一种目标粒径乳化交联透明质酸钠微粒的富集及交联剂清洗方法
阅读说明：本技术 一种目标粒径乳化交联透明质酸钠微粒的富集及交联剂清洗方法 (Enrichment and cross-linking agent cleaning method of emulsified cross-linked sodium hyaluronate particles with target particle size ) 是由 周奎 马矢徒 黄伟 孙伟庆 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种目标粒径乳化交联透明质酸钠微粒富集及交联剂清洗方法,用于15～100μm乳化交联透明质酸钠微粒的富集及交联剂清洗。本方法以无水乙醇为溶剂,通过搅拌,静置分层,收集上层悬液的方法来富集粒径100μm以下的乳化交联透明质酸钠微粒,然后通过0.45μm负压过滤装置去除无水乙醇。同时采用无水乙醇清洗残余交联剂乙烯砜(DVS),真空干燥后获得目标产物。采用本发明可直接获得目标粒径的乳化交联透明质酸钠微粒,工艺简便,效率高,富集效果好；同时使用无水乙醇来清洗交联剂残留,不仅减少物料消耗,而且大幅减少清洗时间,DVS清洗效果极佳。本方法涉及医用材料技术领域,尤其在整形用注射交联透明质酸钠材料制备过程中具有重大应用前景。(The invention discloses a method for enriching and cleaning a cross-linking agent of emulsified and cross-linked sodium hyaluronate particles with a target particle size, which is used for enriching and cleaning the cross-linking agent of emulsified and cross-linked sodium hyaluronate particles with a particle size of 15-100 mu m. The method takes absolute ethyl alcohol as a solvent, and adopts the methods of stirring, standing for layering and collecting upper suspension to enrich emulsified crosslinked sodium hyaluronate particles with the particle size of less than 100 mu m, and then the absolute ethyl alcohol is removed by a negative pressure filtering device with the particle size of 0.45 mu m. And simultaneously, washing residual cross-linking agent vinyl sulfone (DVS) by using absolute ethyl alcohol, and drying in vacuum to obtain a target product. The method can directly obtain the emulsified cross-linked sodium hyaluronate particles with target particle size, and has the advantages of simple process, high efficiency and good enrichment effect; and meanwhile, the anhydrous ethanol is used for cleaning the residual cross-linking agent, so that the material consumption is reduced, the cleaning time is greatly reduced, and the DVS cleaning effect is excellent. The method relates to the technical field of medical materials, and particularly has great application prospect in the preparation process of the injection cross-linked sodium hyaluronate material for plastic surgery.)
技术领域
本发明涉及一种目标粒径乳化交联透明质酸钠微粒的富集及交联剂清洗方法，属于医用材料技术领域。
背景技术
在自然状态下，透明质酸钠(Sodium Hyaluronate)的粘弹性差和半衰期短，其作为面部真皮填充剂注入真皮组织时，生物力学性能和维持效果表现不佳。为了实现面部填充的效果，需要进行化学交联/修饰以提高其生物力学性能，同时又保持其生物相容性和生物活性。
按照交联透明质酸钠凝胶组成来分，透明质酸钠真皮填充剂分为单相和双相。单相透明质酸钠凝胶填充剂被称为纯交联和非颗粒透明质酸钠凝胶。相比之下，双相填充剂(如Q-Med，瑞典)由悬浮在非交联透明质酸钠中的稳定交联透明质酸钠凝胶颗粒组成。交联透明质酸钠凝胶颗粒的制备通常采用不锈钢筛网制粒或采用均质机进行均质制粒，从而形成具有一定粒径的交联透明质酸钠凝胶。
为了获得粒径均匀的交联透明质酸钠凝胶，乳液交联法制备交联透明质酸钠凝胶，具有反应条件温和、制备步骤简单、操作便利的特点，可根据需要制备相应粒径分布范围的交联透明质酸钠微粒。专利CN201310159737.3采用乳化交联的方法制备交联透明质酸钠凝胶，过程如下：配制浓度为10％～30％g/ml的透明质酸钠碱液凝胶；将透明质酸钠碱液凝胶加到含乳化剂的油相中，再经剪切机高速乳化，乳化速度为500rpm～2000rpm，时间为10～20分钟；加入一定量的交联剂，其中交联剂在油相中质量百分比为0.2～2％，室温下搅拌4～6h进行交联反应，完成后静置过夜；使用水溶性有机溶剂洗涤以除去微球表面残留的油相，最后烘干获得交联透明质酸钠微球。该方法所制备交联透明质酸钠凝胶粒径为80～2000微米，使用一定目数的不锈钢筛网进行筛分目标粒径透明质酸钠微球。由上述文献公开内容可知，乳液交联法制备的透明质酸钠微粒往往粒径分布较宽，交联剂较难清洗彻底，交联剂的残留可能引起长期超敏反应，一定程度上制约了乳化交联透明质酸钠微粒在注射整形领域的应用。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足之处，提供一种目标粒径乳化交联透明质酸钠凝胶微粒(粒径分布15～100μm)的富集及交联剂清洗方法，该方法操作便捷，节约物料和时间成本，目标粒径富集效果明显，交联剂清洗效果极佳。为实现本发明目的，本发明采用以下技术方法：
一种目标粒径乳化交联透明质酸钠微粒富集及交联剂清洗方法，其特征在于以下包括步骤：
1)向乳化交联透明质酸钠微粒中加入一定量无水乙醇，搅拌至微粒均匀悬浮，
2)停止搅拌，静置沉降，待明显分层后，取上层悬液，转移至负压过滤装置中，真空抽滤获得交联透明质酸钠微粒；
3)将取出上层悬液后的余下部分加入一定量无水乙醇，搅拌至微粒均匀悬浮，重复步骤2)的收集过程；
4)将收集得到的交联透明质酸钠微粒在适宜温度下真空干燥一定时间后获得交联透明质酸钠微粒粉末，选择适当目数不锈钢筛网筛选目标粒径的交联透明质酸钠微粒；
5)将步骤4)筛选出的目标粒径的交联透明质酸钠微粒重新转移至负压过滤装置中，加入无水乙醇，搅拌后抽滤，
6)将抽滤得到的交联透明质酸钠微粒，加入无水乙醇，搅拌后抽滤；
7)将所得样品转移至适宜温度的真空干燥箱中干燥一定的时间，除去无水乙醇。
作为本发明优选方案，步骤1)中无水乙醇加入量与交联透明质酸钠颗粒质量比应大于10：1，更进一步优选为50：1。
作为本发明优选方案，步骤2)中静置时间为10～60min，更进一步优选为20～30min；
作为本发明优选方案，步骤3)的进行次数为2～6次，更进一步优选为3次。
作为本发明优选方案，步骤6)中进行次数为1～5次，更进一步优选为3次；步骤5)和6)中可选择0.22～15μm负压过滤装置，更进一步优选为0.45μm。
作为本发明优选方案，步骤4)和步骤7)中真空干燥时间为6～24h，更进一步优选为12h。真空干燥温度为30～75℃，更进一步优选为60℃。
通过本发明的技术方案，无需采用缓冲液、抽滤等手段，通过采用乙醇、抽滤等常用试剂和手段，在较短时间并节约物料地获得需要的交联透明质酸钠微粒。
附图说明
：图1为实施例1富集的乳化交联透明质酸钠微粒样品粒径分布图；
图2为实施例1、2、3中目标粒径乳化交联透明质酸钠微粒富集效果统计图；
图3为常规交联剂清洗3、5次数时清洗时间及DVS残留；
图4为本发明实施例4、5在清洗3、5次数时清洗时间及DVS残留。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解以及技术方案、优点更加清楚明白，下面结合实例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围，下列实例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
乳化交联透明质酸钠微粒是指将透明质酸钠水相加入到油相中，高速搅拌形成透明质酸钠微球乳状液，加入交联剂进行交联反应，形成交联透明质酸钠微球，清洗去除油相，干燥后获得的乳化交联透明质酸钠微粒。本发明以下实施例所用的乳化交联透明质酸钠微粒采用以下方法制备：将浓度为10％g/ml的透明质酸钠碱液凝胶水相加入到油相中，透明质酸钠分子量为110～150万分子量。油相为span80和轻质液状石蜡的混合液。乳化剂Span80占油相质量比为2％。水相油相质量比为2:1。经乳化机乳化，乳化转速为4000r/min，乳化时间为30min分钟；加入一定量的交联剂，其中交联剂在水相中质量百分比为3％，45℃反应2个小时，室温下搅拌1.5小时进行交联反应。交联反应结束后，按照体积比1:5加入正己烷清洗两次，分层后倒去上清液，进一步按照体积比1:5加入乙酸乙酯清洗两次；最后按照体积比1:1加入无水乙醇，真空干燥后获得乳化交联透明质酸钠微球。
采用该方法获得的乳化交联透明质酸钠微粒，经激光粒度仪测试，其粒径分布范围为：5.0微米～150微米。
实施例1，目标粒径的交联透明质酸钠微粒收集
1)向10g乳化交联透明质酸钠微粒中加入500ml无水乙醇，搅拌至微粒均匀悬浮；
2)停止搅拌，静置沉降，30分钟后，取上层悬液，转移至负压过滤装置中，真空过滤获得透明质酸钠微粒；
3)重复无水乙醇收集过程3次；
4)将收集得到的交联透明质酸钠微粒，60℃真空干燥12小时，收集微粒称重，记录富集微粒质量为9.64g，占总质量的96.4％(见图2)。采用马尔文mastersizer3000对目标样品粒径分布进行检测，检测结果见附图1，由图1可知，采用无水乙醇法回收的交联透明质酸钠微粒Dv(90)为68.9μm，Dv(50)为35.2μm。采用气相色谱法检测样品中DVS残留量为41.3μg/g。
实施例2，目标粒径的交联透明质酸钠微粒收集
1)向8.0g乳化交联透明质酸钠微粒中加入400ml无水乙醇，搅拌至微粒均匀悬浮；
2)停止搅拌，静置沉降，30分钟后，取上层悬液，转移至负压过滤装置中，真空过滤获得透明质酸钠微粒；
3)重复无水乙醇收集过程5次，
4)将收集得到的交联透明质酸钠微粒，45℃真空干燥12小时，收集微粒称重，并记录富集微粒质量为9.35g，占总质量的93.5％(见图2)。采用气相色谱法检测样品中DVS残留量为40.7μg/g。
实施例3，目标粒径的交联透明质酸钠微粒收集
1)向6.0g乳化交联透明质酸钠微粒中加入240ml无水乙醇，搅拌至微粒均匀悬浮；
2)停止搅拌，静置沉降，30分钟后，取上层悬液，转移至负压过滤装置中，真空过滤获得透明质酸钠微粒；
3)重复无水乙醇收集过程6次，
4)将收集得到的交联透明质酸钠微粒，然后75℃真空干燥12小时，收集微粒称重，并记录富集微粒质量为9.35g，占总质量的93.5％(见图2)。采用气相色谱法检测样品中DVS残留量为39.5μg/g。
无水乙醇密度与目标粒径相契合，使得目标粒径的交联透明质酸钠微粒可以在一定时间内悬浮于无水乙醇中，通过实施例1、2、3可知，三次富集过程即可收集96.4％位于目标粒径的乳化交联透明质酸钠微粒，该过程在清洗前富集目标粒径微粒，直接减少50％清洗过程的物料消耗。
实施例4，交联剂清洗过程
1)称取上述实施例2中所富集的透明质酸钠微球2.0g，选择800目不锈钢筛网筛选符合目标粒径的透明质酸钠微粒；
2)将透明质酸钠微粒转移至负压过滤装置中，加入100ml无水乙醇，搅拌后抽滤，重复该过程3次，磷酸盐缓冲液溶胀24小时后灌装样品，清洗过程所需时间为32小时，采用气相色谱法检测样品中DVS残留量，DVS残留量低于气相色谱法检出限0.17μg/g(见图4)，远低于行业标准《YY/T 0962-2014整形手术用交联透明质酸钠凝胶》要求2μg/g。
实施例5，交联剂清洗过程
1)称取上述实施例2中所富集的透明质酸钠微球4.0g，选择800目不锈钢筛网筛选符合目标粒径的透明质酸钠微粒；
2)将透明质酸钠微粒转移至负压过滤装置中，加入200无水乙醇，搅拌后抽滤，重复该过程5次，磷酸盐缓冲液溶胀24小时后灌装样品，清洗过程所需时间为34小时，通过气相色谱法检测样品中DVS残留量，DVS残留量低于气相色谱法检出限0.17μg/g(见图4)，远低于行业标准《YY/T 0962-2014整形手术用交联透明质酸钠凝胶》要求2μg/g。
对比实施例1
1)称取乳化交联透明质酸钠微粒10.0g，放于100微米不锈钢筛网上，使用振动筛进行筛分，收集不锈钢筛网下面的乳化交联透明质酸钠微粒；
2)将步骤1)收集的乳化交联透明质酸钠微粒，放于15微米不锈钢筛网上，使用振动筛进行筛分，收集不锈钢筛网上面的乳化交联透明质酸钠微粒；
3)称量步骤2)所收集到的乳化交联透明质酸钠微粒，即粒径范围为15微米～100微米乳化交联透明质酸钠微粒，质量为4.62g，收集率为46.2％。
对比实施例2
1)称取上述实施例2中所富集的透明质酸钠微球4.0g，选择800目不锈钢筛网筛选符合目标粒径的乳化交联透明质酸钠微粒；
2)配制PBS缓冲液，磷酸氢二钠质量比0.035％，磷酸二氢钠质量比0.014％，氯化钠质量比0.7％，将上一步乳化交联透明质酸钠微球放入上述缓冲液中静置溶胀过夜后离心收集微球，每次清洗需要24小时。
3)重复步骤2)中缓冲液清洗过程3次，清洗过程所需时间为96小时，通过气相色谱法检测样品中交联剂DVS残留量，DVS残留量检测结果为6.01μg/g，高于行业标准《YY/T0962-2014整形手术用交联透明质酸钠凝胶》要求2μg/g。
对比实施例3
1)称取上述实施例2中所富集的透明质酸钠微球4.0g，选择800目不锈钢筛网筛选符合目标粒径的乳化交联透明质酸钠微粒；
2)配制PBS缓冲液，磷酸氢二钠质量比0.035％，磷酸二氢钠质量比0.014％，氯化钠质量比0.7％，将上一步乳化交联透明质酸钠微球放入上述缓冲液中静置溶胀过夜后离心收集微球，每次清洗需要24小时。
3)重复步骤2)中缓冲液清洗过程5次，清洗过程所需时间为144小时，通过气相色谱法检测样品中交联剂DVS残留量，DVS残留量检测结果为3.26μg/g，略高于行业标准《YY/T0962-2014整形手术用交联透明质酸钠凝胶》要求2μg/g。
通过本实施例4、5和对比实施例1、2实验可知，本发明的交联剂清洗方法直接减少清洗时间110小时，而且交联剂DVS清洗效果极佳，未检测出交联剂DVS残留。
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