阅读说明：本技术 生物纤维环制备方法 (Preparation method of biological fiber ring ) 是由 陈海萍 谢世坤 纪军 吴素蓉 潘维东 邹杰慧 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物纤维环制备方法。该方法可实现材料和细胞集成加工,直接利用静电纺丝工艺制备生物纤维环。具体步骤为：(1)用完全培养基配制喷洒在旋转装置上的材料、用去离子水配制水溶性可降解高分子聚合物成均一溶液；(2)将可降解高分子聚合物溶液高温蒸汽消毒后均分三份；(3)将外层细胞悬液、内层细胞悬液分别加入到上述消毒后的二份材料里面,搅拌均匀；(4)用三个喷头分别抽取上述三份材料按制备顺序置于微量泵上,开启高压电源和微量泵,设置好相应的参数,进行电喷,最后得到生物纤维环。本技术发明方法简单易行,生物纤维环对椎间盘突出治疗具有重大的现实意义。(The invention relates to a preparation method of a biological fiber ring. The method can realize integrated processing of materials and cells, and directly utilizes the electrostatic spinning process to prepare the biological fiber ring. The method comprises the following specific steps: (1) preparing a material sprayed on a rotating device by using a complete culture medium, and preparing a water-soluble degradable high-molecular polymer into a uniform solution by using deionized water; (2) sterilizing degradable high molecular polymer solution with high-temperature steam, and dividing into three parts; (3) respectively adding the outer-layer cell suspension and the inner-layer cell suspension into the two sterilized materials, and uniformly stirring; (4) and (3) respectively pumping the three materials by using three nozzles, placing the three materials on a micro pump according to the preparation sequence, starting a high-voltage power supply and the micro pump, setting corresponding parameters, and performing electric spraying to obtain the biological fiber ring. The method of the invention is simple and easy to implement, and the biological fiber ring has great practical significance for treating the herniated disk.)

生物纤维环制备方法

技术领域

本发明涉及生物纤维环制备方法，属于组织工程纤维环制备与椎间盘突出治疗领域。

背景技术

椎间盘突出易导致劳动力丧失，而切除椎间盘及植骨融合固定等治疗措施只能暂时缓解症状，术后亦复发无法根治。组织工程技术的出现为椎间盘突出的治疗提供了新的思路和方法，即制造出生物纤维环去置换那些已断裂的天然纤维环，阻止髓核脱出。

如何使制造出的生物纤维环能持续地含有蛋白多糖及胶原纤维，为保证以后天然再生纤维环的正常生理代谢活动提供所需物质，这是制造生物纤维环需要解决的关键问题。

静电纺丝技术可以成形出含细胞的纳米纤维支架，基于这一技术的优点，本发明采用该技术制备出模拟天然纤维环外、中、内三层同心圆排列的生物纤维环，该环内外层含有不同的细胞。细胞在生物纤维环上生长合成分泌蛋白多糖及胶原纤维，逐渐使外层以胶原纤维成份为主，而内层形成纤维软骨带。

发明内容

本发明的目的是针对以上问题，提供生物纤维环的制备方法，利用静电纺丝技术，着力于构建内外层含有细胞的外、中、内三层同心圆排列的生物纤维环，为治疗椎间盘突出提供更为先进的技术支持。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

生物纤维环制备方法，纤维环由可降解的高分子聚合物和细胞组成，利用静电纺丝工艺制备，包括以下步骤：

1)称取2.0-2.5克普朗尼克F-127(Pluronic F-127)材料，加入到预冷的8.0-10.0克的完全培养基中，置于4℃摇床24小时至充分溶解，再用0.22mm滤器过滤Pluronic F-127溶液，置于4℃冰箱2小时后喷洒在旋转装置上，待室温固化后备用；

2)称取1.5-2.0克聚乙烯醇(PVA)材料，在搅拌情况下缓缓加入到15-20克的去离子水中，至充分溶胀后升温至80-100℃左右加速溶解，并保温3小时制得均匀的高分子溶液，再经100℃高温蒸汽消毒，均分成三份，将其中一份装入喷头二中备用；

3)第3代新西兰大白兔的细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的一份PVA材料中，搅拌均匀得到含细胞的PVA溶液，将其装入喷头一中备用；

4)第4代新西兰大白兔的细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的一份PVA材料中，搅拌均匀得到含细胞的PVA溶液，将其装入喷头三中备用；

5)喷头一上加载6-8kV的直流电压，喷头与旋转装置的距离为6-8mm，负极加载在接收平台上。将材料以150-180μL/min由微量泵提供的稳定流量，进行连续挤出，旋转装置以800r/min速度旋转，纺丝1-3个小时，纳米纤维包裹着已固化的Pluronic F-127材料，完成生物纤维环内层制备；

6)喷头二上加载10-13kV的直流电压，喷头与旋转装置的距离为15-20mm，负极加载在接收平台上。将材料以350-380μL/min由微量泵提供的稳定流量，进行连续挤出，旋转装置以1000r/min速度旋转，纺丝1-2个小时，完成生物纤维环中间层制备；

7)喷头三上加载6-8kV的直流电压，喷头与旋转装置的距离为6-8mm，负极加载在接收平台上。将材料以150-180μL/min由微量泵提供的稳定流量，进行连续挤出，旋转装置以800r/min速度旋转，纺丝1-3个小时，完成生物纤维环外层制备；

8)旋转装置放置在4℃冰箱1-2小时，Pluronic F-127材料溶化，取出从旋转装置上脱落的生物纤维环。

所述步骤3)的细胞为软骨细胞或骨细胞。

所述步骤4)的细胞为肌细胞或脂肪干细胞。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

本发明的生物纤维环呈同心圆形状，具有三层结构；中间层和内外层的纤维粗细不一样，外层和内层分别由不同的细胞和可生物降解材料制备；生物纤维环整体结构模拟了天然纤维环，缩短了椎间盘突出的治疗时间。该方法具备工艺简单、可控性好及效率高等优点。

附图说明

图1为生物纤维环制备系统示意图。

图2为生物纤维环的静电纺丝工艺示意图。

图3为生物纤维环结构体示意图。

具体实施方式

本发明的优选实施案例，结合附图详述如下：

如图1所示为制备生物纤维环系统示意图。其中：计算机控制系统1连接控制器2，控制器2连接高压电源6和微量泵3，微量泵3连接喷头4，高压电源6的正极加载在喷头4的针头上，负极加载在接收平台5上，旋转装置7安装在平台5上。

实施例1

生物纤维环制备方法，生物纤维环工艺制备，包括以下步骤：

1)称取2.5克普朗尼克F-127(Pluronic F-127)材料，加入到预冷的10.0克的完全培养基中，置于4℃摇床24小时至充分溶解，再用0.22mm滤器过滤Pluronic F-127溶液，置于4℃冰箱2小时后喷洒在旋转装置上，待室温固化后备用；

2)称取2.0克聚乙烯醇(PVA)材料，在搅拌情况下缓缓加入到20.0克的去离子水中，至充分溶胀后升温至100℃左右加速溶解，并保温3小时制得均匀的高分子溶液，再经100℃高温蒸汽消毒，均分成三份，将其中一份装入喷头二中备用；

3)第3代新西兰大白兔的软骨细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的一份PVA材料中，搅拌均匀得到含细胞的PVA溶液，将其装入喷头一中备用；

4)第4代新西兰大白兔的肌细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后收集在50mL离心管，1000r/min离心5min，弃上清液，将细胞悬液移至消毒后的一份PVA材料中，搅拌均匀得到含细胞的PVA溶液，将其装入喷头三中备用；

5)喷头一上加载6kV的直流电压，喷头与旋转装置的距离为6mm，负极加载在接收平台上。将材料以150μL/min由微量泵提供的稳定流量，进行连续挤出，旋转装置以800r/min速度旋转，纺丝1个小时，纳米纤维包裹着已固化的Pluronic F-127材料，完成生物纤维环内层制备；

6)喷头二上加载13kV的直流电压，喷头与旋转装置的距离为20mm，负极加载在接收平台上。将材料以380μL/min由微量泵提供的稳定流量，进行连续挤出，旋转装置以1000r/min速度旋转，纺丝1个小时，完成生物纤维环中间层制备；

7)喷头三上加载6kV的直流电压，喷头与旋转装置的距离为6mm，负极加载在接收平台上。将材料以150μL/min由微量泵提供的稳定流量，进行连续挤出，旋转装置以800r/min速度旋转，纺丝1个小时，完成生物纤维环外层制备；

8)旋转装置放置在4℃冰箱1小时，Pluronic F-127材料溶化，取出从旋转装置上脱落的生物纤维环。

实施例2

本实例与实例1基本相同，不同之处在于：步骤3)所采用的细胞为骨细胞、步骤4)所采用的细胞为脂肪干细胞。