一种用于高脂饮食诱导肥胖小鼠减肥的肋柱花提取物及制备方法
阅读说明：本技术 一种用于高脂饮食诱导肥胖小鼠减肥的肋柱花提取物及制备方法 (Extract of lomatogonium carinthiacum for inducing obese mice to lose weight by high-fat diet and preparation method thereof ) 是由 付明海 阿丽沙 巴根那 李慧芳 小平 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种用于高脂饮食诱导肥胖小鼠减肥的肋柱花提取物及制备方法；所述肋柱花提取物为将肋柱花全草经二氯甲烷溶液浸泡,用乙醇提取,干燥,得到的肋柱花提取物。本发明还涉及前述肋柱花提取物的制备方法。本发明所涉及的肋柱花提取物可显著降低小鼠相对体重增长率、摄食量、Lee`s指数、肝脏重量,进而达到有效减肥的目的。(The invention provides a stylosanthes guianensis extract for inducing obese mice to lose weight by high-fat diet and a preparation method thereof; the extract of the lomatogonium carinthiacum is obtained by soaking whole plant of the lomatogonium carinthiacum in dichloromethane solution, extracting with ethanol, and drying. The invention also relates to a preparation method of the extract of the lomatogonium carinthiacum. The extract of the lomatogonium carinthiacum can obviously reduce the relative weight growth rate, the food intake, the Lee's index and the liver weight of a mouse, thereby achieving the purpose of effectively losing weight.)
技术领域
本发明属于民族药领域；尤其涉及一种用于高脂饮食诱导肥胖小鼠减肥的肋柱花提取物及制备方法。
背景技术
肥胖症是WHO确定由基因、环境和运动因素共同作用引起，特别是由摄入食营养物质过剩导致体内脂肪堆积引起的十大慢性代谢疾病之一。肥胖不仅仅会带来身体形态的改变，更重要的是因超重和肥胖引起的代谢综合症——高血压、高血脂、2型糖尿病、冠心病、恶性肿瘤、多囊卵巢综合症、睡眠呼吸暂停等疾病，已经成为我们生活中的健康的隐形“杀手”。肥胖症体内甘油三酯存储量过多会引起内脏脂肪组织中巨噬细胞的显著积累，从而引起脂肪因子和促炎细胞因子的释放改，如TNF-和IL-6等导致代谢异常。
因此，肥胖具有持续的全身低水平炎症反应的特点。目前的治疗方法主要有Roux-en-Y胃分流术、可调节胃束带和袖状胃切除术，认知补救后行为减肥治疗，纳米颗粒抗血管生成疗法治疗、使用Hypothalamic brain-derived neurotrophic factor(BDNF)或Fibroblast growth factor 21(FGF21)基因疗法，以及肠道菌群等。
近年来随着对肠道菌群研究的深入，逐渐发现肠道菌群与肥胖的形成和发展息息相关。肠道菌群栖居在人体肠道内，并且与人体相互依赖生存的细菌构成的微生物群。人体的肠道有100～1500种近数百万亿个细菌，其数目与人体细胞总数接近，比例约1∶1。肠道菌群对人体健康和维持人体生理功能具有巨大的影响和作用，例如可调节机体免疫系统和代谢异常性疾病，也可以通过对肠道上皮细胞的影响来控制人体对能量的吸收。长期进食高脂、高糖饮食，可造成肠道菌群紊乱，使有益菌比例下降，而致病菌比例增加。肠道菌群的失调还会导致肠道黏膜通透性的增加和慢性炎症的发生。而低度炎症可使机体出现胰岛素抵抗、血脂紊乱，进一步影响糖、脂代谢，最终引起糖尿病和肥胖的发生发展。
蒙药肋柱花〔Lomatogoniumrotatum(L.)Fries ex Nym.〕，蒙古名哈比日根-地格达，1998年被载入《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》，具有清热，健胃，愈伤等功能。近期研究表明蒙药肋柱花中的山酮类化合物、獐牙菜苦苷、木犀草素、齐墩果酸等成分具有不同程度的保肝、利胆活性，为肋柱花的主要活性成分之一。研究者发现蒙药肋柱花除了有保肝利胆作用外，其黄酮类化合物1-羟基-3,5,8-三甲氧基黄酮、l-羟基-3,7,8-三甲氧基黄酮、甲基獐牙菜苦苷和6,8-二羟基-1,2-二甲氧基黄酮可以治疗肥胖相关疾病，可减轻高糖食物摄入引起的高胆固醇血症和高甘油三酯血症，并改善胰岛素抵抗大鼠的脂质和瘦素代谢。然而，肋柱花是否对调节肠道微生物群预防肥胖的作用尚未报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种用于高脂饮食诱导肥胖小鼠减肥的肋柱花提取物及制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种用于高脂饮食诱导肥胖小鼠减肥的肋柱花提取物，肋柱花提取物为将肋柱花全草经二氯甲烷溶液浸泡，用乙醇提取，干燥，得到的肋柱花提取物。
本发明还涉及前述的用于高脂饮食诱导肥胖小鼠减肥的肋柱花提取物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，将蒙药材肋柱花全草，阴凉处晾干，粉碎成粒径为0.5cm的粉末；
步骤2，用二氯甲烷溶液浸泡一夜后，每2小时提取一次，提取2次；
步骤3，药渣用95％乙醇浸泡一夜后，每3小时提取一次，提取2次，回收乙醇，冷冻干燥机制成粉末。
本发明所涉及的肋柱花的主要化学成分为黄酮类、萜类和其他化合物。
其中，萜类为三萜及环烯醚萜苷，包括：齐墩果酸、獐牙菜苦苷、2α-羟基齐墩果酸、乌苏酸、lomacarinoside A、lomacarinoside B等6种化合物。
黄酮类为双苯吡酮及其苷、黄酮及其苷、黄酮醇、双黄酮碳苷等；包括：山奈酚、木犀草素、芹菜素、木犀草素-7-O-D-β-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-D-β-葡萄糖苷、芒果苷、苦龙胆酯苷、当药醇苷、异荭草苷、异牡荊苷、当药黄素等22种化合物。
黄酮类化合物中木犀草素可减少3T3-L1细胞和HepG2细胞中脂质聚集，具有降脂作用，木犀草素还能够抑制肥胖相关的巨噬细胞极化，减少肥胖。
萜类化合物中的獐牙菜苦苷可改善高脂饮食诱导的脂质沉积和高脂血症，有降低血脂和血糖的作用。
萜类中的齐墩果酸具有显著的抑制3T3-L1脂肪细胞脂质形成作用，通过降低脂质堆积,调节血脂代谢,在一定程度上有利于保护血管和预防心血管疾病。齐墩果酸具有抗肥胖、抗糖尿病、降血脂作用。
萜类中的乌苏酸可促进3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化，增加脂肪细胞葡萄糖摄取,抑制游离脂肪酸产生，促进脂联素分泌,对脂肪细胞胰岛素抵抗有明显的改善作用。乌苏酸具有明显降低肥胖雄性小鼠的体重和脂肪组织质量的作用，改善了糖耐量和胰岛素敏感性。
黄酮类中的芒果苷可促进IR-HepG2细胞对葡萄糖的摄取，降低TG、TC含量，改善胰岛素抵抗及糖脂代谢异常状态的作用。芒果苷还可以明显增加C57BL6/J小鼠葡萄糖氧化而不改变脂肪酸氧化，明显降低高脂饮食所引起的小鼠体重增加、体内脂肪堆积，促进能量消耗和碳水化合物的利用，提高胰岛素敏感性。
黄酮类中的山奈酚也可以有效抑制oxLDL诱导的巨噬细胞内脂质的聚集，有降脂作用。
本发明将制备肋柱花提取物具体的应用如下：
将KM雄性小鼠给予高脂饲料建立肥胖模型，待8W之后，除普通饮食组(ND)，肥胖模型小鼠(以ND组为实验对照组，体重大于ND组小鼠的20％)随机分为高脂饮食组(HFD)，肋柱花高剂量组(LR 1.8g/kg)、肋柱花中剂量组(LR 0.9g/kg)、肋柱花低剂量组(LR0.18g/kg)和阳性对照组(Orlistat，0.048g/kg)。每周观察并记录小鼠体重和摄食量。连续给药9周后检测相关减肥指标。
本发明具有以下优点：
(1)本发明所涉及的肋柱花提取物可显著降低小鼠相对体重增长率、摄食量、Lee`s指数、肝脏重量，进而达到有效减肥的目的；
(2)本发明所涉及的肋柱花提取物对LR1.8g/kg组血清三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)水平也显著下降，高密度脂蛋白(HDL)有所增加，LR0.18g/kg还可以显著下调血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平。
附图说明
图1是肋柱花提取物对体重和摄食量的影响图；
图2是肋柱花提取物对脂肪组织和肝脏重量的影响图；
图3是肋柱花提取物对血清血脂指标和肝脏指标的影响图。
图4为光学显微镜下HE染色观察到的肝组织脂质水平和组织病理学的变化图；
图5为光学显微镜下HE染色观察到的肠周脂肪组织脂质水平和组织病理学的变化图；
图6为光学显微镜下HE染色观察到的肾周脂肪组织脂质水平和组织病理学的变化图；
图7为光学显微镜下HE染色观察到的睾周脂肪组织脂质水平和组织病理学的变化图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例
本实施例涉及肋柱花提取物的制备方法及应用；
一、使用的材料
1.1实验仪器
VarioskanTM LUX多功能微孔板读数仪(Thermo Fisher Scientific-CN)，Sigma3-18KS高速冷冻离心机，FD-1A-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)，全自动生化仪电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)。
1.2实验药品与试剂
肋柱花采自内蒙古锡林郭勒盟西乌旗，经内蒙古民族大学蒙医药学院布和巴特尔教授鉴定为龙胆科植物肋柱花Lomatogoniumcarinthiacum(Wulf)Reichb.的干燥全草。高脂饲料(山东恒容生物科技有限公司)，普通饲料(辽宁长生生物技术股份有限公司)。
1.3实验动物
实验选用雌雄SPS级KM小鼠，5周龄，体质量(35±2)g，80只，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物许可证号：SCXK(辽)2015-0001。
二、操作方法
2.1肋柱花提取物的制备
将蒙药材肋柱花全草，阴凉处晾干粉碎后再用二氯甲烷溶液浸泡一夜后4h提取2次，药渣用95％乙醇浸泡一夜后6h提取2次，回收乙醇，再用使用冷冻干燥机制成粉末。
2.2动物分组、造模、给药和样品采集
将80只SPS级KM小鼠适应性饲养1周后，随机分为2组，10只给予普通饲料为普通饮食组(normal diet group，ND)，其余给予高脂饲料建立肥胖模型，自由饮水、摄食，动物房内12h昼夜循环，室温(22±2)℃，相对湿度40％～50％。
待8周后，以普通饮食组为实验对照组，剔除抗肥胖小鼠，以平均体重超过20％为肥胖标准，确定肥胖模型。待造模成功后，在高脂饲料喂养的基础上将肥胖模型随机分为高脂饮食组(high fat diet group，HFD)、肋柱花高、中、低剂量组(1.8g/kg、0.9g/kg、0.18g/kg)组和阳性对照(orlistat，0.048g/kg)组，每组n＝10只。ND和HFD给予同等体积的生理盐水，每天1次，连续灌胃给药9周。在此期间每周观察并记录小鼠体质量、摄食量。实验末次给药后，禁食12h，不禁水，测体重后10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉后测量体长，肥胖指数(Lee’s指数)，采集血清，称取肾周、睾周、肠周脂肪和肝组织，在结肠部分收集粪便样品后立即在液体氮气中冷冻，并储存在-80℃。
2.3生化分析检测血清和肝脏指标
实验末次给药2h后，称重，计算麻醉量，打麻药(10％水合氯醛：0.003ml/g)。1ml注射器快速抽血，冰盒放置30min，3 000r/min离心10min，上清液分装后立即在液体氮气中冷冻，于-80℃冰箱保存。利用全自动生化仪检测血清中三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(LDL)、低密度脂蛋白(HDL)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)(从深圳库贝尔生物科技股份有限公司购买)水平。
2.4 HE染色观察肝组织和脂肪组织病理变化
肝脏和肠周脂肪、肾周脂肪、睾周脂肪组织固定在10％多聚甲醛溶液中，80％、90％、95％、95％、100％乙醇梯度脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，切成3μm切片置于载玻片上，62度烘片一小时。将石蜡切片依次放入二甲苯、无水乙醇及95％、90％、80％乙醇、自来水冲洗，然后将切片置入苏木素中染色1-3min，伊红染色30s，最后用中性树胶封片。在显微镜下观察肝组织和脂肪组织细胞结构状态及病理损伤情况并拍照。细胞核呈蓝色,胞浆和其他组织成分呈现出深浅不一的红色。
三、实验结果
3.1肋柱花提取物对肥胖小鼠体重增长量、Lee`s指数和摄食量的影响
结果见图1肋柱花提取物对体重和摄食量的影响图，其中，A为高脂饮食诱导小鼠8周内体重增长变化曲线图；B为肋柱花给药期间体重与时间分析(n＝每组10)的对比图；C为肋柱花给药9周后对肥胖小鼠摄食量的影响结果图，*P＜0.05，D为肋柱花给药9周后对肥胖小鼠Lee`s指数的影响结果图，#P＜0.05。正如预期的那样，经口灌胃肋柱花和orlistat后通过分析各组小鼠体质量发现，与ND组相比，HFD组的体重、摄食量和Lee`s指数增加，通过肋柱花给药可以减少这种情况。结果证明LR1.8g/kg、LR0.9g/kg、LR0.18g/kg与orlistat均可显著降低高脂饮食诱导肥胖小鼠体重和摄食量的增加、减少Lee`s指数。
Lee`s指数、体重和脂肪含量的增加是评价肥胖的重要指标。高脂饮食诱导肥胖后Lee`s指数、体重和脂肪含量会明显增加，在本实验中模型组再次证实了这一点。实验结果显示，使用肋柱花提取物可以显著减少HFD诱导的肥胖小鼠的Lee`s指数和体重的增加，并减少肠周脂肪、肾周脂肪和附睾脂肪组织的脂肪质量。
3.2肋柱花提取物对肥胖小鼠脂肪组织和肝脏重量的影响
结果见图2肋柱花对脂肪组织和肝脏重量的影响图，其中，A为肋柱花提取物对肠周脂肪的影响图；B为肋柱花提取物对肾周脂肪的影响图；C为肋柱花提取物对睾周脂肪的影响图；D为肋柱花提取物对肝重量的影响图。可见与ND组相比，HFD组脂肪组织明显增加*P＜0.05，与HFD组相比，肋柱花给药后脂肪组织重量明显减少#P＜0.05。在造模成功后9周的给药期间，HFD喂养后观察到肠周脂肪、肾周脂肪、睾周脂肪及肝脏重量的显着增加。与HFD组相比肋柱花提取物灌胃后显著降低肠周、肾周和睾周脂肪)。此外，LR 1.8g/kg和LR0.18g/kg组显著降低肝脏重量(P＜0.05)。特别是，LR1.8g/kg组肝脏重量与ND组相比没有显着差异(p＞0.05)。
3.3肋柱花提取物对肥胖小鼠脂血清血脂指标和肝脏指标的影响
见图3肋柱花提取物对血清血脂指标和肝脏指标的影响图所示；其中，A为TC对比图；B为TG对比图；C为HDL对比图；D为AST对比图；E为ALT对比图。利用全自动生化仪检测小鼠的血清TC、TG、HDL-C、LDL-C浓度。与ND组相比HFD组TC，TG和HDL-C显着增加，LDL-C显著降低。在HFD喂养的小鼠中LR1.8g/kg组显著降低了TC，TG水平，增加和HDL-C浓度，见图3中的A-C。ALT和AST是评价肝功能的2个标志物，与ND组相比，模型组小鼠血清中ALT和AST水平较高(P＜0.001)，说明模型组小鼠肝脏受损严重。给予肋柱花提取物后，LR0.18g/kg组小鼠血清ALT水平显著下调(P＜0.05)，而AST受肋柱花提取物的影响不太显著，见图3中的D、E。这些结果表明,肋柱花提取物可能会改善肥胖小鼠的血脂异常，并且可以修复肥胖小鼠一定程度的肝损伤情况，但AST浓度不受肋柱花提取物的显著影响。
研究表明，肥胖尤其腹部肥胖者常伴有脂代谢紊乱,即血脂异常，表现为TG、TC和LDL-C升高和HDL-C降低。血脂异常是冠心病、间歇性跛行和脑瘫的主要风险因素。由于现在人们对于血脂异常、动脉粥样硬化及由此引起的心脑血管疾病的注意力增加，对治疗血脂异常的研究越来越颇受重视。因此，在发明检测了肋柱花对血脂指标的影响，发现有降低TC、TG，显著增加血清HDL水平的作用。TC是合成肾上腺皮质激素、胆酸、性激素及维生素D等生理活性物质的重要材料，同样也是细胞膜的主要组成成分，脂肪代谢的程度以其血清浓度为指标。TG是心血管疾病的重要因素,其升高会引起糖尿病,甲状腺机能减退、肾病综合症和胰腺炎和动脉粥样硬化等疾病。HDL作为一种脂蛋白可抗动脉粥样硬化的形成，是冠心病的主要保护因素，可清除胆固醇在外周组织的聚集，以防动脉硬化的形成。相反，LDL容易引起动脉硬化的形成，故该蛋白称为“不良胆固醇”。这些实验结果再次证实了肋柱花提取物具有降血脂作用。
3.4肝组织和脂肪组织脂质水平及组织病理学变化
图4为光学显微镜下HE染色观察到的肝组织脂质水平和组织病理学的变化图。结果显示，ND细胞核圆形和染成紫色,细胞质染红紫色。HFD细胞形态和边界不清楚，中可见大小不等的脂质空泡，部分细胞脂质空泡融合，总脂质泡面积大。与ND组相比，肝组织中明显有更多的脂肪沉积。虽然LR组肝细胞结构清晰，虽有少量空泡，但与HFD组相比胞质空泡面积明显减少。其中LR0.18g/kg组最为明显。
图5-7为光学显微镜下HE染色观察到的肠周脂肪、肾周脂肪、睾周脂肪组织脂质水平和组织病理学的变化图。与ND小组相比，HFD组小鼠脂肪细胞变大，内部充满脂滴，显微镜相同视野范围内，脂肪细胞数量明显减少。与HFD组相比LR组小鼠肠周脂肪细胞直径显著减小，显微镜相同视野内脂肪细胞数量明显增加。与HFD组相比LR0.9g/kg和LR0.18g/kg组肾周脂肪细胞直径显著减小，显微镜相同视野内脂肪细胞数量明显增加。与HFD组相比LR0.18g/kg组睾周脂肪细胞直径显著减小，显微镜相同视野内脂肪细胞数量明显增加。该结果可能是由于LR可以减少脂肪细胞内脂滴的积累，抑制脂肪细胞变大所致。
由上述内容证明，HE染色结果也说明肋柱花提取物可改善内脏脂肪细胞大小，显微镜下相同视野内脂肪细胞数量明显增加。这些结果说明肋柱花具有良好的抵抗高脂饮食诱导肥胖的效果。
综上所述，本发明分别针对蒙药肋柱花对HFD诱导的肥胖小鼠的体重增加、摄食量、脂肪组织重量、血清血脂指标、肝脏重量和微生物群等的影响进行研究，最终证明了蒙药肋柱花提取物干预可显著降低体重增长率、摄食量、Lee`s指数、肝脏、脂肪组织重量、TC、TG和ALT指数，显著增加血清HDL水平。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。
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