一种水稻雄性育性调控基因突变体及其分子标记和应用

文档序号：354526 发布日期：2021-12-07 浏览：21次 >En<

阅读说明：本技术 一种水稻雄性育性调控基因突变体及其分子标记和应用 (Rice male fertility regulation gene mutant and molecular marker and application thereof ) 是由龙湍唐杰李燕群李佳林刘昊曾翔李新鹏安保光吴永忠黄培劲于 2020-06-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种水稻雄性育性调控基因突变体及其分子标记和应用。本发明提供的水稻雄性育性调控蛋白GMS2突变体可使水稻花粉完全不育,导致水稻雄性不育,GMS2突变体的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示,CDS序列如SEQ ID NO:7所示,氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。利用本发明的核不育突变体可培育新的核不育系,为水稻核不育系培育提供了一个简单、迅速、有效的方法。本发明的核不育水稻材料可用于在水稻杂交时取代人工去雄,节约劳力,尤其可用于需要进行大量杂交的轮回选择育种,对扩大水稻的种质基础具有重要作用。(The invention relates to the technical field of biology, in particular to a rice male fertility regulation gene mutant and a molecular marker and application thereof. The rice male fertility regulation protein GMS2 mutant provided by the invention can ensure that rice pollen is completely sterile, so that rice male sterility is caused, the genome nucleotide sequence of the GMS2 mutant is shown as SEQ ID NO.6, the CDS sequence is shown as SEQ ID NO. 7, and the amino acid sequence is shown as SEQ ID NO. 8. The genic sterile mutant of the invention can be used for cultivating new genic sterile lines, and provides a simple, rapid and effective method for cultivating the genic sterile lines of rice. The nuclear sterile rice material can be used for replacing manual emasculation during rice hybridization, saves labor, is particularly suitable for recurrent selective breeding requiring a large number of hybridizations, and has an important effect on expanding the germplasm basis of rice.)

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及植物育性相关蛋白GMS2突变体，该突变体的编码基因、其分子标记及其在杂交育种中的应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。随着人口的增长和生活品质的提升，据预计到2050年水稻的年产量要提高1-2倍才能满足人类发展的需求。杂交水稻是父母本杂交后获得的子一代，其产量往往比常规稻亲本提高15％以上，抗性和适应性也远胜于亲本。因此，应用和推广杂交水稻是提高水稻产量的一个重要途径。

雄性不育系是杂交水稻育制种技术的关键节点。雄性不育系是指雄配子发育异常而丧失生育能力，雌配子发育正常的植物株系。它只能作为母本接受父本的花粉，自交不能结实。目前杂交水稻生产上应用的雄性不育系有核质互作型和光温敏型两种。核质互作型雄性不育系的不育基因在细胞质中，细胞核中没有育性恢复基因。当细胞核中有育性恢复基因的恢复系与其配组杂交时可以生产可育的子一代杂交种，当细胞核中没有育性恢复基因而细胞质中也没有不育基因的保持系与其杂交时可以繁殖不育系种子。由于需要不育系、保持系和恢复系三系配套，这种杂交水稻育制种技术常被称为“三系法”。一些控制核质互作型不育及相应育性恢复的基因已经被克隆(Chen and Liu，2014，Male sterility andfertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65：579-606)。核质互作型不育系是杂交水稻育制种中第一种大规模应用的不育系，为杂交水稻产业的建立和发展奠定了材料基础。然而由于核质互作型不育系的组配受到恢复系基因型的限制，导致只有约5％的种质资源能被利用。而细胞质的不育基因有导致米质差、特定病虫害流行的潜在风险。

光温敏型雄性不育系是一种育性受光温环境调控的不育系。在一定的光温条件下这种不育系保持不育，可用于组配杂交。当条件改变时不育系恢复育性，可用于不育系繁殖。由于光温敏雄性不育系实现了不育系和保持系的合二为一，只需要父本与其配组生产子一代杂交种，因此相应的育制种技术常被称为“两系法”。调控光温敏雄性不育的基因在细胞核中，目前已经克隆的基因包括PMS3、TMS5、CSA和TMS10(Chen and Liu，2014，Malesterility and fertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65:579-606；Zhou H，et al，2014，RNase ZS1 processes UbL40 mRNAs and controlsthermosensitive genic male sterility in rice，Nature Communications，5:4884-4892)。与核质互作型不育系相比，光温敏型不育系繁殖程序简单，配组因恢复基因广泛存在而更自由。光温敏不育系的大规模应用极大地巩固和推动了杂交水稻产业发展。然而，由于该型不育系的育性受光温环境影响，也导致制种风险高，制种地域受到限制。

为了克服目前杂交水稻育制种技术中存在的关键性缺陷，创造和利用新类型的不育系将是重要的突破口。细胞核雄性不育由细胞核基因突变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传，而且遵循孟德尔定律。本发明提供了一种植物育性相关基因及基于该基因突变所产生的隐性核不育类型的雄性不育系。该不育系育性稳定，只受核编码的单基因调控，不受光温环境的影响。该不育系的育性恢复基因广泛存在于水稻种质资源中，也可以通过转野生型基因恢复育性。该基因和该基因突变产生的不育系为研发水稻新型杂交育制种技术提供了元件，为解决现有技术存在的问题奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是提供植物育性相关蛋白GMS2突变体，该突变体的编码基因、其分子标记及其在杂交育种中的应用。

本发明发现了一个水稻育性相关蛋白GMS2突变体，该突变体相对于野生型GMS2蛋白在第40～42位缺失天冬酰胺、丝氨酸和酪氨酸3个氨基酸。

GMS2位于水稻第4号染色体上，其在粳稻品种日本晴中的基因组核苷酸序列如SEQID NO:1所示，CDS序列如SEQ ID NO:2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在籼稻品种9311中其基因组核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，其CDS序列如SEQ ID NO:67所示，其氨基酸序列与日本晴相同。在琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；在香蕉(Musa acuminata)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；非洲栽培稻(Oryza glaberrima)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；在短药野生稻(Oryza brachyantha)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；大麦(Hordeum vulgare)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示：高粱(Sorghumbicolor)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；玉米(Zea mays)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；小米(Setaria italica)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

上述所述育性基因，可从各种植物中分离获得。本领域技术人员应该理解，本发明所述的育性基因包括与GMS2基因高度同源，并且具有同样的育性调控功能的高度同源的功能等价序列。所述高度同源的功能等价序列包括在严谨条件下能够与本发明所公开的GMS2基因的核苷酸序列杂交的DNA序列。本发明中所使用的“严谨条件”是公知的，包括诸如在含400mM NaCl、40mM PIPES(pH6.4)和l mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12-16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1×SSC的洗涤液洗涤15-60分钟。

功能等价序列还包括与本发明所公开的GMS2基因的核苷酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列相似性，且具有育性调控功能的DNA序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列相似性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：1117，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J Mol Biol，48(3)：443-453，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J Mol Biol，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J Mol Biol，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

基于本发明的上述发现，本发明的第一个方面是提供植物雄性育性相关蛋白突变体，所述突变体相对于野生型植物雄性育性相关蛋白包含如下氨基酸突变：在NxYL保守序列中发生N、x、Y三个氨基酸中的至少一个的缺失；

其中，x为S或N；

所述野生型植物雄性育性相关蛋白为如下(1)或(2)所述的蛋白：

(1)具有SEQ ID NO:3、9、10、11、12、13、14、15或16所示的氨基酸序列的蛋白；

(2)将SEQ ID NO:3、9、10、11、12、13、14、15或16经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有调控植物雄性育性活性的蛋白。

优选地，所述突变体相对于野生型植物雄性育性相关蛋白包含如下氨基酸突变：在NxYL保守序列中发生N、x、Y三个氨基酸的缺失；其中，x为S或N。

对于水稻而言，所述突变体相对于其野生型雄性育性相关蛋白包含如下氨基酸突变：第40、41和42位氨基酸缺失，其野生型雄性育性相关蛋白具有SEQ ID NO:3所示序列或将SEQ ID NO:3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有调控植物雄性育性活性的蛋白。

本发明提供水稻GMS2蛋白突变体，所述突变体具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

本发明还提供了编码所述植物雄性育性相关蛋白突变体的核酸。

本发明所述的核酸可以从任何植物中分离获得，包括但不限于芸苔属、玉米、小麦、高梁、短药野生稻、非洲栽培稻、短柄草属、两节荠属、白芥、芝麻、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、茵宿、燕麦、大麦、燕麦、黑麦(Rye)、小米、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘廉、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石角斗、剑兰、菊花、百合科、棉花、向日葵、甜菜、咖啡、观赏植物和松类等。优选地，植物包括玉米、小米、拟南芥、二穗短柄草、大豆、红花、芥菜、小麦、大麦、黑麦、短药野生稻、非洲栽培稻、棉花和高粱。

具体地，以水稻为例，编码所述突变体的核酸相对于编码所述野生型植物雄性育性相关蛋白的核酸包含如下核苷酸突变：对应于LOC_Os04g48490基因编码区的第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失。

对于水稻GMS2蛋白突变体，突变后的GMS2的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，CDS序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明还提供一种生物材料，其为含有编码所述植物雄性育性相关蛋白突变体的核酸的表达盒、载体、宿主细胞、转基因细胞系或转基因植物。

本发明的第二个方面是提供所述突变体或所述核酸或所述生物材料的如下任一种应用：

(1)在调控植物雄性育性中的应用；

(2)在制备雄性不育植物中的应用；

(3)在植物杂交育种中的应用；

(4)在植物种质资源改良中的应用。

上述(1)中，调控植物雄性育性可为使植物的雄性育性降低或丧失。具体可通过调控植物雄性生殖细胞、花粉的发育实现。其中，使植物的雄性育性降低或丧失可通过将植物中所述植物雄性育性相关蛋白的编码基因突变，使其表达量降低或不表达，或者通过将编码所述植物雄性育性相关蛋白的核酸的抑制因子引入植物中实现。

上述(2)中，所述雄性不育植物为隐性核不育系，带有编码所述植物雄性育性相关蛋白的核酸的纯合突变。

上述(3)中，使用带有编码所述植物雄性育性相关蛋白的核酸的纯合突变的隐性核不育系进行杂交育、制种。

上述(4)中，所述改良包括产量提高、品质提高、抗病虫害、抗逆、抗倒伏等。

以上所述植物是自花授粉或异花授粉作物，包括但不限于玉米、小麦、高梁、水稻。

本发明的第三个方面是提供一种植物、植物组织或植物细胞，其具有雄性不育性状，其基因组序列中野生型植物雄性育性相关蛋白的基因编码的蛋白发生包含如下的氨基酸突变：在NxYL保守序列中发生N、x、Y三个氨基酸中至少一个的缺失，其中野生型植物雄性育性相关蛋白如前所述。

优选地，所述植物、植物组织或植物细胞的基因组序列中野生型植物雄性育性相关蛋白的基因编码的蛋白发生包含如下的氨基酸突变：在NxYL保守序列中发生N、x、Y三个氨基酸的缺失。

优选地，所述植物为水稻，所述植物组织为水稻组织，所述植物细胞为水稻细胞。

本发明提供一种水稻，所述水稻的基因组或转录组包含如下突变：LOC_Os04g48490基因编码区的第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失，导致LOC_Os04g48490基因编码蛋白的第40、41和42位的天冬酰胺、丝氨酸和酪氨酸缺失；LOC_Os04g48490基因编码区的序列如SEQ ID NO.67所示，LOC_Os04g48490基因编码蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种水稻组织，所述水稻组织的基因组或转录组包含如下突变：LOC_Os04g48490基因编码区的第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失，导致LOC_Os04g48490基因编码蛋白的第40、41和42位的天冬酰胺、丝氨酸和酪氨酸缺失。

本发明还提供一种水稻细胞，所述水稻细胞的基因组或转录组包含如下突变：LOC_Os04g48490基因编码区的第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失，导致LOC_Os04g48490基因编码蛋白的第40、41和42位的天冬酰胺、丝氨酸和酪氨酸缺失。

本发明进一步提供基因组序列中LOC_Os04g48490基因的序列突变为如SEQ IDNO:6所示的序列，导致LOC_Os04g48490基因的CDS突变为如SEQ ID NO:7所示序列，编码蛋白突变为如SEQ ID NO:8所示序列的水稻、水稻组织或水稻细胞。

本发明提供水稻突变体材料gms2，gms2表现为雄性不育，其基因组序列中LOC_Os04g48490(GMS2)基因的序列突变为如SEQ ID NO:6所示的序列，LOC_Os04g48490基因的CDS突变为如SEQ ID NO:7所示序列，编码蛋白的氨基酸序列突变为如SEQ ID NO:8所示序列；所述LOC_Os04g48490基因的基因组序列如SEQ ID NO:4所示。

具体地，水稻突变体材料gms2的基因组序列在LOC_Os04g48490基因(GMS2)编码区(序列如SEQ ID NO:67)第118～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失，导致LOC_Os04g48490基因编码蛋白(序列如SEQ ID NO:3)中第40、41和42位的天冬酰胺、丝氨酸和酪氨酸缺失。

上述GMS2的第40、40和第42位的天冬酰胺、丝氨酸和酪氨酸缺失，导致GMS2蛋白丧失功能，进而导致水稻雄性不育。

本领域技术人员应该知晓，可以将如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列通过杂交、回交或转基因的方法导入受体植物中，从而获得新的雄性不育突变体材料。

本发明的第四个方面是提供用于检测所述突变体或所述突变体材料的分子标记，所述分子标记通过核苷酸序列如SEQ ID NO.19-20所示的引物扩增得到。

本发明提供用于扩增所述分子标记的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:19-20所示。

本发明提供含有核苷酸序列如SEQ ID NO:19-20所示的引物的检测试剂或试剂盒。

本发明还提供所述分子标记或所述检测试剂或试剂盒的如下任一种应用：

(1)在检测所述植物雄性育性相关蛋白突变体或所述突变体材料中的应用；

(2)在筛选或培育雄性不育水稻突变体中的应用。

具体地，当选用SEQ ID NO:19-20所示引物扩增水稻基因组DNA时，若只能扩增出140bp一条带，则水稻表达所述植物雄性育性相关蛋白突变体、具有LOC_Os04g48490基因编码区的第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失的纯合基因型且表现出雄性不育性状；若只能扩增出149bp一条带，则水稻不表达植物雄性育性相关蛋白突变体、不具有LOC_Os04g48490基因编码区的第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失的基因型且表现出雄性可育性状；若能同时扩增出140bp和149bp两条带，则水稻表达植物雄性育性相关蛋白突变体、具有LOC_Os04g48490基因编码区的第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失的杂合基因型且表现出雄性可育性状。

本发明的第五个方面是提供一种制备雄性不育植物的方法，包括：使野生型植物雄性育性相关蛋白发生突变，所述突变包含如下氨基酸的突变：在NxYL保守序列中发生N、x、Y三个氨基酸中的至少一个的缺失；所述野生型植物雄性育性相关蛋白同上所述。

优选地，所述植物为水稻，所述方法包括：使水稻的基因组或转录组发生突变，所述突变包含如下突变：LOC_Os04g48490基因编码区的第118位～126位的AACAGCTAC碱基发生缺失，导致LOC_Os04g48490基因编码蛋白的第40、41和42位的天冬酰胺、丝氨酸和酪氨酸缺失；LOC_Os04g48490基因编码区的序列如SEQ ID NO.67所示，LOC_Os04g48490基因编码蛋白的序列如SEQ ID NO.3所示。

更优选地，所述方法包括：使水稻表达序列如SEQ ID NO:8所示的雄性育性相关蛋白突变体，且不表达SEQ ID NO:3所示的野生型植物雄性育性相关蛋白。

上述突变可通过基因编辑、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法实现。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供的水稻雄性育性调控蛋白GMS2突变体可使水稻花粉完全不育，导致水稻雄性不育。利用本发明的核不育突变体可培育新的核不育系，为水稻核不育系培育提供了一个简单、迅速、有效的方法。由本发明的GMS2突变体导致的水稻不育突变体与现有三系和两系不育系相比，具有不育性状稳定，种质资源利用率高等优势，可用于需要进行大量杂交的轮回选择育种，在杂交水稻育制种领域具有极大的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例2中灌浆期野生型(左)和gms2突变体(右)的植株形态。

图2为本发明实施例2中野生型(左)和gms2突变体(右)的小穗形态。

图3为本发明实施例2中野生型(左)和gms2突变体(右)穗开花的形态。

图4为本发明实施例2中解剖后野生型(左)和gms2突变体(右)的小花形态。

图5为本发明实施例2中野生型(左)和gms2突变体(右)的花药形态。

图6为本发明实施例2中野生型(左)和gms2突变体(右)花粉碘染。

图7为本发明实施例4中利用InD48490标记鉴定定位群体中不育单株的基因型。上带大小149bp，下带大小140bp。左边前2个泳道的DNA模板分别为gms2突变体和明恢63，后面泳道为定位群体中的不育单株。

图8A为本发明实施例4中GMS2基因图位克隆图。

图8B为本发明实施例4中gms2突变体的突变位点示意图。

图9为本发明实施例4中GMS2基因在9311(48490-9311)，明恢63(48490-MH63)，日本晴(48490-Nip)和gms2突变体(48490-3148)材料中的核苷酸序列差异。有差异的地方用灰色背景突出。每行最后一个核苷酸在整个基因序列中的位置标示在行末。起始密码子ATG和终止密码子TGA分别用方框标出。

图10为本发明实施例4中GMS2编码蛋白在9311(48490-9311)和gms2突变体(48490-3148)中的氨基酸序列差异。有差异的地方用浅灰色背景突出。每行最后一个氨基酸残基在整个蛋白序列中的位置标示在行末。

图11为本发明实施例4中GMS2杂合株后代基因型鉴定。上带大小149bp，下带大小140bp。箭头所指为来自雄性不育的样品。

图12为本发明实施例5中GMS2在水稻不同组织和不同发育时期幼穗中的表达量。花1-花9代表幼穗发育的颖花原基分化期至花粉成熟时期。

图13为本发明实施例6中pC9M-GMS2载体示意图。T1代表靶位点1，T2代表靶位点2。

图14A为本发明实施例6中利用CRISPR/Cas9系统对GMS2基因敲除后部分转基因阳性植株的靶位点序列分析。

图14B为本发明实施例6中转基因植株PC9M-GMS2-Line17在靶位点1和靶位点2处的测序峰图。其中，在靶位点1处的测序峰图中，箭头指向缺失位点；在靶位点2处的测序峰图中，箭头指向插入位点。

图15为本发明实施例6中GMS2野生型(左)、敲除植株PC9M-GMS2-Line17(右)的整株形态。

图16为本发明实施例6中GMS2野生型(左)、敲除植株PC9M-GMS2-Line17(右)的颖壳形态。

图17为本发明实施例6中GMS2野生型(左)、敲除植株PC9M-GMS2-Line17(右)的花药形态。

图18为本发明实施例6中GMS2野生型(左)、敲除植株PC9M-GMS2-Line17(右)的花粉碘染结果。

图19为本发明实施例7中pC1300-48490-genome载体示意图。

图20为本发明实施例7中野生型植株(左)和gms2突变体互补植株(右)的植株形态。

图21为本发明实施例7中野生型植株(左)和gms2突变体互补植株(右)的颖壳形态。

图22为本发明实施例7中野生型植株(左)和gms2突变体互补植株(右)的花药形态。

图23为本发明实施例7中野生型植株(左)和gms2突变体互补植株(右)的花粉碘染结果。

图24为本发明实施例8中水稻GMS2基因编码蛋白与其他物种基因组中的同源蛋白的序列比对图。包括琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)蛋白AT3G60900.1、香蕉(Musaacuminata)蛋白GSMUA_Achr11P03090_001、非洲栽培稻(Oryza glaberrima)蛋白ORGLA04G0194100.1、短药野生稻(Oryza brachyantha)蛋白OB04G29380.1、大麦(Hordeumvulgare)蛋白MLOC_7985.1、高粱(Sorghum bicolor)蛋白Sb06g026030.1、玉米(Zea mays)蛋白GRMZM2G003752_P01、小米(Setaria italica)蛋白Si010135m。NxYL保守序列用方框标出。

图25为本发明实施例8中水稻GMS2基因编码蛋白系统进化树分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明的应用范围。下述实施例中的所有技术和科学术语，如无特殊说明，均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。除非有相反指明，本发明所使用或提及的技术均为本领域普通技术人员公认的标准技术。所述试验材料，如无特别注明，均为本发明领域通用的试验材料。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明所述的雄性不育，特指由植物细胞核基因发生功能变化导致植物雄性生殖器官发育出现异常(无法产生正常雄蕊、花药或者正常的雄性配子体)并出现育性的丧失，即通常所说的雄性核不育(Genic male sterility)而非细胞质核不育(Cytoplasmic malesterility)。雄性生殖器官育性的异常和恢复均由细胞核内的基因加以控制。

因此，本发明也包括利用序列表所述序列调控植株的雄配子生育能力，即利用本发明提供的基因序列在基因组、和/或转录组、和/或蛋白质组水平影响其它植物中相同或同源基因的功能从而达到控制雄性生殖器官育性的目的。例如，包括但不限于下述方法：通过天然序列的变异导致基因表达抑制或蛋白质功能的丧失、通过向植物中转入所述基因的反义序列或引入发卡结构、或将所述基因与其它序列(DNA或RNA)相结合产生新的具有功能活性的DNA或RNA链，来影响或改变植物基因的功能。或其它本领域技术人员己知的可用于影响植物雄性育性的技术方法中的任何一种技术方法。

本发明包括水稻GMS2基因，其显性等位基因对植物雄性育性具有关键作用，功能缺失性的隐性等位基因会导致雄性不育。该基因位于水稻4号染色体，其基因具体位置如图8A、图8B所示。

该基因序列及其同源序列可从各种植物中获得，包括但不限于卷柏(Selaginellamoellendorffii)、毛果杨(populus trichocarpa)、芜菁(Brassica rapa)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、马铃薯(Solanum tuberosum)、葡萄(Vitis vinifera)、小果野芭蕉(Musa acuminata)、小米(Setaria italica)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、大麦(Hordeum vulgare)、短药野生稻(Oryzabrachyantha)、非洲栽培稻(Oryza glaberrima)、籼稻(Oryza sativa Indica Group)、粳稻(Oryza sativa Japonica Group)、小立碗藓(Physcomitrella patens)等。获得方法包括但不限于：使用水稻GMS2基因序列通过blastx、blastn或使用水稻GMS2氨基酸序列通过blastp从其它植物的基因组序列数据库、和/或cDNA序列数据库、和/或蛋白质序列数据库中调取；以水稻GMS2基因的DNA或cDNA或RNA序列为参考序列设计引物，从其它植物的基因组DNA或cDNA或RNA中利用PCR的方法直接获得；以水稻GMS2的基因序列设计探针，利用核酸杂交的方法从基因组文库中分离含有同源基因序列的DNA或cDNA或RNA片段。

GMS2基因同源序列指在与SEQ ID NO:3的氨基酸序列进行blastp比较分析后，Identities大于或等于35％、Positives大于或等于50％的植物基因序列。进行blastp时，所有参数均遵照http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/所示的默认设置进行。

下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，但这并非意欲对本发明的范围加以限制。

实施例1水稻雄性不育突变体gms2的筛选

2013年6月用钴60辐射93-11种子10公斤得到M₀代。辐射后的种子种植于海南省临高县试验田，成熟后分单株收种，共获得M₁代材料约6500份。2014年春，选种子量较多的3617个M₁代材料种植成株系，每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，并收种保存。其中在编号为3148的株系中发现一个不育突变体，命名为gms2。

实施例2水稻雄性不育突变体gms2的表型分析

与野生型相比，gms2突变体植株(图1)和小穗(图2)形态正常，花期稍迟。内、外稃大小、小花开张尺寸、开张时间与野生型没有明显差异(图3)。体式显微镜下观察突变体小花形态，发现子房，花柱，柱头均比野生型略大(图4)，但花药比野生型瘦小，颜色较浅(图5)。用碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I₂，w/w)溶液对花粉进行染色，如图6所示，野生型花粉粒大而圆并且被染成蓝黑色，而突变体花粉粒皱缩并且不能被染色。同一家系野生型植株套袋自交后正常结实，而gms2突变体不结实。而以水稻品种93-11为父本给gms2突变体授粉则可以结实。这表明该突变体为雄性不育突变体。

实施例3水稻雄性不育突变体gms2的遗传分析

在M5代种植gms2的分离群体80株，其中64株育性正常，16株不育，可育与不育株分离比符合3:1(χ²＝0.57，P>0.05)。用gms2与93-11回交，F1代植株全部可育。在F2代种植gms2的分离群体70株，其中57株育性正常，13株不育，可育与不育株分离比符合3:1(χ²＝0.85，P>0.05)。上述结果表明gms2的不育性状是由隐性单基因控制。

实施例4水稻雄性不育基因GMS2的克隆

使用图位克隆的方法对GMS2基因进行定位。以明恢63为父本与gms2突变体杂交构建了一个包含66棵突变植株的F₂群体。利用该群体将GMS2定位于4号染色体SSR标记RM17332和RM280之间6861.252Kb范围内，与SSR标记RM303及Indel标记4826紧密连锁。GMS2基因与上述四个标记之间的交换单株分别为8个，1个，1个，32个。利用连锁标记挑选F₂群体中的gms2杂合单株发展了一个F₃群体，包含1937个突变体单株。在F₃群体中RM303、4826、S10与GMS2基因之间的交换单株分别为10个，7个，8个。在RM303和S10之间通过分析和比较93-11和明恢63基因组的序列，开发并实验证实了5个新的单核苷酸多态性标记S4b，S3b，S2，S1，S8。在F3群体中，上述标记的交换单株分别为6个，6个，1个，4个，8个，(图7)。以S2上下游77kb为候选区段，发现在该区段内共有11个注释基因，其中LOC_Os04g48490预测编码一个成束蛋白样阿拉伯半乳聚糖蛋白，推测是GMS2基因。在日本晴中，LOC_Os04g48490基因组核苷酸序列长1582bp(记为48490-Nip，序列如SEQ ID NO:1)，CDS核苷酸序列长1296bp(序列如SEQ ID NO:2)，包含1个外显子(图8A和图8B)，编码一个长432个氨基酸残基的蛋白(序列如SEQ ID NO:3)。用于定位GMS2基因的标记引物对序列如表1所示(SEQ ID NO.37-66)。

表1用于定位GMS2基因的标记引物对序列

根据48490-Nip序列设计引物对LOC_Os04g48490基因在93-11、明恢63和gms2突变体中的等位基因进行扩增和测序，引物序列如表2所示。所有PCR扩增均使用KOD FX DNAPolymerase(TOYOBO CO.,LTD.Life Science Department,Osaka,Japan)，并按照产品说明的反应体系和条件，在Thermo scientific Arktik thermal cycler上进行PCR扩增。PCR产物送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序结果用DNAman 6.0进行拼接。93-11、明恢63和gms2突变体中的LOC_Os04g48490基因分别记为48490-9311(序列如SEQ ID NO:4)，48490-MH63(序列如SEQ ID NO:5)，48490-3148(序列如SEQ ID NO:6)。

表2用于扩增LOC_Os04g48490的引物对序列

对48490-9311、48490-3148、48490-MH63和48490-Nip进行多序列比对，结果如图9所示。48490-9311和48490-3148相比，48490-3148只在ATG后第118个碱基开始存在一个AACAGCTAC的缺失(图8B和图9)。氨基酸序列分析显示，该突变将导致LOC_Os04g48490基因编码蛋白中第40到第42位的天冬酰胺、丝氨酸和酪氨酸残基缺失(图10)。48490-MH63和48490-Nip与48490-3148也在ATG后118个碱基处存在上述相同差异(图9)。这表明ATG后118位碱基开始的AACAGCTAC的缺失突变是造成gms2突变体雄性不育的原因。此外48490-9311和48490-MH63的序列完全一致，而与48490-Nip相比，在第8位有一个A变C的SNP，在第109位有一个C变G的SNP，在1288位有一个T变C的SNP，在第1515位有一个G碱基的插入(图9)。两处核苷酸差异分别落在5’UTR和3’UTR中，另外两处核苷酸差异虽然落在外显子中，但并不影响编码蛋白。这表明LOC_Os04g48490基因在水稻中高度保守，其核苷酸序列即使在籼、粳亚种间也只存在4个碱基的差异，而蛋白质序列则没有差异。在93-11中LOC_Os04g48490的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO:67所示，编码蛋白序列如SEQ ID NO:3。在gms2突变体中LOC_Os04g48490的CDS核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

基于LOC_Os04g48490基因突变位点的测序结果，在突变位点两侧设计特异引物InD48490_F：GCTCCGGCTGTTGATCT(SEQ ID NO:19)和InD48490_R：GCCTGCTCTTCCTCCTG(SEQID NO:20)。当InD48490_F和InD48490_R配对扩增野生型LOC_Os04g48490基因时将产生149bp条带，扩增突变型LOC_Os04g48490基因时将产生140bp条带。使用InD48490_F和InD48490_R引物对对41株gms2的M6分离群体进行基因型检测。如图11所示，野生型要么扩增出149bp和140bp两条带，要么扩增出149bp一条带，而不育突变体均只能扩增出140bp一条带。这说明突变基因型与不育表型共分离，LOC_Os04g48490就是GMS2基因。

实施例5 GMS2基因的表达分析

取93-11各时期组织提取总RNA，反转录成cDNA。使用引物对InD48490_F：GCTCCGGCTGTTGATCT(SEQ ID NO:19)和InD48490_R：GCCTGCTCTTCCTCCTG(SEQ ID NO:20)检测GMS2的表达量，使用引物对GAPDH-RTF：GAATGGCTTTCCGTGTT(SEQ ID NO:25)和GAPDH-RTR：CAAGGTCCTCCTCAACG(SEQ ID NO:26)检测水稻内参基因GAPDH的表达量。采取实时定量PCR方法进行表达量分析。如图12所示，GMS2基因的表达量在根和茎中明显低于其它组织，在种子中明显高于其它组织。在茎节、叶、叶鞘和穗中，GMS2基因的表达量处于中等，但并不相同。在花1(花长1mm)、花2(花长2mm)、花3(花长3mm)、花4(花长4mm)、花5(花长5mm)、花6(花长5.5mm)、花7(花长6mm)、花8(花长7mm)、花9(花长8mm)到即颖花原基分化期至花粉成熟时期的穗中，GMS2的表达量呈现先降低后升高最后再降低的波动。

实施例6 GMS2基因敲除株系的获得及表型分析

利用CRISPR/Cas9系统对GMS2基因进行定向敲除。为了提高敲除效率，选择两个靶位点同时进行敲除。靶位点1位于外显子的负链上，序列为GCGGTCGGTGGCGGCCATGG(SEQ IDNO：17，位于序列SEQ ID NO:1的第45位第64位)，靶位点2位于外显子的上，序列为CGCCTCCCTCGCCGTCGCGG(SEQ ID NO：18，位于SEQ ID NO:1序列的第85位至第104位)。根据Ma等(Ma X,et al.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-EfficiencyMultiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.Mol Plant,2015,8:1274-84)的方法将靶位点1和靶位点2连入载体pC9M中，获得载体pC9M-GMS2(图13)。有pC9M-GMS2的大肠杆菌被命名为E.coli-pC9M-GMS2。将pC9M-GMS2通过电击转入农杆菌菌株EHA105中，得到的菌株命名为Ab-pC9M-GMS2。

利用重组农杆菌Ab-pC9M-GMS2侵染粳稻中花11(ZH11)愈伤组织，经潮霉素抗性筛选、分化、生根获得再生转基因株系25株。炼苗移栽后得到存活植株22株，提取所述植株叶片的总DNA，利用引物SP1：CCCGACATAGATGCAATAACTTC(SEQ ID NO:29)和SP2：GCGCGGTGTCATCTATGTTACT(SEQ ID NO:30)做阳性检测，全部为株阳性株。用靶位点1两侧的引物靶1-F：AAACCCACGCCCAGAAA(SEQ ID NO:31)和靶1-R：GCCAGGAGGAAGAGCAG(SEQ ID NO:32)以及靶位点2两侧的引物靶2-F：GCCTGCTCTTCCTCCTG(SEQ ID NO:33)和靶2-R：GTGCTCCGGCTGTTGAT(SEQ ID NO:34)扩增基因组DNA，扩增产物测序后与基因组进行比对。结果显示14株T0植株发生了基因编辑，其中一株发生纯合突变，8株T0代苗未被编辑。

植株PC9M-GMS2-Line17的基因组DNA在靶位点1和靶位点2处均发生了纯合突变，其中在靶位点1处发生了TG碱基缺失(SEQ ID NO:27)，在靶位点2处发生了T碱插入(SEQ IDNO:28)(图14B)。PC9M-GMS2-Line1的基因组DNA在靶位点1处发生了双等位突变，其中等位基因1发生了A碱基插入，等位基因2发生了T碱基缺失；PC9M-GMS2-Line1的基因组DNA在靶位点2处也发生了双等位突变，在等位基因1发生了G/T碱基SNP，等位基因2发生了G/C碱基SNP。PC9M-GMS2-Line3的基因组DNA在靶位点1处发生了双等位突变，其中等位基因1发生了TG碱基缺失，等位基因2发生了A碱基插入；PC9M-GMS2-Line3的基因组DNA在靶位点2处也发生了双等位突变，在等位基因1发生了G/T碱基SNP，等位基因2发生了C碱基缺失。而转基因阴性单株PC9M-GMS2-Line2，PC9M-GMS2-Line5，PC9M-GMS2-Line7基因型并未改变(图14A)。

开花后对上述阳性株进行表型分析。与野生型ZH11相比，GMS2敲除植株PC9M-GMS2-Line17在株叶和小穗形态上并无明显差别(图15和图16)。但GMS2敲除植株的花药明显更加瘦小(图17)。花粉碘染结果表明，野生型ZH11的花粉大而圆，可以被染色，而GMS2敲除植株的花粉小而皱缩，不能被染色(图18)。其它GMS2双等位突变植株也表现出雄性不育的性状。

实施例7 gms2突变体转基因互补株系的获得及表型分析

以9311的基因组DNA为模板，用引物3148HB-F：CgcgtttcgaaatttTGATTTCTTCATCGCACT(SEQ ID NO:35)和3148HB-R：GtcgcgatcgcatgcACAACATGGTGCAACAGTG(SEQ ID NO:36)扩增获得带有GMS2起始密码子ATG上游2kb和终止密码子TGA下游515bp的基因全长片段。将该片段用Kpn I和BamH I双酶切后连入pC1300获得质粒pC1300-48490-genome(图19)。有pC1300-48490-genome的大肠杆菌被命名为E.coli-pC1300-48490-genome。将pC1300-48490-genome通过电击转入农杆菌菌株EHA105中，得到的菌株命名为Ab-pC1300-48490-genome。利用重组农杆菌Ab-pC1300-48490-genome侵染gms2突变体愈伤组织，经抗性筛选、分化、生根共获得转基因阳性植株4株，4株育性均恢复正常(图20、图21、图22和图23)。这进一步证明GMS2基因调控花粉发育，该基因突变会导致花粉败育。

实施例8 GMS2编码蛋白与其同源蛋白的序列比对及进化树分析

利用blastp工具在NCBI的Genbank数据库中对水稻GMS2基因编码蛋白的氨基酸序列进行同源性搜索，得到了琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)、香蕉(Musa acuminata)、非洲栽培稻(Oryza glaberrima)、短药野生稻(Oryza brachyantha)、大麦(Hordeumvulgare)、高粱(Sorghum bicolor)、玉米(Zea mays)、小米(Setaria italica)基因组中预测的同源蛋白，将这些蛋白序列进行比对分析，结果显示来自不同植物的同源蛋白都具有非常相似的保守序列，彼此之间同源性很高(图24和图25)，表明该蛋白在植物花的雄性器官发育过程中生物学功能保守，起着非常重要的作用。

在琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；香蕉(Musa acuminata)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；非洲栽培稻(Oryza glaberrima)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；短药野生稻(Oryza brachyantha)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；大麦(Hordeumvulgare)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示：高粱(Sorghum bicolor)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；玉米(Zea mays)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；小米(Setaria italica)中该育性基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

实施例9转育带有GMS2基因的隐性核不育系

用gms2突变体与育性正常的受体，如H28B，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行gms2基因和遗传背景选择，最终获得H28B背景下带有纯合GMS2突变基因的隐性核不育系。具体实施步骤如下：

1、以受体亲本，如H28B，为父本与gms2杂交获得F₁。

2、以F₁为母本与受体亲本，如H28B，回交获得BC₁F₁。

3、种植BC₁F₁，使用引物InD48490_F：GCTCCGGCTGTTGATCT(SEQ ID NO:19)和InD48490_R：GCCTGCTCTTCCTCCTG(SEQ ID NO:20)检测gms2基因型。选择gms2杂合基因型，即同时能扩增出149bp和140bp条带的植株。

4、使用一组(例如100个，或200个等)基因型在gms2突变体和轮回亲本基因组之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。

5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如H28B，回交获得BC₂F₁。

6、种植BC₂F₁，重复步骤3和步骤4，选出gms2基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC₂F₂。

7、种植BC₂F₂，重复步骤3和步骤4，选出gms2基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC₂F₃。BC₂F₃后代中分离的gms2纯合株即gms2隐性核不育系，BC₂F₃用于保存gms2隐性核不育系种质资源。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种水稻雄性育性调控基因突变体及其分子标记和应用

<130> KHP201111607.9

<160> 67

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1582

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctccccaccg tgtcacacca caccacacaa caccaccacc gccgccatgg ccgccaccga 60

ccgccgcctg ctcttcctcc tggccgcctc cctcgccgtc gcggcggtga gctcccacaa 120

catcacggac atcctcgacg gctacccgga gtactcgctg tacaacagct acctctccca 180

gaccaaggtg tgcgacgaga tcaacagccg gagcacggtc acctgcctcg tgctcaccaa 240

cggcgccatg tcctccctcg tctccaacct ctccctcgcc gacatcaaga acgcgctccg 300

cctcctcacc ctcctcgact actacgacac caagaagctg cactccctca gcgacggctc 360

cgagctcacc accacgctgt accagaccac cggcgacgcc tccggtaaca tgggccacgt 420

caacatcacc aacctgcgcg gcggcaaggt tgggttcgcc tccgccgcgc ccggctccaa 480

gttccaggcc acctacacca agtccgtcaa gcaggagccg tacaacctct ccgttcttga 540

ggtctccgac cccatcacct tccccggcct cttcgactcc ccgtcggccg cgtcgaccaa 600

cctcaccgcg cttcttgaga aggccgggtg caagcagttc gcgcggctca tcgtgtcgtc 660

cggggtgatg aagatgtacc aggcggccat ggacaaggcg ctgacgctgt tcgcgcccaa 720

cgacgacgcg ttccaggcca agggcctgcc ggatctgagc aagctgacca gcgccgagct 780

ggtgacgctt ctgcagtacc acgccttgcc gcagtacgcg cccaaggcgt cgctcaagac 840

catcaagggc cacatccaga ccctggcctc caccggagcg ggtaagtacg acctctccgt 900

cgtcactaag ggcgacgacg tgtccatgga caccggcatg gacaagtccc gcgtcgcgtc 960

caccgtgctg gacgacaccc cgacggttat ccacacggtg gacagcgtgc tgctgccgcc 1020

agagctcttc ggtggcgcac cttcccccgc gccggcgccc ggaccggcaa gcgatgtgcc 1080

agccgcttct cccgcgccag aaggctcctc gccggcgccc tcccccaagg cggcgggcaa 1140

gaagaaaaag aagggcaagt cgccttccca ttccccaccc gcgcctccgg ccgacacgcc 1200

tgacatgtcg cccgccgacg cgcccgcggg agaagaggct gcagacaaag ccgagaagaa 1260

gaacggcgcc accgcggcgg ccacgagcgt tgcggccact gtggcctccg ccgccgctct 1320

gctcgccgcg tcgttcttgt gagcgtcagg tgttcgacgt tgagctctcg ttgttccccc 1380

ctgggcatgc atggtgtgat gcagtccggt gttcgcttct gagctcgtgg gctccatgga 1440

taatctcatc ctgaagttgt gttcttctct tcctggttgg tagtactcgg tagttagata 1500

ggatttgaat gattggatcc tcaggtggag aacggtgatt gtgatgccta ttttgttaga 1560

gctcggaacc atgttttgtt tt 1582

<210> 2

<211> 1296

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccgcca ccgaccgccg cctgctcttc ctcctggccg cctccctcgc cgtcgcggcg 60

gtgagctccc acaacatcac ggacatcctc gacggctacc cggagtactc gctgtacaac 120

agctacctct cccagaccaa ggtgtgcgac gagatcaaca gccggagcac ggtcacctgc 180

ctcgtgctca ccaacggcgc catgtcctcc ctcgtctcca acctctccct cgccgacatc 240

aagaacgcgc tccgcctcct caccctcctc gactactacg acaccaagaa gctgcactcc 300

ctcagcgacg gctccgagct caccaccacg ctgtaccaga ccaccggcga cgcctccggt 360

aacatgggcc acgtcaacat caccaacctg cgcggcggca aggttgggtt cgcctccgcc 420

gcgcccggct ccaagttcca ggccacctac accaagtccg tcaagcagga gccgtacaac 480

ctctccgttc ttgaggtctc cgaccccatc accttccccg gcctcttcga ctccccgtcg 540

gccgcgtcga ccaacctcac cgcgcttctt gagaaggccg ggtgcaagca gttcgcgcgg 600

ctcatcgtgt cgtccggggt gatgaagatg taccaggcgg ccatggacaa ggcgctgacg 660

ctgttcgcgc ccaacgacga cgcgttccag gccaagggcc tgccggatct gagcaagctg 720

accagcgccg agctggtgac gcttctgcag taccacgcct tgccgcagta cgcgcccaag 780

gcgtcgctca agaccatcaa gggccacatc cagaccctgg cctccaccgg agcgggtaag 840

tacgacctct ccgtcgtcac taagggcgac gacgtgtcca tggacaccgg catggacaag 900

tcccgcgtcg cgtccaccgt gctggacgac accccgacgg ttatccacac ggtggacagc 960

gtgctgctgc cgccagagct cttcggtggc gcaccttccc ccgcgccggc gcccggaccg 1020

gcaagcgatg tgccagccgc ttctcccgcg ccagaaggct cctcgccggc gccctccccc 1080

aaggcggcgg gcaagaagaa aaagaagggc aagtcgcctt cccattcccc acccgcgcct 1140

ccggccgaca cgcctgacat gtcgcccgcc gacgcgcccg cgggagaaga ggctgcagac 1200

aaagccgaga agaagaacgg cgccaccgcg gcggccacga gcgttgcggc cactgtggcc 1260

tccgccgccg ctctgctcgc cgcgtcgttc ttgtga 1296

<210> 3

<211> 431

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Ala Thr Asp Arg Arg Leu Leu Phe Leu Leu Ala Ala Ser Leu

1 5 10 15

Ala Val Ala Ala Val Ser Ser His Asn Ile Thr Asp Ile Leu Asp Gly

20 25 30

Tyr Pro Glu Tyr Ser Leu Tyr Asn Ser Tyr Leu Ser Gln Thr Lys Val

35 40 45

Cys Asp Glu Ile Asn Ser Arg Ser Thr Val Thr Cys Leu Val Leu Thr

50 55 60

Asn Gly Ala Met Ser Ser Leu Val Ser Asn Leu Ser Leu Ala Asp Ile

65 70 75 80

Lys Asn Ala Leu Arg Leu Leu Thr Leu Leu Asp Tyr Tyr Asp Thr Lys

85 90 95

Lys Leu His Ser Leu Ser Asp Gly Ser Glu Leu Thr Thr Thr Leu Tyr

100 105 110

Gln Thr Thr Gly Asp Ala Ser Gly Asn Met Gly His Val Asn Ile Thr

115 120 125

Asn Leu Arg Gly Gly Lys Val Gly Phe Ala Ser Ala Ala Pro Gly Ser

130 135 140

Lys Phe Gln Ala Thr Tyr Thr Lys Ser Val Lys Gln Glu Pro Tyr Asn

145 150 155 160

Leu Ser Val Leu Glu Val Ser Asp Pro Ile Thr Phe Pro Gly Leu Phe

165 170 175

Asp Ser Pro Ser Ala Ala Ser Thr Asn Leu Thr Ala Leu Leu Glu Lys

180 185 190

Ala Gly Cys Lys Gln Phe Ala Arg Leu Ile Val Ser Ser Gly Val Met

195 200 205

Lys Met Tyr Gln Ala Ala Met Asp Lys Ala Leu Thr Leu Phe Ala Pro

210 215 220

Asn Asp Asp Ala Phe Gln Ala Lys Gly Leu Pro Asp Leu Ser Lys Leu

225 230 235 240

Thr Ser Ala Glu Leu Val Thr Leu Leu Gln Tyr His Ala Leu Pro Gln

245 250 255

Tyr Ala Pro Lys Ala Ser Leu Lys Thr Ile Lys Gly His Ile Gln Thr

260 265 270

Leu Ala Ser Thr Gly Ala Gly Lys Tyr Asp Leu Ser Val Val Thr Lys

275 280 285

Gly Asp Asp Val Ser Met Asp Thr Gly Met Asp Lys Ser Arg Val Ala

290 295 300

Ser Thr Val Leu Asp Asp Thr Pro Thr Val Ile His Thr Val Asp Ser

305 310 315 320

Val Leu Leu Pro Pro Glu Leu Phe Gly Gly Ala Pro Ser Pro Ala Pro

325 330 335

Ala Pro Gly Pro Ala Ser Asp Val Pro Ala Ala Ser Pro Ala Pro Glu

340 345 350

Gly Ser Ser Pro Ala Pro Ser Pro Lys Ala Ala Gly Lys Lys Lys Lys

355 360 365

Lys Gly Lys Ser Pro Ser His Ser Pro Pro Ala Pro Pro Ala Asp Thr

370 375 380

Pro Asp Met Ser Pro Ala Asp Ala Pro Ala Gly Glu Glu Ala Ala Asp

385 390 395 400

Lys Ala Glu Lys Lys Asn Gly Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ser Val Ala

405 410 415

Ala Thr Val Ala Ser Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Phe Leu

420 425 430

<210> 4

<211> 1583

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctccccaacg tgtcacacca caccacacaa caccaccacc gccgccatgg ccgccaccga 60

ccgccgcctg ctcttcctcc tggccgcctc cctcgccgtc gcggcggtca gctcccacaa 120