一种抑制蚊子生殖的试剂及其应用
阅读说明：本技术 一种抑制蚊子生殖的试剂及其应用 (Reagent for inhibiting mosquito reproduction and application thereof ) 是由 沈波 厉茜茜 张�成 孙艳 周丹 马磊 朱昌亮 于 2021-05-11 设计创作，主要内容包括：一种抑制蚊子生殖的试剂及其应用,属于蚊媒病防治技术领域,尤其涉及MG132在制备抑制蚊子生殖试剂中的应用。本发明利用MG132能够显著抑制蚊的生殖力,且这种抑制作用能够持续到子二代。(A reagent for inhibiting mosquito reproduction and an application thereof belong to the technical field of mosquito-borne disease control, and particularly relate to an application of MG132 in preparation of a reagent for inhibiting mosquito reproduction. The invention can obviously inhibit the fertility of mosquitoes by using MG132, and the inhibition effect can last to the second generation.)
技术领域
本发明属于蚊媒病防治
技术领域
，具体涉及一种抑制蚊子生殖的试剂及其应用。
背景技术
蚊子作为一种害虫，具有吸血习性，吸血时蚊子可将疟原虫、丝状蚴、乙脑病毒等涎液注入人体内，使人感染发病。因此，蚊子不但叮人吸血影响睡眠，还会传播乙型脑炎、疟疾、登革热、血丝虫病等。目前，控制蚊媒仍是蚊媒病防制的主要手段，主要的防蚊手段分如下几种：1、环境治理，目的是清除蚊虫孳生场所。治理方法可以分为a.环境改造：为了防止、清除和减少蚊虫孳生和栖息而对土地、水体或植被进行的改造。包括排除积水、填地堵洞、铲除杂草等措施。b.环境处理：有计划地改变水生环境，使之不利于蚊虫孳生。疏通沟渠，变静水为流水等。c.减少人蚊接触：通过改善人们居住条件和习惯，减少人类和蚊虫的接触。房屋安装纱门、纱窗，使用蚊帐，用药物处理蚊帐。野外执勤作业，可戴防蚊帽或驱虫网。2、化学防治，具有见效快、使用方便，适合大规模应用等优点，是目前蚊虫防治重要的手段之一，主要分为a．幼虫防治：可在水体中加入有机磷杀虫剂及其缓释剂，常用的有双硫磷、倍硫磷。b．成蚊防治：（1）空间喷洒：使用杀虫剂气溶胶杀灭飞行和栖息的昆虫。如使用气雾罐、超低容量喷雾、热烟雾剂等。（2）滞留喷洒：使用具有一定持效作用的杀虫剂，喷洒在室内蚊虫栖息的表面，使用的杀虫剂有高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯等。3、生物防治：成本高，较难大规模实施。由于化学杀虫剂的长期大量使用，导致蚊杀虫剂抗性的发生和发展，因此，基于直接抑制雌蚊繁殖势能的新型蚊种群抑制方法，对于控制蚊种群数量具有更重要的实际应用价值。
MG132 (Proteasome抑制剂)是一种有效的，可逆的，可透过细胞的蛋白酶体抑制剂（Ki=4 nM）。N-苄氧基羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨酸MG132属于合成肽醛类抑制剂。它通过26S复合物降低哺乳动物细胞和酵母可渗透菌株中泛素-共轭蛋白的降解，而不影响其ATP酶或肽酶活性。MG132激活c-Jun N-末端激酶（JNK1），其启动细胞凋亡。
MG132还以3μM的IC 50抑制NF-κB活化，并阻断β-分泌酶活性。在具有约50μMMG132的IC 50的HeLa细胞中观察到剂量依赖性的细胞生长抑制24小时。MG132通过诱导细胞周期停滞以及引发细胞凋亡来抑制HeLa细胞的生长。MG132以时间和剂量依赖性方式抑制C6神经胶质瘤细胞增殖（24小时时IC 50值为18.5μM）。MG132（18.5μM）在3小时时抑制蛋白酶体活性约70％。
MG132通过下调抗细胞凋亡蛋白Bcl-2和XIAP，促凋亡蛋白Bax和半胱天冬酶-3的上调以及切割的C端85kDa PARP的产生来诱导细胞凋亡。MG132还会使活性氧增加5倍以上。IC 50MG132对孵育48小时后对HeLa，CaSki和C33A宫颈癌细胞存活率的影响分别为2.1,3.2和5.2μM。使用sc异种移植模型检查MG132对宫颈癌的体内抗肿瘤活性。
使用以下方案以1mg/kg注射MG132：对于携带HeLa肿瘤的小鼠，第1,4,8,12,15,18,23和26天。与对照相比，MG132的生长抑制率为49％。MG132（ip，0.1 mg/kg/day）通过调节ERK1/2和JNK1信号通路，减轻压力超负荷引起的心脏肥大，改善腹主动脉条带（AAB）大鼠的心脏功能。
发明内容
解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种抑制蚊子生殖的试剂及其应用。
技术方案：MG132在制备抑制蚊子生殖试剂中的应用。
优选的，上述MG132的工作浓度为4 μM。
一种抑制蚊子生殖试剂，有效成分含有MG132。
有益效果：本发明利用MG132能够显著抑制蚊的生殖力，且这种抑制作用能够持续到子二代。
附图说明
图1：MG132对亲代雌蚊生殖作用的影响。A：MG132对亲代雌蚊产卵量的影响；B：MG132对亲代雌蚊幼虫数的影响；C：MG132对卵孵化率的影响（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001）。
图2：MG132对子一代雌蚊生殖作用的影响。A：MG132对子一代雌蚊产卵量的影响；B：MG132对子一代雌蚊幼虫数的影响；C：MG132对卵孵化率的影响（N=20，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001）。
图3：MG132对子二代雌蚊生殖作用的影响。A：MG132对子二代雌蚊产卵量的影响。B：MG132对子二代雌蚊幼虫数的影响。C：MG132对卵孵化率的影响（N=20，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001）。
图4：MG132对子三代雌蚊生殖作用的影响。 A：MG132对子三代雌蚊产卵量的影响。B：MG132对子三代雌蚊幼虫数的影响；C：MG132对卵孵化率的影响（N=20，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0001）。
图5：亲代MG132处理组吸血未产卵雌蚊卵巢解剖图。A：正常雌蚊72 h PBM卵巢解剖图；B-G：亲代MG132处理组吸血5 d未产卵雌蚊卵巢解剖图（放大倍数3.2x10）。
图6：MG132处理组亲代及子代雌蚊卵巢形态比例。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
材料与方法
MG132对蚊生殖力的影响
1.MG132母液配制
称取 47.5 mg MG132 (Synonyms: Z-Leu-Leu-Leu-al; MG132) 粉末（MCE，HY-13259），溶于 1 mL DMSO（MCE，HY-129770）中，使其充分混匀，配制成100 mM MG132母液。
2.测定MG132对蚊生殖力的影响
取6 μL上述MG132母液，加入 150 mL ddH2O，配制成4 μM工作液。用该工作液处理3龄末~4龄初幼虫，直至羽化3天，以等浓度的 DMSO和 ddH2O 处理作为对照。每组处理 500只幼虫，并设立3个生物学重复。
羽化3天，雌雄蚊充分交配后，给予血食，吸血后72 h（72 h PBM）观察各组雌蚊产卵量。在OLMPUS相差倒置显微镜下计数每个卵筏中的卵个数（N=20），将卵筏放回实验室正常饲养，待幼虫孵化，计数1龄幼虫，并计算孵化率（N=20）。
此外，解剖雌蚊 72 h PBM 雌蚊卵巢，在OLMPUS相差倒置显微镜下观察各组卵巢形态的改变。
结果
MG132对蚊生殖力的影响
1.MG132处理后雌蚊产卵量、 幼虫数及孵化率的变化
在亲代中，DMSO对照组蚊产卵量为140.1± 9.42，幼虫数为119± 11.64，孵化率为84.91%± 4.85%，而MG132处理组蚊产卵量仅为81.25± 46.28，幼虫数为65.29±38.27，孵化率为63.48%± 34.85%， MG132处理组产卵量，幼虫数和孵化率明显低于对照组（图1，P<0.0001、 P<0.0001、 P=0.0016）。为了研究这种抑制作用的持续性，我们随后连续观察处理蚊至子三代，发现DMSO对照组子代产卵量、幼虫数和孵化率与对照组亲代无明显差异，而MG132处理后的子一代产卵量、幼虫数、孵化率分别为104.48± 42.58、87.52±27.62、73.06%± 27.62%；MG132处理后的子二代产卵量、幼虫数、孵化率分别为107.72±33.49、97.32± 32.07、86.31%± 17.95%；MG132处理后的子三代产卵量、幼虫数、孵化率分别为166.95± 20.95、146.75± 21.41、87.66%± 4.00%。 提示MG132处理后的子一代产卵量、幼虫数、孵化率显著下降（图1， P<0.0001， P<0.0001， P=0.0048）。
MG132处理后的子二代产卵量、幼虫数明显降低，而孵化率无差异（图3，P<0.0001，P<0.0001，P=0.2267）。
MG132处理后的子三代产卵量、幼虫数、孵化率指标均无明显差异（图4，P<0.0001，P<0.0001，P=0.0048）。提示MG132抑制蛋白酶体活性后，能够显著抑制蚊的生殖力，且这种抑制作用能够持续到子二代。在亲代MG132处理组和子一代中，分别观察到6只和3只吸血5天的雌蚊仍未产卵。解剖亲代雌蚊卵巢，发现有1只卵巢体积明显减小，5只卵巢发育延迟，卵泡未发育（图5）。提示MG132处理后对蚊生殖力的影响可能是通过影响卵巢发育实现的。
我们进一步观察MG132处理后卵巢形态的变化，亲代、子一代、子二代和子三代MG132处理组和对照组，各组随机收集20只 72 h PBM的雌蚊卵巢进行解剖。根据卵巢不同形态，将卵巢分为四组：形态正常组、形态稀疏组、体积变小组和发育延迟组。结果显示，亲代、子一代、子二代卵巢形态正常比例分别为10%、15.8%、50%，随着MG132作用的减弱，MG132处理组雌蚊卵巢形态正常比例逐渐增加。处理后子三代卵巢形态已恢复正常（图6）。
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