一种n端序列元件在调控酿酒酵母蛋白表达中的应用
阅读说明：本技术 一种n端序列元件在调控酿酒酵母蛋白表达中的应用 (Application of N-terminal sequence element in regulation and control of saccharomyces cerevisiae protein expression ) 是由 刘延峰 堵国成 王晨芸 刘龙 吕雪芹 陈坚 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种N端序列元件在调控酿酒酵母蛋白表达中的应用,属于基因工程领域。本发明提供了可用于调控目的蛋白表达量的调控元件,可以提高或降低基因在酿酒酵母中的表达量。以绿色荧光蛋白为例,按照本发明的方法构建的重组酿酒酵母,N端添加SEQ IDNO.1～7所示的核苷酸序列,可使荧光强度由742提高至2310～11957,可达对照的16.11倍。N端添加SEQ ID NO.8～10所示的核苷酸序列,可使荧光强度由742降低至25～461,达到抑制目的蛋白表达的效果。(The invention discloses application of an N-terminal sequence element in regulation and control of saccharomyces cerevisiae protein expression, and belongs to the field of genetic engineering. The invention provides a regulatory element for regulating the expression level of a target protein, which can improve or reduce the expression level of a gene in saccharomyces cerevisiae. Taking green fluorescent protein as an example, the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO. 1-7 are added at the N terminal of the recombinant saccharomyces cerevisiae constructed by the method, so that the fluorescence intensity can be increased from 742 to 2310-11957, which is 16.11 times of that of a control. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO. 8-10 is added at the N end, so that the fluorescence intensity can be reduced from 742 to 25-461, and the effect of inhibiting the expression of the target protein is achieved.)
技术领域
本发明涉及一种N端序列元件在调控酿酒酵母蛋白表达中的应用，属于基因工程领域。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)属于真核生物、兼性厌氧菌，是一种常用的代谢调控模式菌株，也是目前研究最为深入的真核微生物之一。酿酒酵母具有诸多优点，如遗传背景清晰、易于代谢调控研究；遗传稳定性高、不易发生基因突变或菌种退化；拥有较宽的底物谱、可以在各种探源条件下快速生长；有较完善的转录表达及分析方法等。与此同时，酿酒酵母被FDA组织确定为食品级安全微生物，也是全世界公认安全(GenerallyRecognized as Safe，GRAS)的微生物。由此，酿酒酵母被认为是一种具有巨大改造潜力的微生物细胞工厂，被广泛用作底盘微生物来进行乙醇及高附加值产物的生产，在生物医药、化妆品、食品保健等各个领域具有广阔的应用前景。
代谢途径调控作为代谢工程以及合成生物学的核心，可以在转录水平、翻译水平、蛋白质水平进行不同程度的调节，但能够应用于酿酒酵母的调控元件非常有限，目前最常用元件可分为启动子、转录因子的“输入”控制，以及基于终止子的“输出”控制。目前已有研究证明，在原核生物及真核生物中，基因N-端序列能在翻译水平上调控基因的表达量。因此，将N端序列作为一种新型调控元件控制基因表达，丰富了酵母的调控元件库，对酵母的代谢工程改造起到了促进作用。
发明内容
本发明提供了基因表达调控元件在调控目的蛋白在酿酒酵母中表达方面的应用，所述基因表达调控元件具有SEQ ID NO.1～10任一所示的核苷酸序列；所述基因表达调控元件被插入至目的蛋白编码基因的N端，且位于目的蛋白起始密码子ATG之后。
在一种实施方式中，所述基因表达调控元件具有SEQ ID NO.1～7任一所示的核苷酸序列，用于提高目的蛋白的表达量。
在一种实施方式中，所述基因表达调控元件具有SEQ ID NO.8～10所示的核苷酸序列，用于降低目的蛋白的表达量。
在一种实施方式中，所述目的基因连接至重组表达质粒pEBS中，再转化到酿酒酵母中。
在一种实施方式中，所述目的蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白。
在一种实施方式中，编码所述绿色荧光蛋白的基因的GenBank登录号为AF324408.1。
在一种实施方式中，以pEBS为表达载体，将具有调控功能的N端编码序列连接在目的蛋白的N端，表达在酿酒酵母中。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288C。
在一种实施方式中，所述pEBS已公开于论文《Construction andCharacterization of Broad-Spectrum Promoters for Synthetic Biology》中。
本发明还提供了可使目的基因表达能力提高的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列是沿5’→3’方向，在基因序列的起始密码子ATG之后插入基因表达调控元件；所述基因表达调控元件含有SEQ ID NO,1～10任一所示的序列。
在一种实施方式中，所述多核苷酸序列是以Genbank登录号为AF324408.1的基因为出发序列，在起始密码子ATG之后插入了SEQ ID NO.1～10任一所示的序列。
本发明还提供了含有所述多核苷酸序列的重组表达载体。
本发明还提供了含有所述多核苷酸序列的重组酿酒酵母。
在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母在基因组上融合了所述多核苷酸序列。
在一种实施方式中，所述重组酿酒酵母含有携带所述多核苷酸序列的重组表达载体。
本发明还提供了应用所述重组酿酒酵母生产目的蛋白的方法，是将所述重组酿酒酵母在培养基，于一定温度下培养一定时间。
在一种实施方式中，所述目的蛋白为绿色荧光蛋白，所述培养是将酿酒酵母在YPD培养基中，于28～30℃，在有氧条件下发酵至少16小时。
本发明还提供所述重组酿酒酵母或所述方法在发酵产目的蛋白、或生产微生物参与代谢的高附加值产品中的应用。
有益效果：本发明提供了可用于调控目的蛋白表达量的调控元件，能够提高或降低基因在酿酒酵母中的表达量。以绿色荧光蛋白为例(通过荧光强度表征蛋白表达量)，按照本发明的方法构建的重组酿酒酵母，N端添加SEQ ID NO.1～7所示的核苷酸序列，可使荧光强度由742提高至2310～11957，可达对照的16.11倍。N端添加SEQ ID NO.8～10所示的核苷酸序列，可使荧光强度由742降低至25～461，达到抑制目的蛋白表达的效果。
具体实施方式
表达绿色荧光蛋白的重组酿酒酵母种子培养及发酵：
培养基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。
培养条件：在含300μL YPD培养基的96孔深孔板中于30℃、250rpm培养16h的种子以10％的接种量转入含190μL YPD培养基的96孔深孔板中，于30℃、900rpm条件下培养24h。
绿色荧光蛋白表达量的测定方法：在96孔板中每孔加入200μL稀释后的发酵液，使用Cytation3细胞成像微孔板检测仪(美国伯腾仪器有限公司)，激发波长：488nm，发射波长：523nm，增益：60。
表达卵清蛋白的重组酿酒酵母种子培养及发酵：
培养基(g/L)：胰蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20。
培养条件：将含液量300μL YPD培养基的96孔深孔板中，于30℃、250rpm培养16h的种子以10％的接种量转入含20mL YPD培养基的250mL三角瓶中，于30℃、250rpm条件下培养48h。
卵清蛋白表达量的测定方法：取一定量发酵液离心并收集菌体，并用2mL PBS溶液洗涤两次并重悬，使得细胞菌体终浓度为50OD/mL。使用超声细胞破碎仪(上海般诺生物科技有限公司)破碎细胞并离心取上清，经浓缩后用High Sensitive Enzyme-linkedImmunosorbent Assay Kit for Ovalbumin(Cloud-Clone Corp.)测定卵清蛋白浓度。
可调控酿酒酵母目的蛋白表达量的N端编码序列：如表1所示。
表1:添加在目的蛋白ATG起始密码子之后的N端编码序列
SEQ ID NO.1
TACGAGCTTCCGGGACATTCTATATCACGA
SEQ ID NO.2
GATAAGTATCATCATATTAGATCTGTTTCT
SEQ ID NO.3
GATAAGTATAATCATATTAGAGCTGTTTCT
SEQ ID NO.4
GATAAGTATCATCATATTAGCGCTGTTTCT
SEQ ID NO.5
TACGATCTCGGAAGACTTAGTTCCAGGCTC
SEQ ID NO.6
GATAAGTATCATCATATTAGAGCTGTTTCG
SEQ ID NO.7
GATAAGAATCATCATATTAGAGCTGTTTCT
SEQ ID NO.8
GATATTATTCGGGGGTGCCGGTCGGTTCCG
SEQ ID NO.9
GAGGAGTTTGGAGGGGTCCTATCTCCCCCA
SEQ ID NO.10
GAGCAGGATCATCAGATTAGTATCGTGACT
实施例1表达绿色荧光蛋白的重组质粒的构建
先在pEBS质粒的Pbs启动子之后插入绿色荧光蛋白(GFP)基因，然后将N端编码序列引入绿色荧光蛋白的起始密码子之后。具体步骤为：
(1)设计引物：
fx_pEBS-GFP_F:5’-CTATGCGGCATCAGAGCAGAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATC-3’
fx_pEBS-GFP_R:5’-CATCGAAAAAAGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3’，以含有绿色荧光蛋白基因的大肠杆菌为模板，通过菌落PCR，得到绿色荧光蛋白(GFP)片段(GenBank：AF324408.1所示)；
(2)设计引物：
rh_pEBS-GFP_F:5’-GGCATGGATGAACTATACAAATAACTCTGCTCTGATGCCGCATAG-3’
rh_pEBS-GFP_R:5’-CATCGAAAAAAGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGT-3’
以质粒pEBS为模板，通过PCR反向扩增得到质粒片段；
(3)通过Gibson Assembly Clonging Kit(New England Biolabs)将步骤(1)获得的绿色荧光蛋白基因片段和步骤(2)获得的质粒片段连接，构建重组质粒，测序验证，获得重组质粒pEBS-GFP。
(4)设计引物：
表2引物
以步骤(3)获得的质粒pEBS-GFP为模板，通过PCR反向扩增得到质粒片段；最通过Gibson Assembly Clonging Kit(New England Biolabs)构建重组质粒，分别使表1所示的序列被添加至GFP基因的起始密码子之后，测序验证，确认重组pEBS-N-GFP质粒构建成功(N表示1～10的整数)。
实施例2含重组质粒pEBS-N-GFP的酿酒酵母的构建
将实施例1构建的pEBS-N-GFP质粒转化酿酒酵母S288C野生型菌株。采用引物：
yz_zong-pEBS_F:5’-CATCGAAAAAAGTAAGAGAGGAATGTACACA-3’
yz_zong-pEBS_R:5’-GACGGTCACAGCTTGTCTGT-3’
挑选转化子进行菌落PCR，出现1.2kb条带，验证重组酿酒酵母构建成功。
实施例3重组酿酒酵母表达绿色荧光蛋白
将实施例构建的重组酿酒酵母分别接种至含YPD培养基(装液量300μL)的96孔深孔板中，于30℃、250rpm培养16h，获得OD为1±0.2的种子液以按体积计10％的接种量转入发酵培养基中，于30℃、900rpm条件下培养24h，收集发酵液并进行荧光强度检测。最终24h发酵液中测得荧光强度可达11957，实现了绿色荧光蛋白在重组酿酒酵母中的高表达。
表3添加10种不同N端编码序列对酿酒酵母绿色荧光蛋白平均荧光强度提高的情况
注：平均荧光强度＝荧光强度/菌体浓度的OD值。
对照例1构建无此特定N端序列的绿色荧光蛋白的对照组
在pEBS质粒的Pbs启动子之后，直接插入绿色荧光蛋白(GFP)基因。具体步骤为：
(1)设计引物：
fx_pEBS-GFP_F:5’-CTATGCGGCATCAGAGCAGAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATC-3’
fx_pEBS-GFP_R:5’-CATCGAAAAAAGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3’，
以含有绿色荧光蛋白(GFP，GenBank：AF324408.1)基因的大肠杆菌为模板，通过菌落PCR，得到绿色荧光蛋白片段；
(2)设计引物：
rh_pEBS-GFP_F:5’-GGCATGGATGAACTATACAAATAACTCTGCTCTGATGCCGCATAG-3’
rh_pEBS-GFP_R:5’-CATCGAAAAAAGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGT-3’
以质粒pEBS为模板，通过PCR反向扩增得到质粒片段；最后通过Gibson AssemblyClonging Kit(New England Biolabs)将绿色荧光蛋白基因引入至Pbs启动子之后，构建重组质粒，再将构建的重组质粒测序验证，确认重组pEBS-Ctr-GFP质粒构建成功后，转化至酿酒酵母S288C野生型细胞。通过菌落PCR验证质粒转化成功。
将构建的重组酿酒酵母按照实施例3相同条件培养，经检测，发酵24h的发酵液(OD为1.9±0.1)中测得的荧光强度是742。
对照例2构建表达不含特定N端序列的卵清蛋白的重组酿酒酵母
在pEBS质粒的Pbs启动子之后，直接插入卵清蛋白(OVA)基因。具体步骤为：
(1)设计引物：
fx_pEBS-OVA_F:5’-GAGAGGAATGTACACATGGGTTCCATCGGTGCCGCTT-3’
fx_pEBS-OVA_R:5’-CGAAGAATTTCATGGAGAGACACATCTACCG-3’，
以含有卵清蛋白(GFP，GenBank：AUD54526.1)基因的大肠杆菌为模板，通过菌落PCR，得到卵清蛋白片段；
(2)设计引物：
rh_pEBS-OVA_F:5’-CGGTAGATGTGTCTCTCCATGAAATTCTTCGCCAGAGGTTTGG-3’
rh_pEBS-OVA_R:5’-ACCGATGGAACCCATGTGTACATTCCTCTCTTACTTTTTTC-3’
以质粒pEBS为模板，通过PCR反向扩增得到质粒片段；最后通过Gibson AssemblyClonging Kit(New England Biolabs)将卵清蛋白基因引入至Pbs启动子之后，构建重组质粒，再将构建的重组质粒测序验证，确认重组pEBS-Ctr-OVA质粒构建成功后，转化至酿酒酵母S288C野生型细胞。通过菌落PCR验证质粒转化成功。
实施例4表达卵清蛋白的重组酿酒酵母的构建
按照实施例1～3相同的策略，将SEQ ID NO.1～10的序列分别插入至基因OVA(编码GenBank:AUD54526.1所示的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)的起始密码子之后，构建重组质粒并在酿酒酵母中表达，将本实施例构建的重组酿酒酵母与对照例2构建的重组酿酒酵母分别于于30℃、250rpm培养16h，获得菌浓为OD为1±0.2的种子液。再以按体积计10％的接种量将种子液分别转入发酵培养基(YPD培养基)中，于30℃、900rpm条件下培养48h，获得OD为15±0.8的发酵液。检测不同发酵液中的卵清蛋白表达量，结果显示，N端添加SEQ ID NO.1～7所示的核苷酸序列，可使卵清蛋白表达量提高3％～37％。N端添加SEQ ID NO.8～10所示的核苷酸序列，可使卵清蛋白表达量降低至对照例2的0.49～0.91倍，达到抑制目的蛋白表达的效果。对照例2构建的酿酒酵母的发酵液OD值与实施例4构建的酿酒酵母发酵液OD值相比，波动范围在10％以内。
表4添加不同N端编码序列对卵清蛋白表达量的调控作用
序列
相对表达量
SEQ ID NO.1
1.37
SEQ ID NO.2
1.40
SEQ ID NO.3
1.40
SEQ ID NO.4
1.20
SEQ ID NO.5
1.18
SEQ ID NO.6
1.05
SEQ ID NO.7
1.03
SEQ ID NO.8
0.91
SEQ ID NO.9
0.49
SEQ ID NO.10
0.81
注：相对表达量以对照例2构建的酿酒酵母发酵液中OVA表达量为基准，计为1。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种N端序列元件在调控酿酒酵母蛋白表达中的应用
<130> BAA211225A
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<170> PatentIn version 3.3
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