阅读说明：本技术 高通量crispr基因编辑工具载体构建方法 (Construction method of high-throughput CRISPR gene editing tool vector ) 是由 杨延辉 林�源 田静 何龙 杨林 王大军 杨丽 唐静 李晓雨 马凯 杨玉玛 刘 于 2021-09-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法,包括如下步骤：S1、引物设计及合成；S2、引物退火；S3、sgRNA重组质粒构建；S4、转化得到24份2μl的混合物；S5、筛选单克隆；S6、质粒提取及测序。该方法优化了重组质粒的构建步骤和转化实验的孵育步骤,同时缩短了质粒构建和转化实验的时间提高了转化效率和阳性率,减少了实验成本,在筛选单克隆过程中替换了传统的涂布棒法,为最终实现自动化、高通量sgRNA载体构建奠定了基础；解决了酶切和连接的矛盾,将不可能统一的体系实现了统一,该方法不仅能够应用于基因编辑sgRNA的构建,还可以应用于载体构建的无缝克隆技术。(The invention discloses a construction method of a high-throughput CRISPR gene editing tool vector, which comprises the following steps: s1, designing and synthesizing a primer; s2, primer annealing; s3, constructing sgRNA recombinant plasmids; s4, obtaining 24 parts of 2 mu l mixture through conversion; s5, screening single clones; s6, plasmid extraction and sequencing. The method optimizes the construction steps of the recombinant plasmid and the incubation steps of the transformation experiment, shortens the time of the plasmid construction and the transformation experiment, improves the transformation efficiency and the positive rate, reduces the experiment cost, replaces the traditional coating rod method in the process of screening monoclonal, and lays a foundation for finally realizing the construction of the automated and high-flux sgRNA vector; the method solves the contradiction between enzyme digestion and connection, realizes unification of systems which cannot be unified, and can be applied to the construction of sgRNA for gene editing and the seamless cloning technology for vector construction.)

高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，更具体地说，尤其涉及一种高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法。

背景技术

CRISPR-Cas9基因编辑技术是目前应用最为广泛的基因操作工具。连接sgRNA的载体构建是该技术的最基本、最重要的实验操作。但是经典的载体构建的弊端是步骤繁琐、耗时、无法实现高通量。因此，我们提出一种高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法，包括如下步骤：

S1、引物设计及合成；

S2、引物退火：将体系放置在PCR仪中100℃保持10min，之后室温放置自然冷却至室温；(Primer T 1μL(100μmol/L)，Primer B 1μL(100μmol/L)，ddH2O 98μL，总100μL)；

S3、sgRNA重组质粒构建：

每个反应体系

S4、转化：

S41、将24份各自连接产生的2μl混合物转移到24份50μl感受态细胞大肠杆菌DH5α中，预先让DH5α在冰上解冻(3-5min)为合格细胞，然后轻轻混合；

S42、将混合物在冰上孵育30min；

S43、在42℃条件下热击90s，然后立即将管子放回冰上；让它在冰上保持5min；

S5、涂布筛选单克隆；

S51、将步骤S43中的24份转化液中各加入100μl的LB液体培养基(稀释倍数为3倍)之后，拿出提前倒好的含氨苄的24孔板的固体培养基(每个孔大约有800μl—1000μl的培养基)，在每个孔里放置3到4个直径为1mm的无菌玻璃小球，之后每个孔里加入10μl稀释后培养液，盖上24孔板盖，在水平面上，缓慢地分别以上下和左右的方式摇晃3到5次，取出玻璃小球，最后把24孔板放置在37℃的培养箱里过夜培养(<18h)；

S52、第二天观察平板有无菌落；

S6、质粒提取及测序。

本发明开发出采用耐热的T4连接酶，将酶切连接在一个微量反应体系中实现的技术，通过克服酶切和连接不可兼容的矛盾，从而优化了CRISPR-Cas9基因编辑sgRNA载体构建的方法。经证实该种克隆的方法阳性率高、省时、省成本，并且PCR仪即可完成。为实现自动化、高通量构建sgRNA载体和开发无缝连接方法试剂盒奠定了基础。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的一种高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法，与传统技术相比，该方法优化了重组质粒的构建步骤和转化实验的孵育步骤，同时缩短了载体构建和转化的时间提高了转化效率和阳性率，缩小了实验试剂的体积，减少了实验成本，为最终实现自动化、高通量sgRNA载体构建奠定了基础；

解决了酶切和连接的矛盾，将不可能统一的体系实现了统一，该方法不仅能够应用于基因编辑sgRNA的构建，还可以应用于载体构建的无缝克隆技术。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法，包括如下步骤：

S1、引物设计及合成；

S2、引物退火：将体系放置在PCR仪中100℃保持10min，之后室温放置自然冷却至室温；(Primer T 1μL(100μmol/L)，Primer B 1μL(100μmol/L)，ddH2O 98μL，总100μL)；

S3、sgRNA重组质粒构建：

每个反应体系

S4、转化：

S41、将24份各自连接产生的2μl混合物转移到24份50μl感受态细胞大肠杆菌DH5α中，预先让DH5α在冰上解冻(3-5min)为合格细胞，然后轻轻混合；

S42、将混合物在冰上孵育30min；

S43、在42℃条件下热击90s，然后立即将管子放回冰上；让它在冰上保持5min；

S5、涂布筛选单克隆；

S51、将步骤S43中的24份转化液中各加入100μl的LB液体培养基(稀释倍数为3倍)之后，拿出提前倒好的含氨苄的24孔板的固体培养基(每个孔大约有800μl—1000μl的培养基)，在每个孔里放置3到4个直径为1mm的无菌玻璃小球，之后每个孔里加入10μl稀释后培养液，盖上24孔板盖，在水平面上，缓慢地分别以上下和左右的方式摇晃3到5次，取出玻璃小球，最后把24孔板放置在37℃的培养箱里过夜培养(<18h)；

S52、第二天观察平板有无菌落；

S6、质粒提取及测序。

将引物、载体、限制性核酸内切酶、T4连接酶、T4连接酶缓冲液以及去离子水按照一定比例加到一个反应体系内，在一定温度下经过内切酶与T4连接酶的双重作用，使载体与引物相连接，最终获得重组载体。

具体验证：重组菌落的验证从A，B两组平板中随机挑选5个菌落在含有氨苄的平板上分开划线，即验证重组菌落是否已经转化入质粒，两个平板的五条线上都有细菌生长，证明整质粒转化入感受态细菌；

目的基因的测序鉴定将验证的A组和第B组中挑选3个单菌落菌株送北京睿博兴科生物技术有限公司对目的区域使用引物：gagggcctatttcccatgatt；对6个单菌落中的目的片段(25/26bp)进行测序，将测序结果与空载的质粒序列进行比对。

综上所述：本发明提供的一种高通量CRISPR基因编辑工具载体构建方法，与传统技术相比，该方法优化了重组质粒的构建步骤和转化实验的孵育步骤，同时缩短了质粒构建和转化实验的时间提高了转化效率和阳性率，减少了实验成本，在筛选单克隆过程中替换了传统的涂布棒法，为最终实现自动化、高通量sgRNA载体构建奠定了基础；

解决了酶切和连接的矛盾，将不可能统一的体系实现了统一，该方法不仅能够应用于基因编辑sgRNA的构建，还可以应用于载体构建的无缝克隆技术。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。