和Mel202中诱导高达40％的细胞凋亡，但在OCM3中没有诱导细胞凋亡(数据未显示)。通过将c-Met特异性抗体与细胞毒性化合物缀合，可以选择性地靶向葡萄膜黑素瘤细胞进行细胞凋亡。

表39：H4H14639D-拟美坦辛B在OMM1.3细胞中诱导的细胞凋亡

表40：H4H14639D-拟美坦辛B在Mel202细胞中诱导的细胞凋亡

表41：H4H14639D-拟美坦辛B在OCM3细胞中诱导的细胞凋亡

实施例31：MET x MET双特异性抗体ADC改变葡萄膜黑素瘤细胞中的细胞周期

将表达c-Met的葡萄膜黑素瘤细胞OMM1.3和Mel202以及c-Met阴性细胞系OCM3以每板800,000个细胞接种在60mm³平板内的含10％FBS的RPMI中过夜，并在37℃、5％CO₂下温育。将细胞不经处理或用10nM H4H14639D-拟美坦辛B处理1、3、6、24和48小时。然后将细胞用胰蛋白酶收获，用PBS洗涤，用冷的70％乙醇在-20℃固定过夜，在Millipore抗-MPM2抗体中温育2小时，用PBS洗涤，在与Alexa Fluor 488(Invitrogen)缀合的Invitrogen抗-小鼠IgG中温育，并再次用PBS洗涤。然后将细胞用500μg/ml碘化丙啶染色并在4℃温育过夜。然后将细胞穿过细胞过滤器，然后通过BD Bioscience LSR II流式细胞计运行。使用FCSExpress 6通过De Novo软件分析数据。

缀合至拟美坦辛有效负载的双特异性c-Met抗体H4H14639D-拟美坦辛B在处理6-24小时后显著诱导OMM1.3和Mel202细胞中的有丝分裂停止(分别为图25和26)，但不诱导OCM3细胞中的有丝分裂停止(图27)。在24-48小时之间用H4H14639D-拟美坦辛B处理的表达c-Met的细胞中的SubG1群体增加，表明细胞凋亡的诱导，但在c-Met阴性细胞中的SubG1群体中没有看到增加。参见表42-44。细胞周期分析证实，拟美坦辛有效负载的引入仅在表达c-Met的细胞系OMM1.3和Mel202中诱导有丝分裂停止并因此诱导细胞凋亡，而在c-Met阴性的OCM3细胞系中没有诱导。

表42：在24小时H4H14639D-拟美坦辛B处理后的OMM1.3细胞周期分布

表43：在24小时H4H14639D-拟美坦辛B处理后的Mel202细胞周期分布

表44：在24小时H4H14639D-拟美坦辛B处理后的OCM3细胞周期分布

实施例32：在葡萄膜黑素瘤细胞系中的c-Met表达

进行蛋白质印迹分析以评估几种葡萄膜黑素瘤细胞系以及胃癌细胞系和肺癌细胞系中c-Met蛋白表达水平的差异。

将具有不同c-Met表达水平的细胞系(包括胃癌细胞系SNU-5、肺癌细胞系A549、以及葡萄膜黑素瘤细胞系Mel290、92.1、OMM1.3、OMM1、Mel285、Mel202、Mel270、OCM1A、OCM3、MP41、MP65、MP46和UM004)以每板1,000,000个细胞接种在60mm³平板内的含10％FBS的RPMI中，并在37℃、5％CO₂下温育24小时。然后将细胞用胰蛋白酶收获，用PBS洗涤，并用RIPA缓冲液裂解。将蛋白裂解物在20-孔Novex midi凝胶4-12％(Invitrogen)上运行，然后转移到PVDF膜上。然后将膜在5％脱脂奶粉中封闭，在针对c-Met(Cell Signaling)和微管蛋白(Cell Signaling)的第一抗体中在4℃在振荡器上温育过夜，用TBST洗涤，在与HRP缀合的适当第二抗体(GE Healthcare)中温育，并用TBST洗涤。将ECL HRP底物添加到膜上，并使用Fujifilm XA-2照相机拍摄荧光图像。

结果

葡萄膜黑素瘤细胞系通常以G蛋白(诸如GNAQ或GNA11)中的突变而著称，但它们也表现出不同的c-Met表达。如图28所示，除了OCM1A和OCM3细胞系(其恰好是BRAF^V600E-突变细胞)之外，每个葡萄膜黑素瘤细胞系都在一定水平上表达c-Met受体。SNU-5是已知高度表达c-Met的阳性对照胃癌细胞系，而A549是也表达c-Met的肺癌细胞系。

实施例33：MET x MET双特异性抗体ADC诱导PARP切割和组蛋白H3磷酸化

进行蛋白质印迹分析以评估用H4H14639D-拟美坦辛B处理后几种葡萄膜黑素瘤细胞系中的c-Met蛋白水平、PARP切割和组蛋白H3磷酸化。

将表达c-Met的葡萄膜黑素瘤细胞OMM1.3和Mel202、以及c-Met阴性细胞系OCM3以每板800,000个细胞接种在60mm³平板内的含10％FBS的RPMI中过夜，并在37℃、5％CO₂下温育。将细胞不处理或用0.5至10nM的递增剂量的REGN1945-拟美坦辛B、H4H14639D和H4H14639D-拟美坦辛B处理24小时。然后将细胞用胰蛋白酶收获，用PBS洗涤，并用RIPA缓冲液裂解。将蛋白裂解物在20-孔Novex midi凝胶4-12％(Invitrogen)上运行，然后转移到PVDF膜上。然后将膜在5％脱脂奶粉中封闭，在针对PARP(Cell Signaling)、磷酸化的组蛋白-H3(Cell Signaling)和微管蛋白(Cell Signaling)的第一抗体中在4℃在振荡器上温育过夜，用TBST洗涤，在与HRP缀合的适当第二抗体(GE Healthcare)中温育，并用TBST洗涤。将ECL HRP底物添加到膜上，并使用Fujifilm XA-2照相机拍摄荧光图像。

在另一个实验中，将表达c-Met的葡萄膜黑素瘤细胞OMM1.3、以及c-Met阴性细胞系OCM3以每板800,000个细胞接种在60mm³平板内的含10％FBS的RPMI中过夜，并在37℃、5％CO₂下温育。但是，在该实验中，将细胞不处理或用10nM REGN1945-拟美坦辛B、H4H14639D和H4H14639D-拟美坦辛B处理24、48和72小时的较长时间段。然后将细胞用胰蛋白酶收获，用PBS洗涤，并用RIPA缓冲液裂解。将蛋白裂解物在20-孔Novex midi凝胶4-12％(Invitrogen)上运行，然后转移到PVDF膜上。然后将膜在5％脱脂奶粉中封闭，在针对c-Met(Cell Signaling)、PARP(Cell Signaling)、磷酸化的组蛋白-H3(Cell Signaling)和微管蛋白(Cell Signaling)的第一抗体中在4℃在振荡器上温育过夜，用TBST洗涤，在与HRP缀合的适当第二抗体(GE Healthcare)中温育，并用TBST洗涤。将ECL HRP底物添加到膜上，并使用Fujifilm XA-2照相机拍摄荧光图像。

结果

图29的蛋白质印迹图像显示，H4H14639D-拟美坦辛B在处理24小时后在OMM1.3细胞和Mel202细胞中诱导PARP切割(一种细胞凋亡标志物)。REGN1945-拟美坦辛B和H4H14639D都没有诱导PARP切割。与c-Met阳性细胞系不同，OCM3细胞在H4H14639D-拟美坦辛B处理后没有表现出PARP切割。图29也显示与REGN1945-拟美坦辛B和H4H14639D相比在用H4H14639D-拟美坦辛B处理的OMM1.3和Mel202细胞中组蛋白H3磷酸化的显著增加，但是在OCM3细胞中没有。组蛋白H3磷酸化在有丝分裂过程中被诱导，并且是拟美坦辛诱导的细胞有丝分裂停止的证据。在图29中，组蛋白H3磷酸化仅在表达c-Met的细胞(OMM1.3和Mel202)中观察到，而在OCM3中未观察到，这证明拟美坦辛被c-Met抗体转运到细胞中。该数据进一步证明了c-Met ADC的特异性和有效性。

图30的蛋白质印迹图像显示了H4H14639D-拟美坦辛B处理的OMM1.3细胞中PARP切割的时间依赖性诱导，但是在REGN1945-拟美坦辛B或H4H14639D处理的OMM1.3细胞中不存在。在OCM3细胞中，PARP蛋白不受H4H14639D-拟美坦辛B处理影响。此外，与未处理和REGN1945-M114相比，当用H4H14639D和H4H14639D-M114处理时，总Met蛋白表达降低，指示用抗体或ADC处理后的受体内化。最后，在用H4H14639D-拟美坦辛B处理的OMM1.3细胞中存在组蛋白H3磷酸化的显著增加(相对于用REGN1945-拟美坦辛B或H4H14639D处理)，但是，该增加再次没有在OCM3细胞中观察到。

综上所述，示例性的双特异性抗-c-Met抗体H4H14639D抗体特异性地靶向表达该受体的细胞中的c-Met。通过将该抗体与拟美坦辛缀合(H4H14639D-拟美坦辛B)，可以在表达c-Met的葡萄膜黑素瘤细胞系中特异性地且有效地诱导细胞凋亡。

实施例34：MET x MET双特异性抗体ADC抑制表达c-Met的葡萄膜黑素瘤细胞的侵袭

将表达c-Met的葡萄膜黑素瘤细胞OMM1.3以每个插入物120,000个细胞接种在置于24-孔板中的基质胶插入物内的含有0.1％FBS的RPMI中过夜，并进行以下处理：未处理对照，125、250和500pM R1945、R1945-拟美坦辛B、H4H14639D和H4H14639D-拟美坦辛B。将含10％FBS和50ng/ml人HGF的RPMI作为化学引诱物放入孔中。大约24小时后，将基质胶的插入侧清除掉未迁移的细胞。将迁移的细胞用甲醇固定2分钟，用1％甲苯胺染色2分钟，并然后用ddH₂O洗涤两次。然后将干燥的基质胶置于显微镜载玻片上并用Cytoseal 60密封。使用Nikon TE-2000-U显微镜拍摄图像。

结果

相对于对照处理(R1945和R1945-拟美坦辛B)，双特异性c-Met抗体H4H14639D-拟美坦辛B从250pM开始显著抑制表达c-Met蛋白的OMM1.3葡萄膜黑素瘤细胞的侵袭。在用H4H14639D处理的细胞中，从250pM开始也存在显著的细胞侵袭抑制。但是，在此剂量，细胞存活率不受H4H14639D-拟美坦辛B中缀合的拟美坦辛有效负载影响。参见图32。

本公开内容在范围上不受本文描述的具体实施方案限制。实际上，除了本文描述的那些内容以外，本领域技术人员从前述描述和附图会明白本发明的不同改变。这样的改变意图落入所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 瑞泽恩制药公司

G·施瓦兹

O·苏里加

<120> 使用结合MET的抗-MET抗体和双特异性抗原结合分子治疗眼癌的方法

<130> 10548WO01

<140> TBD

<141> 2020-02-20

<150> 62/808,839

<151> 2019-02-21

<150> 62/823,788

<151> 2019-03-26

<160> 158

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 1

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtga ctccatcagt agttactatt ggacctggat ccggcagccc 120

ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atcttttaca gggggggcac cacctacaac 180

ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagttgaggt ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag gggagacgat 300

cttttagtgg tgacaagtgt ctactggtac atcgatctct ggggccgtgg caccctggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 2

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Phe Tyr Arg Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Asp Asp Leu Leu Val Val Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Ile Asp

100 105 110

Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 3

ggtgactcca tcagtagtta ctat 24

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Gly Asp Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr

1 5

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 5

atcttttaca gggggggcac c 21

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Ile Phe Tyr Arg Gly Gly Thr

1 5

<210> 7

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 7

gcgaggggag acgatctttt agtggtgaca agtgtctact ggtacatcga tctc 54

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 8

Ala Arg Gly Asp Asp Leu Leu Val Val Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Ile

1 5 10 15

Asp Leu

<210> 9

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 9

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtccggatt caccttcagt ggctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg gatggcagtt atatggtatg atggaagtaa tgattactat 180

ccagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agtcgaggac acggctgtgt attactgtgc gcgagatgcg 300

tgggacctac tacgttcctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

<210> 10

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Trp Asp Leu Leu Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 11

ggattcacct tcagtggcta tggc 24

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly

1 5

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 13

atatggtatg atggaagtaa tgat 24

<210> 14

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 14

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp

1 5

<210> 15

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 15

gcgcgagatg cgtgggacct actacgttcc tttgactac 39

<210> 16

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

Ala Arg Asp Ala Trp Asp Leu Leu Arg Ser Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 17

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagagtc 60

tcttgtgtag tgtctggatt caccttcagc agctttggca tgcattgggt ccgccaggct 120

ccagacaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa tgattactat 180

tcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgttt 240

ctacaaatga accgcctgag agccgaagac acggctgttt attactgtgc gcgagctaat 300

aactggaacc gttttgatgc ctttgatctc tggggccaag ggacaatggt caccgtctct 360

tca 363

<210> 18

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Val Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Asp Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Asn Asn Trp Asn Arg Phe Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

ggattcacct tcagcagctt tggc 24

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

1 5

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 21

atatggtatg atggaagtaa tgat 24

<210> 22

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 22

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp

1 5

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 23

gcgcgagcta ataactggaa ccgttttgat gcctttgatc tc 42

<210> 24

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 24

Ala Arg Ala Asn Asn Trp Asn Arg Phe Asp Ala Phe Asp Leu

1 5 10

<210> 25

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggagggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt catcttcagt aattatgaaa tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gactggaatg gatttcatac attactagta gtggtaatat gaaatattac 180

gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgacaagaa ttcactgtat 240

ctgcaaatga gtagtctgag agtcgaggac acggctgttt attattgtgt gagaggaggg 300

cgatttttgg agtggttgac ctactacgtt atggtcgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 26

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ser Tyr Ile Thr Ser Ser Gly Asn Met Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu Trp Leu Thr Tyr Tyr Val Met Val

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 27

ggattcatct tcagtaatta tgaa 24

<210> 28

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr Glu

1 5

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

attactagta gtggtaatat gaaa 24

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 30

Ile Thr Ser Ser Gly Asn Met Lys

1 5

<210> 31

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 31

gtgagaggag ggcgattttt ggagtggttg acctactacg ttatggtcgt c 51

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 32

Val Arg Gly Gly Arg Phe Leu Glu Trp Leu Thr Tyr Tyr Val Met Val

1 5 10 15

Val

<210> 33

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 33

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag tgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaaat atttggtatg atggaactaa tgattactat 180

ccatactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attcccagaa cacactatat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gagagaggac 300

ttcattaact accggtcttt tgactattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

<210> 34

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 34

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Asp Tyr Tyr Pro Tyr Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Phe Ile Asn Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 35

ggattcacct tcagtagcta tggc 24

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 36

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly

1 5

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 37

atttggtatg atggaactaa tgat 24

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 38

Ile Trp Tyr Asp Gly Thr Asn Asp

1 5

<210> 39

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 39

gcgagagagg acttcattaa ctaccggtct tttgactat 39

<210> 40

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 40

Ala Arg Glu Asp Phe Ile Asn Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 41

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 41

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc cagggacgtc cctgagactc 60

tcctgtgtcg cgtctggatt caccttcaga aattttggaa tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaaat atatggtttg acggaagtaa tgagaactat 180

gtcgagtcca ttcagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgaat 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac tcggctgtct attactgtgt gagagaggga 300

atcctaggaa ctactaatcc ttatgatgct tttgatgtct ggggccaagg gacaatggtc 360

accgtctctt ca 372

<210> 42

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu Asn Tyr Val Glu Ser Ile

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Glu Gly Ile Leu Gly Thr Thr Asn Pro Tyr Asp Ala Phe Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 43

ggattcacct tcagaaattt tgga 24

<210> 44

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 44

Gly Phe Thr Phe Arg Asn Phe Gly

1 5

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 45

atatggtttg acggaagtaa tgag 24

<210> 46

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 46

Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Glu

1 5

<210> 47

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 47

gtgagagagg gaatcctagg aactactaat ccttatgatg cttttgatgt c 51

<210> 48

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 48

Val Arg Glu Gly Ile Leu Gly Thr Thr Asn Pro Tyr Asp Ala Phe Asp

1 5 10 15

Val

<210> 49

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 49

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt cacctttagt aactttggaa tgcactgggt ccgccaggcg 120

ccaggcaagg gactggagtg ggtggcaggt atatggtttg atggaagtaa taaaaactat 180

atagactccg tgaagggccg attcaccatc tcaagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagagggc 300

tatgattcgg ggactgatta tatcccctat gatatttttg atatttgggg ccaagggaca 360

atggtcaccg tctcttca 378

<210> 50

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Gly Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys Asn Tyr Ile Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Ser Gly Thr Asp Tyr Ile Pro Tyr Asp Ile

100 105 110

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 51

ggattcacct ttagtaactt tgga 24

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 52

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly

1 5

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 53

atatggtttg atggaagtaa taaa 24

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 54

Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 55

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 55

gcgagagagg gctatgattc ggggactgat tatatcccct atgatatttt tgatatt 57

<210> 56

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 56

Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Ser Gly Thr Asp Tyr Ile Pro Tyr Asp Ile

1 5 10 15

Phe Asp Ile

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 57

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcacgtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attacttgga atagttataa catagactat 180

gctgactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagatgat 300

gactacagta actacgttta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 58

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 58

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Thr Trp Asn Ser Tyr Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Asp Asp Tyr Ser Asn Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 59

ggattcacct ttgatgatta tgcc 24

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 60

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 61

attacttgga atagttataa cata 24

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 62

Ile Thr Trp Asn Ser Tyr Asn Ile

1 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 63

gcaaaagatg atgactacag taactacgtt tactttgact ac 42

<210> 64

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 64

Ala Lys Asp Asp Asp Tyr Ser Asn Tyr Val Tyr Phe Asp Tyr

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<210> 65

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 65

caggttcagc tggtgcagtc cggaactgag gtgaaggagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgtaagg cctctggtta ctcctttacc acctatggta tcagctggct gcgacaggcc 120

cctggacaag gacttgagtg gatgggatgg atcagcactt acaatggtga cacaatctct 180

gcacagatgc tccaggacag agtcaccctg accgcagaca catccacgcg cacagcctac 240

atggaactga gaagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagaggtcat 300

gagtatgata gtcttgttta ttcttactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

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<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr Ile Ser Ala Gln Met Leu

50 55 60

Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Arg Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 67

ggttactcct ttaccaccta tggt 24

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 68

Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr Gly

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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Ile Ser Thr Tyr Asn Gly Asp Thr

1 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 71

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 72

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 73

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120

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ctgcaaatga acagcctgag agccgaagat acggctttat attattgtgc gagagaggcg 300

tgggacctac tacgtccctt tgactattgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 74

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp His Asp Gly Asp Val Glu Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Trp Asp Leu Leu Arg Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 75

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 75

ggattcacct tcagtagtta tgcc 24

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 76

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 77

atatggcatg atggagatgt tgaa 24

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 78

Ile Trp His Asp Gly Asp Val Glu

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 79

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 80

Ala Arg Glu Ala Trp Asp Leu Leu Arg Pro Phe Asp Tyr

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 81

gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctgggtt catcgtcacc accaactaca tgacctggct ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcactt atttatagca gtggtcacac atactacgca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agacacaatt ccaagaacac actgtatcta 240

caaatggaca gcctgagagc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag tgctttcgca 300

gcggatgttt ttgatatctg gggccaaggg acaatggtca ccgtctcttc a 351

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<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Val Thr Thr Asn

20 25 30

Tyr Met Thr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Leu Ile Tyr Ser Ser Gly His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg His Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Ala Phe Ala Ala Asp Val Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 83

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 83

gggttcatcg tcaccaccaa ctac 24

<210> 84

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 84

Gly Phe Ile Val Thr Thr Asn Tyr

1 5

<210> 85

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 85

atttatagca gtggtcacac a 21

<210> 86

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 86

Ile Tyr Ser Ser Gly His Thr

1 5

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 87

gcgagtgctt tcgcagcgga tgtttttgat atc 33

<210> 88

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 88

Ala Ser Ala Phe Ala Ala Asp Val Phe Asp Ile

1 5 10

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<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 89

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgttcag cgtctggatt ctccttcagt cactttggca tgcactgggt ccgccaggtt 120

ccaggcgggg gcctggagtg ggtgacaagt atatggtttg atggaagtaa tagatattat 180

gcagactcct tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa tactctgtat 240

ctggaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgt gagagagggg 300

atactgggaa ctactaatcc ttatgatgtt tttgatgtct ggggtcaggg gacaatggtc 360

accgtctctt ca 372

<210> 90

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 90

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser His Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gly Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Thr Ser Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Glu Gly Ile Leu Gly Thr Thr Asn Pro Tyr Asp Val Phe Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 91

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 91

ggattctcct tcagtcactt tggc 24

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 92

Gly Phe Ser Phe Ser His Phe Gly

1 5

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 93

atatggtttg atggaagtaa taga 24

<210> 94

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 94

Ile Trp Phe Asp Gly Ser Asn Arg

1 5

<210> 95

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 95

gtgagagagg ggatactggg aactactaat ccttatgatg tttttgatgt c 51

<210> 96

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 96

Val Arg Glu Gly Ile Leu Gly Thr Thr Asn Pro Tyr Asp Val Phe Asp

1 5 10 15

Val

<210> 97

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 97

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttaga agctatgtca tgagctggtt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagga atgagtggga gtggtggaag cacatcctac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attcaaagaa tacgctgtat 240

ctgctaatga acagcctgag aaccgaggac acggccgtat attattgtgc gaaagaaaac 300

ggggctaact ggaactacgg ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210> 98

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 98

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Met Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Leu Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Asn Gly Ala Asn Trp Asn Tyr Gly Tyr Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 99

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 99

ggattcacct ttagaagcta tgtc 24

<210> 100

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 100

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Val

1 5

<210> 101

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 101

atgagtggga gtggtggaag caca 24

<210> 102

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 102

Met Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 103

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 103

gcgaaagaaa acggggctaa ctggaactac ggctactacg gtatggacgt c 51

<210> 104

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 104

Ala Lys Glu Asn Gly Ala Asn Trp Asn Tyr Gly Tyr Tyr Gly Met Asp

1 5 10 15

Val

<210> 105

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 105

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgtag cgtctggatt ctccttcagt aactttggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcaatt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180

tcagactccg tgaagggccg cttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agtcgacgac acggctgtgt attactgtgc gagattcgat 300

cgctggaaat ttgacgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360

<210> 106

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 106

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Phe

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ser Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Phe Asp Arg Trp Lys Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 107

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 107

ggattctcct tcagtaactt tggc 24

<210> 108

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 108

Gly Phe Ser Phe Ser Asn Phe Gly

1 5

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 109

atatggtatg atggaagtaa taaa 24

<210> 110

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 110

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys

1 5

<210> 111

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 111

gcgagattcg atcgctggaa atttgacgct tttgatatc 39

<210> 112

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 112

Ala Arg Phe Asp Arg Trp Lys Phe Asp Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 113

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 113

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctttgcca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa tgattactat 180

gcagcctccg tgaagggccg tttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctggaaatga acagactgag agccgaggac acggctgtgt atcactgtgc gagagataac 300

tggaattact gggggggtat ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

<210> 114

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 114

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp Tyr Tyr Ala Ala Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Trp Asn Tyr Trp Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 115

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 115

ggattcacct tcagtagctt tgcc 24

<210> 116

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 116

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Ala

1 5

<210> 117

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 117

atatggtatg atggaagtaa tgat 24

<210> 118

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 118

Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp

1 5

<210> 119

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 119

gcgagagata actggaatta ctgggggggt atggacgtc 39

<210> 120

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 120

Ala Arg Asp Asn Trp Asn Tyr Trp Gly Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 121

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 121

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc tgggtgcagc cgggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cgcctttagt aattatgcca tgaactgggt ccgccagact 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt attagtagta gtggtggaaa cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcgccatc tccagagaca attccaggga tacgctgcat 240

ctgcaaatga acagactgag agtcgaggac acggccgtct attactgtgc gaaagaaata 300

cgtccgtatt acgatctttc ctactattac ggtatggacg tctggggcca agggaccacg 360

gtcaccgtct cctca 375

<210> 122

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 122

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Trp Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Val Ile Ser Ser Ser Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asp Thr Leu His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Glu Ile Arg Pro Tyr Tyr Asp Leu Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 123

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 123

ggattcgcct ttagtaatta tgcc 24

<210> 124

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 124

Gly Phe Ala Phe Ser Asn Tyr Ala

1 5

<210> 125

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 125

attagtagta gtggtggaaa caca 24

<210> 126

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 126

Ile Ser Ser Ser Gly Gly Asn Thr

1 5

<210> 127

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 127

gcgaaagaaa tacgtccgta ttacgatctt tcctactatt acggtatgga cgtc 54

<210> 128

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 128

Ala Lys Glu Ile Arg Pro Tyr Tyr Asp Leu Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Val

<210> 129

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 129

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagt cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcaga aatttctact ggagctggct ccggcagccc 120

ccagggaagg gactagagtg gattgggcac atcaattaca atgggggcac cgactacaac 180

ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaatca gttctccctg 240

aatttgaact ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag acagagattc 300

tacggtatgg acgtctgggg tccagggacc acggtcaccg tctcctca 348

<210> 130

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 130

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ser Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Asn Phe

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Leu Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly His Ile Asn Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Asn Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gln Arg Phe Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Pro Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 131

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 131

ggtggctcca tcagaaattt ctac 24

<210> 132

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 132

Gly Gly Ser Ile Arg Asn Phe Tyr

1 5

<210> 133

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 133

atcaattaca atgggggcac c 21

<210> 134

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 134

Ile Asn Tyr Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 135

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 135

gcgagacaga gattctacgg tatggacgtc 30

<210> 136

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 136

Ala Arg Gln Arg Phe Tyr Gly Met Asp Val

1 5 10

<210> 137

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 137

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300

caagggacac gactggagat taaa 324

<210> 138

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 138

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 139

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 139

cagagcatta gcagctat 18

<210> 140

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 140

Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

1 5

<210> 141

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 141

gctgcatcc 9

<210> 142

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 142

Ala Ala Ser

1

<210> 143

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 143

caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30

<210> 144

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 144

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr

1 5 10

<210> 145

<211> 1408

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 145

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Ser Thr Trp Trp Lys Glu Pro Leu Asn Ile Val Ser Phe Leu

755 760 765

Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn

770 775 780

Leu Asn Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala

785 790 795 800

Gly Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile

805 810 815

Ile Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro

820 825 830

Leu Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr

835 840 845

Phe Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys

850 855 860

Pro Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly

865 870 875 880

Asn Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly

885 890 895

Asn Lys Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys

900 905 910

Thr Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu

915 920 925

Trp Lys Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln

930 935 940

Pro Asp Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser

945 950 955 960

Thr Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg

965 970 975

Lys Gln Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg

980 985 990

Val His Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser

995 1000 1005

Pro Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala

1010 1015 1020

Thr Phe Pro Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser

1025 1030 1035

Cys Arg Gln Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu

1040 1045 1050

Thr Ser Gly Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr

1055 1060 1065

Val His Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala

1070 1075 1080

Val Gln His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe

1085 1090 1095

Asn Glu Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly

1100 1105 1110

Thr Leu Leu Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys

1115 1120 1125

Ser Leu Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu

1130 1135 1140

Thr Glu Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu

1145 1150 1155

Ser Leu Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val

1160 1165 1170

Val Leu Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg

1175 1180 1185

Asn Glu Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly

1190 1195 1200

Leu Gln Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe

1205 1210 1215

Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys

1220 1225 1230

Phe Thr Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr

1235 1240 1245

Asp Lys Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu

1250 1255 1260

Pro Val Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe

1265 1270 1275

Thr Thr Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu

1280 1285 1290

Leu Met Thr Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe

1295 1300 1305

Asp Ile Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro

1310 1315 1320

Glu Tyr Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp

1325 1330 1335

His Pro Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser

1340 1345 1350

Arg Ile Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val

1355 1360 1365

His Val Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr

1370 1375 1380

Pro Ser Leu Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp

1385 1390 1395

Thr Arg Pro Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser

1400 1405

<210> 146

<211> 1390

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 146

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

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Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His Val Phe Pro His Asn His Thr Ala

115 120 125

Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu

130 135 140

Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val

145 150 155 160

Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr

165 170 175

Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp His Pro Leu His Ser Ile Ser Val

180 185 190

Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln

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Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys

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Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val

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Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg

245 250 255

Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu

260 265 270

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Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln

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Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly

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Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser

325 330 335

Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys

340 345 350

Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro

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Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly

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Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys

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Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu

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Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val

530 535 540

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Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu

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Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val

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<210> 156

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 157

Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser Leu Asn Asp

1 5 10

<210> 158

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 158

Phe Ile Lys Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly

1 5 10 15

Arg Phe Met Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His

20 25 30

Val Asn Phe

35